石蒜屬植物組織培養(yǎng)及其植物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用的研究進(jìn)展

殷麗青,邵雅東,李青竹,張永春,孫 翊,蔡友銘?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,上海201403;2長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,荊州434025)

石蒜是石蒜科石蒜屬球根花卉,是優(yōu)良的觀賞和藥用植物,有時(shí)石蒜也會(huì)特指其中一個(gè)最為常見的種——紅花石蒜(Lycoris radiata)。我國作為石蒜的主要產(chǎn)地,已有1 500多年的石蒜栽培歷史,在全球已發(fā)現(xiàn)的20多種石蒜屬植物中,有12種為我國特有[1-4]。

石蒜是一種重要的園林植物,花型優(yōu)美,花色有紅色、白色、黃色及復(fù)色,具耐濕、耐旱、耐陰等優(yōu)良特性。此外,石蒜鱗莖中含有大量的石蒜堿,具有抗菌、保護(hù)心血管、抗病毒和抑制腫瘤的效應(yīng),而石蒜鱗莖中的加蘭他敏對阿爾茲海默癥和小兒麻痹癥具有特殊的療效[5-6],因此藥物市場對石蒜成株的需求日益增加。

在自然栽培中,石蒜依靠鱗莖分球和種子進(jìn)行繁殖,自然繁殖能力弱,石蒜野外資源的采集已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求[1]。組織培養(yǎng)技術(shù)是解決植物繁殖困難最為有效的方法之一。有關(guān)石蒜屬植物的組織培養(yǎng)研究國內(nèi)外已有一些報(bào)道,并取得了一定的進(jìn)展,但主要集中在石蒜(即紅花石蒜)[7-8]和忽地笑[9-10]這2個(gè)種,在其他石蒜種如換錦花[11]、乳白石蒜[12-13]、中國石蒜[14-15]、長筒石蒜[16-17]等也有少量報(bào)道,然而多種石蒜屬植物的組織培養(yǎng)快速繁殖還存在著一定的困難。本文對石蒜屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行回顧與總結(jié),重點(diǎn)探討植物生長調(diào)節(jié)劑對石蒜屬植物組織培養(yǎng)不同階段的作用及影響,對存在的問題及解決方法進(jìn)行分析,并對其組織培養(yǎng)研究的前景和發(fā)展方向提出展望,旨在為石蒜屬植物的組織培養(yǎng)研究、分子育種工程及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

1 石蒜屬植物組織培養(yǎng)研究概況

我國石蒜屬植物組織培養(yǎng)成功獲得再生植株的研究最早報(bào)道于1986年,魯雪華等[18]以忽地笑(Lycoris aurea)未成熟的種胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)得到再生植株。數(shù)年后,董慶華等[19]以紅花石蒜的鱗芽進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得成功;此后,姚麗娟等[11]、郭兆武等[20]報(bào)道了不同種石蒜的組織培養(yǎng),比較了不同外植體及植物生長調(diào)節(jié)劑的配比對石蒜組培的影響。在前人的努力下,石蒜屬植物組織培養(yǎng)研究獲得了較大的進(jìn)展(表1)。

表1 石蒜屬植物組織培養(yǎng)名錄Table 1 List of tissue culture of Lycoris

(續(xù)表1)

2 基因型和外植體對石蒜屬植物組織培養(yǎng)的影響

基因型是影響石蒜屬植物組培成功與否的重要因素,從已有報(bào)道分析,紅花石蒜和忽地笑(因開黃花,一些文獻(xiàn)中稱其黃花石蒜)組培相對容易,已有較多成功的報(bào)道[9,27]。此外,中國石蒜、乳白石蒜、換錦花、長筒石蒜和稻草石蒜等也有少量組培研究初步成功的報(bào)道。石蒜屬植物組培一般選用鱗莖或雙鱗片作為外植體,也有一些研究使用花器官、葉片或種胚作為外植體。外植體的選擇對誘導(dǎo)效果具有顯著的影響,也是提高誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因素之一,外植體的類型、取材部位、生理狀況及生長時(shí)期都會(huì)影響誘導(dǎo)的成功率。有報(bào)道顯示,石蒜屬植物種胚培養(yǎng)效果最好[15,29,34],中國石蒜、換錦花種胚的培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于鱗莖和葉片組織,其不定芽誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%。但是,石蒜屬植物的種胚來源有限,鱗莖或鱗片取材相對容易,使用其鱗莖或鱗片進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)也可獲得良好效果[13,16,28]。其次,石蒜屬植物葉片也是不錯(cuò)的外植體選擇[17,29],相對于其他外植體而言,葉片取材方便,消毒容易,幼嫩組織具有較強(qiáng)的分生能力,比成熟組織更加適合作為外植體。時(shí)劍等[29]用幼嫩葉段進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)獲得了良好的效果,后續(xù)培養(yǎng)還獲得了不定芽和小鱗莖。此外,花絲、花藥、雌蕊、花軸、花被、花梗和子房等花器官也可作為外植體。陳菁玨[24]以花梗作外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得88.89%的愈傷組織誘導(dǎo)率;穆紅梅等[14]以花軸為外植體進(jìn)行小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)率接近90%?？梢?石蒜屬植物的花軸也是其組織培養(yǎng)的優(yōu)選外植體之一。總之,在石蒜屬植物組培中,外植體選擇除常用的鱗莖或鱗片外,一些幼嫩的葉片和花器官也可作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),以葉片作外植體的誘導(dǎo)快繁更具有應(yīng)用價(jià)值,其不損傷鱗莖,在珍稀種質(zhì)保存與擴(kuò)繁中具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3 植物生長調(diào)節(jié)劑對石蒜屬植物組織培養(yǎng)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中含量極低,但對植物組培成功與否至關(guān)重要,其對植物生長、發(fā)育具有顯著作用,可直接影響外植體的分化和再生。石蒜屬植物組織培養(yǎng)過程中,不同階段對植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度需求不同。

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對石蒜屬植物愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)愈傷組織最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑是2,4-D。前人研究表明[15,35-36],以黃花石蒜種胚為外植體,培養(yǎng)于MS+2,4-D 2.0 mg∕L培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)愈傷組織效果良好,誘導(dǎo)率達(dá)80%;如果以鱗莖為外植體,使用相同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),其誘導(dǎo)率僅為66.6%,這可能是由于鱗莖對單一施用2,4-D的響應(yīng)較弱造成的。因此,以鱗莖為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí),需要不同植物生長調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用才能獲得較好的效果。研究表明,6-BA(0.5—5.0 mg∕L)和2,4-D(0.5—2.0 mg∕L)聯(lián)合使用對鱗莖的誘導(dǎo)效果較好,中國石蒜的雙鱗片(帶基盤)誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg∕L+2,4-D 2.0 mg∕L,愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)78.66%,而乳白石蒜采用前述相同材料誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0 mg∕L+2,4-D 2.0 mg∕L,誘導(dǎo)率達(dá)75.03%[13]。周建輝等[23]以紅花石蒜鱗片誘導(dǎo)愈傷組織,不同濃度的6-BA和2,4-D聯(lián)合使用均能誘導(dǎo)出愈傷組織,而MS+6-BA 1 mg∕L+2,4-D 1 mg∕L聯(lián)合使用最佳。對比培養(yǎng)時(shí)間,使用MS+2,4-D 2.0 mg∕L培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后可進(jìn)行統(tǒng)計(jì),而6-BA(0.5—5.0 mg∕L)和2,4-D(0.5—2.0 mg∕L)聯(lián)合使用培養(yǎng)40—45 d可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。筆者分析認(rèn)為,隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移,石蒜愈傷組織誘導(dǎo)率會(huì)有所提高,但后期(培養(yǎng)1個(gè)月以后)形成的愈傷組織質(zhì)量差于前期(培養(yǎng)1個(gè)月內(nèi))。目前,未見相同植物生長調(diào)節(jié)劑條件下,進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間的對比試驗(yàn)。總體上說,不同植物生長調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用比單一植物生長調(diào)節(jié)劑的使用效果更好。6-BA和2,4-D的復(fù)合效應(yīng)對不同的外植體誘導(dǎo)愈傷組織也具有較大的差異。研究表明,6-BA和2,4-D聯(lián)合使用誘導(dǎo)率以種胚最高,其在MS+2,4-D 1.0 mg∕L+6-BA 1.0 mg∕L培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后,愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)82.4%;鱗莖次之,為26.1%;而葉片在最適的MS+2,4-D 2.0 mg∕L+6-BA 1.0 mg∕L培養(yǎng)基上最高誘導(dǎo)率僅為5.0%[37]。此外,換錦花和忽地笑的花梗、子房、花被、花絲和雌蕊分別接種在MS+6-BA+2,4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周后,均可以誘導(dǎo)愈傷組織,換錦花愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的是MS+6-BA 1 mg∕L+2,4-D 1 mg∕L培養(yǎng)基,其中花梗作外植體效果最好,愈傷組織誘導(dǎo)率最高為64.7%;忽地笑愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的為MS+6-BA 2 mg∕L+2,4-D 2 mg∕L培養(yǎng)基,4種外植體(除雌蕊外)均可以誘導(dǎo)出愈傷組織,其中花梗和子房的愈傷組織誘導(dǎo)率大于60.0%[38]?？梢?6-BA和2,4-D的聯(lián)合使用并不適用于所有外植體。因此,其他外源激素也成為研究重點(diǎn),將苯基脲類衍生物(TDZ)應(yīng)用于石蒜屬植物的組織培養(yǎng),以葉片為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率[17],但愈傷組織非胚性,質(zhì)量較差,不能獲得小鱗莖或不定芽。在石蒜屬植物的組織培養(yǎng)中,僅有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率是不夠的,應(yīng)該更關(guān)注愈傷組織的質(zhì)量,其中胚性愈傷組織的比例和顆粒性對其分化再生植株具有較大的影響。根據(jù)筆者多年經(jīng)驗(yàn),在植物組織培養(yǎng)中,獲得良好的愈傷組織后應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接分化,否則會(huì)影響其質(zhì)量,失去胚性而影響分化率。在具體研究中,可以通過植物生長調(diào)節(jié)劑種類濃度及配比的篩選、增加微量元素含量、提高培養(yǎng)基糖濃度等途徑改善愈傷組織狀態(tài),提高胚性愈傷組織的比例和顆粒性,從而提高植株再生率[39]。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對石蒜屬植物不定芽或小鱗莖形成的影響

石蒜屬植物不定芽的形成主要有2種途徑,即外植體直接誘導(dǎo)產(chǎn)生或通過愈傷組織分化形成。不定芽誘導(dǎo)主要以MS作基本培養(yǎng)基,常見的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA和NAA,6-BA常用質(zhì)量濃度范圍為1.0—5.0 mg∕L,NAA常用質(zhì)量濃度范圍是0.1—2.0 mg∕L。不同種的石蒜對植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)具有較大的差異,姚麗娟等[11]研究表明,紅花石蒜、忽地笑、換錦花3個(gè)種誘導(dǎo)不定芽的最適植物生長調(diào)節(jié)劑組合分別是6-BA 3 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L、6-BA 6 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L和6-BA 5 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L,不定芽誘導(dǎo)率分別達(dá)78.0%、76.9%和55.6%,其中紅花石蒜所需6-BA濃度最低,而不定芽誘導(dǎo)率最高。楊曦[13]以中國石蒜與乳白石蒜帶基盤鱗片為外植體進(jìn)行相關(guān)研究認(rèn)為,中國石蒜與乳白石蒜誘導(dǎo)不定芽的最適植物生長調(diào)節(jié)劑組合分別是6-BA 1.0 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L和6-BA 1.0 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L,培養(yǎng)45 d后,其不定芽誘導(dǎo)率分別達(dá)88.3%和96.7%。劉志高等[12]以乳白石蒜鱗莖為材料進(jìn)行不定芽誘導(dǎo),培養(yǎng)50 d后,其結(jié)果與楊曦[13]相似,最高不定芽誘導(dǎo)率達(dá)100%。由此可見,在培養(yǎng)時(shí)間較一致時(shí),不定芽誘導(dǎo)所需植物生長調(diào)節(jié)劑濃度和配比受基因型影響較大。此外,外植體種類不同,所需的植物生長調(diào)節(jié)劑最適濃度與配比也不同,一般認(rèn)為,幼嫩組織對于外源激素的敏感性強(qiáng)于成熟組織。郭兆武等[20]以黃花石蒜為材料,以不同外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn),不同外植體對植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的響應(yīng)不同,其最適濃度的誘導(dǎo)率也具有一定差異,其中帶底盤雙內(nèi)層鱗片、帶底盤雙中層鱗片的培養(yǎng)效果在MS+NAA 5.0 mg∕L+6-BA 10.0 mg∕L和MS+NAA 10.0 mg∕L+6-BA 5.0 mg∕L兩種培養(yǎng)基上較其他外植體好。穆紅梅等[14]等報(bào)道,以中國石蒜的花軸為外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)時(shí),MS+6-BA 5.0—7.0 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高,近90%。除常用的6-BA和NAA之外,還有少量報(bào)道采用其他植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)石蒜屬植物不定芽的發(fā)生,如2,4-D、IAA及KT。有學(xué)者以紅花石蒜的鱗莖為外植體,在MS+IAA 0.1 mg∕L+6-BA 10.0 mg∕L+KT 0.1 mg∕L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生,培養(yǎng)6周后,其誘導(dǎo)增殖率達(dá)3.88[8]。紅花石蒜通過愈傷組織分化不定芽,在MS+6-BA 1.0 mg∕L+2,4-D 1.0 mg∕L培養(yǎng)基上效果最好,不定芽分化率為76.2%[37]?？傊?石蒜屬植物不定芽培養(yǎng)適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比因基因型和外植體種類不同而異,一般選用6-BA和NAA聯(lián)合應(yīng)用。也有報(bào)道認(rèn)為,外植體可直接誘導(dǎo)獲得小鱗莖,如稻草石蒜在MS+6-BA 5.0 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L上誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好,小鱗莖誘導(dǎo)率為75%[31]。

3.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對石蒜屬植物繼代增殖的影響

增殖系數(shù)(增殖率)是體現(xiàn)植物組織培養(yǎng)效率的最關(guān)鍵指標(biāo)之一,在植物繼代增殖過程中,在一定濃度范圍內(nèi),其增殖系數(shù)隨著植物生長調(diào)節(jié)劑濃度增加而提高,但濃度過高容易形成玻璃苗或發(fā)生變異。石蒜屬植物繼代增殖培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基為MS,植物生長調(diào)節(jié)劑組合是6-BA+NAA或6-BA+2,4-D,也有少數(shù)報(bào)道用其他植物生長調(diào)節(jié)劑如KT、IAA和TDZ。前人研究表明,NAA和2,4-D的濃度差異會(huì)顯著影響球根類花卉組織培養(yǎng)的效果[40]。石蒜和中國石蒜以帶基盤雙鱗片為外植體誘導(dǎo)的小鱗莖,增殖培養(yǎng)的最適植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 0.5 mg∕L+2,4-D 1.0 mg∕L,增殖率分別可達(dá)543%和515%[34];紅花石蒜以鱗莖誘導(dǎo)的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 8.0 mg∕L+NAA 2.0 mg∕L,增殖率高達(dá)550%[24];香石蒜不定芽增殖的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 5.0 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L,增殖系數(shù)為3.3[32]。綜上,NAA與2,4-D在石蒜增殖培養(yǎng)時(shí),其效應(yīng)并沒有明顯的差異。此外,KT、IAA和TDZ在石蒜屬植物增殖培養(yǎng)方面也有應(yīng)用,裸體石蒜鱗莖增殖的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑是6-BA 1.5 mg∕L+IAA 1.5 mg∕L,增殖系數(shù)為3.0[30]。長筒石蒜的不定芽培養(yǎng)于含6-BA 5.0 mg∕L+NAA 0.1 mg∕L和6-BA 5.0 mg∕L+ZT 0.5 mg∕L的MS培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng),增殖率分別高達(dá)480%和454%[16]。馬建軍[41]研究發(fā)現(xiàn),在含NAA 1 mg∕L的MS培養(yǎng)基上,添加0.5—2.0 mg∕L的TDZ進(jìn)行石蒜和中國石蒜鱗莖的增殖培養(yǎng),鱗莖增殖系數(shù)隨著TDZ濃度的提高而提高,石蒜最佳增殖培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合是6-BA 3.0 mg∕L+TDZ 0.5 mg∕L+NAA 1 mg∕L,中國石蒜最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 4.0 mg∕L+TDZ 0.5 mg∕L+NAA 1 mg∕L,兩者的增殖系數(shù)分別為2.69和2.77。綜上所述,石蒜屬植物增殖培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為MS,不同組織的增殖培養(yǎng)需要的生長調(diào)節(jié)劑濃度具有較大差異,復(fù)合應(yīng)用植物生長調(diào)節(jié)劑的效果優(yōu)于單一使用,而使用TDZ等其他植物生長調(diào)節(jié)劑與6-BA、2,4-D和NAA相比,沒有顯著優(yōu)勢。

3.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對石蒜屬植物生根培養(yǎng)的影響

已有研究顯示,石蒜屬植物的生根培養(yǎng)一般以MS或1∕2MS為基本培養(yǎng)基,應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑為NAA或IBA,也有兩者聯(lián)合應(yīng)用,還有復(fù)合應(yīng)用NAA或IBA添加低濃度6-BA的。前人研究表明[11,25],紅花石蒜的小鱗莖或不定芽在含有NAA 0.5—2.0 mg∕L的培養(yǎng)基上生根率較高,根多且粗壯。朱景存等[22]和何樹蘭等[8]分別報(bào)道,在含適量NAA(0.8—1.0 mg∕L)的MS培養(yǎng)基中添加6-BA 0.5 mg∕L對紅花石蒜不定芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)可獲得較好的生根效果;乳白石蒜小鱗莖在含6-BA 1.0 mg∕L+NAA 2.0 mg∕L的MS培養(yǎng)基上能形成發(fā)達(dá)根系[12],表明外源激素的聯(lián)合使用可以有效增加紅花石蒜的生根率。陳娜等[42]以MS為基本培養(yǎng)基,比較了IBA和NAA聯(lián)合應(yīng)用于石蒜小鱗莖誘導(dǎo)生根的效果,結(jié)果顯示NAA 0.5 mg∕L+IBA 1 mg∕L比NAA 0.5 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L組合生根率高,且不定根生長狀態(tài)較好,與NAA同時(shí)使用較高濃度的IBA會(huì)降低石蒜小鱗莖根系誘導(dǎo)率,表明石蒜類植物對于生長素類物質(zhì)的聯(lián)合使用較為敏感,需要控制生長素類用量。石蒜屬植物對NAA的響應(yīng)一般高于IBA,使用的NAA濃度一般較低便可誘導(dǎo)生根。朱錦等[7]比較了相同培養(yǎng)時(shí)間下(2—4周)NAA和IBA對石蒜生根的影響,發(fā)現(xiàn)NAA比IBA的誘導(dǎo)生根效果更為顯著,低濃度的IBA對石蒜的生根誘導(dǎo)較差,而小鱗莖對NAA的濃度要求不嚴(yán)格。黃花石蒜的小鱗莖在MS+IBA 2.0 mg∕L培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)后,其根系生長健壯,質(zhì)地較好[10],而野生石蒜不定芽使用MS+NAA 0.5 mg∕L進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí),生根率達(dá)92%,根多且粗壯[33]。此外,楊曦[13]以中國石蒜和乳白石蒜為材料,比較了KT和6-BA與NAA聯(lián)合應(yīng)用于生根的效果,發(fā)現(xiàn)小鱗莖在含KT 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L MS培養(yǎng)基上的生根效果優(yōu)于6-BA 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L培養(yǎng)基,具體表現(xiàn)為生根時(shí)間短、生根多、根系健壯?？傊?石蒜屬植物可利用MS或1∕2MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng),生長調(diào)節(jié)劑使用質(zhì)量濃度以0.5—2.0 mg∕L為多。較低質(zhì)量濃度(0.5 mg∕L)的細(xì)胞分裂素類(KT或6-BA)與生長素類(NAA)聯(lián)合應(yīng)用也可用于部分石蒜屬植物的生長及誘導(dǎo)生根,效果良好。

4 其他影響石蒜屬植物組織培養(yǎng)的因子

4.1 再生途徑

植物組織培養(yǎng)離體再生類型有器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚發(fā)生途徑兩種,石蒜屬植物的離體再生主要以器官發(fā)生較為常見。器官發(fā)生途徑又分為直接途徑和間接途徑,直接發(fā)生途徑是外植體直接誘導(dǎo)形成不定芽和不定根的過程;間接發(fā)生途徑是外植體先脫分化形成愈傷組織,愈傷組織經(jīng)過再分化形成不定芽的過程。石蒜屬植物組培的直接發(fā)生途徑是近年來的研究重點(diǎn)[27-28],由種胚或帶鱗莖盤的鱗片通過直接發(fā)生途徑比間接途徑形成不定芽或小鱗莖更高效,且不容易產(chǎn)生變異。

4.2 預(yù)處理

污染是組織培養(yǎng)中常見的問題,鱗莖是石蒜屬植物組織培養(yǎng)的主要外植體之一,其自帶病菌多而雜,是造成污染的主要原因之一,在消毒前應(yīng)徹底清洗后再流水沖洗。組織培養(yǎng)中常用的外植體消毒劑主要有酒精、升汞、過氧化氫和次氯酸鈉等。0.1%的升汞滅菌效果最好,且與吐溫吸附劑聯(lián)合使用效果更佳,然而升汞殺傷力強(qiáng),易造成植株死亡,需要根據(jù)外植體幼嫩程度和帶菌情況把握消毒時(shí)間。使用熱處理和低溫冷藏對外植體進(jìn)行預(yù)處理對減少或控制病菌也具有一定效果[24]。此外,在接種前將球莖放入冰箱冷藏,也有利于提高外植體的分化能力,提高成活率[43]。

4.3 培養(yǎng)條件

石蒜屬植物組培一般采用1∕2MS或MS為基本培養(yǎng)基,pH 5.3—5.8,添加3%蔗糖和0.7%瓊脂進(jìn)行培養(yǎng)。不同的蔗糖濃度對石蒜屬植物組織培養(yǎng)的效果也有一定影響。姚麗娟等[11]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)蔗糖濃度為3%—6%時(shí),紅花石蒜小鱗莖質(zhì)量隨蔗糖濃度的提高而增加,在蔗糖濃度為6%時(shí),獲得最高倍數(shù)的生長量,繼續(xù)提高蔗糖濃度小鱗莖質(zhì)量逐漸下降。除蔗糖外,其他有機(jī)成分也具有十分重要的研究價(jià)值,在培養(yǎng)基中附加硅藻土和酵母粉對黃花石蒜的出芽具有促進(jìn)作用,而加入土豆、香蕉、水解酪蛋白和活性炭后出現(xiàn)抑制作用,其中活性炭的抑制作用較為顯著[27],但在生根培養(yǎng)基中加入活性炭,有利于促進(jìn)小鱗莖生根[21],這可能與活性炭會(huì)吸附部分營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)劑,降低了培養(yǎng)基的外源激素水平有關(guān)。此外,光照條件對石蒜屬植物不定芽的形成也有一定調(diào)節(jié)作用。呂玉華等[27]研究發(fā)現(xiàn),紅花石蒜在800—1 200 lx光照條件下培養(yǎng)16 h比24 h全黑暗條件下出芽率更高,且出芽較早;但是光照下的外植體極易褐變,而采用暗培養(yǎng)可有效降低褐變率[29]。此外,溫度也是影響石蒜屬植物組培效率的因子之一,石蒜屬植物常規(guī)的組織培養(yǎng)適宜溫度為25℃左右,目前未見不同培養(yǎng)溫度對石蒜屬植物組織培養(yǎng)影響的報(bào)道。筆者在研究中發(fā)現(xiàn),稍低溫度(22—24℃)條件下形成的愈傷組織生長速度低于稍高溫度(26—28℃)條件,但前者形成的愈傷組織質(zhì)地優(yōu)于后者。此外,有研究顯示,低溫處理有利于外植體的分化,鱗莖在4—8℃下冷藏6—8周,褐化率降低,誘導(dǎo)率提高[8,11,43]。

5 存在的問題及解決方法

5.1 外植體消毒困難,污染率高

外植體的無菌化處理是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的首要因素。石蒜屬植物組培中常用的外植體是鱗莖,采用花器官、葉片及種胚等作為外植體的研究較少[2],而鱗莖常年生長于土壤中,帶有數(shù)量較高和種類眾多的微生物,很難進(jìn)行消毒處理,尤其是霉菌類微生物很難徹底滅菌。采用以下方法可提高外植體滅菌效果,降低污染率:根據(jù)外植體的幼嫩程度選擇適宜的消毒劑種類,并依據(jù)外植體帶菌情況確定消毒劑的濃度及消毒時(shí)間;土壤中的鱗莖類外植體,開始消毒前進(jìn)行較長時(shí)間(2—4 h)的流水沖洗;在消毒劑中添加吐溫可以提高消毒劑的滲透率;培養(yǎng)基中添加抗生素有利于控制微生物的發(fā)生;將鱗莖進(jìn)行低溫冷藏可降低其攜帶的微生物的活力,提高殺菌的效果;采用多次消毒法、在植物生長旺盛期取材等措施對控制外植體污染也有一定效果[22,35]。此外,鱗莖類外植體不同部位的帶菌數(shù)量差異較大,內(nèi)層鱗片＜中層鱗片＜外層鱗片,滅菌效果也從強(qiáng)至弱;稍嫩的葉片和花器官等外植體帶菌率較低,無菌化處理相對比較容易,有利于提高外植體無菌化處理的效率。

5.2 繁殖系數(shù)低,小鱗莖生長緩慢

在石蒜屬植物組織培養(yǎng)中,還存在著繁殖系數(shù)低,小鱗莖生長緩慢的問題[44]。提高其繁殖系數(shù)和促進(jìn)小鱗莖的膨大是提高石蒜屬植物組織培養(yǎng)效率的關(guān)鍵。適當(dāng)提高培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑濃度,并將細(xì)胞分列素類與生長素類聯(lián)合使用,對提高增殖系數(shù)具有一定作用。此外,葉面噴施氯吡苯脲(CPPU)、氯化膽堿(CC)、水楊酸(SA)等植物生長調(diào)節(jié)劑,對小鱗莖膨大均有一定促進(jìn)作用[45]。在石蒜屬植物的組織培養(yǎng)中也可嘗試在培養(yǎng)基中添加上述植物生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)小鱗莖的膨大。蔗糖是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的碳源[46],適當(dāng)提高蔗糖濃度對石蒜屬植物小鱗莖膨大也有一定的促進(jìn)作用。此外,劉志高等[12]研究發(fā)現(xiàn),在乳白石蒜的小鱗莖增殖時(shí),通過適當(dāng)切割小鱗莖可以縮短培養(yǎng)周期且不影響增殖效果。

6 展望

石蒜屬植物作為一種獨(dú)特的兼園林景觀和藥用于一體的多功能花卉,其野生資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需要,種球的增殖技術(shù)是該類植物產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的關(guān)鍵。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖石蒜屬植物優(yōu)質(zhì)種苗是目前盡快滿足市場需求的有效途徑,組培技術(shù)是種質(zhì)保存(超低溫保存)、誘變育種及遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。有關(guān)石蒜屬植物的遺傳工程研究已有少量報(bào)道,虞劍平等[47]使用農(nóng)桿菌將nos基因轉(zhuǎn)入石蒜花莖幼嫩部位,并成功檢測到胭脂堿,但相關(guān)的轉(zhuǎn)基因研究未見報(bào)道,僅有部分遺傳分析和基因表達(dá)的研究[48-50]。在百合等其他球根花卉上的基因標(biāo)記分類、基因表達(dá)和獲得轉(zhuǎn)基因植株等方面已有較為深入的研究[51-52],這也是日后石蒜屬植物研究的方向之一,而建立完善的組培再生體系是石蒜屬植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)?；谑鈱僦参锟捎糜谒幬镩_發(fā)的巨大前景,加快其組織培養(yǎng)技術(shù)和工廠化育苗體系的建立,可促進(jìn)藥用植物資源的規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。今后在石蒜屬植物組培的研究中應(yīng)積極開展組培未獲成功種的探索,在外植體選擇上不局限于常見的石蒜外植體,通過改變消毒方法和培養(yǎng)條件,同時(shí)在植物生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度配比上進(jìn)行更深入的研究,以提高石蒜屬植物組培的成功率和增殖系數(shù)。通過更加深入的石蒜組培體系研究,加速石蒜屬植物組培快繁體系的建立、完善和優(yōu)化,為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。