黃桃表面污染真菌的分離與鑒定

孟佳佳,范 楷,郭文博,王建華,聶冬霞,韓 錚

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海201403)

我國是桃原產(chǎn)國,也是產(chǎn)桃大國。上海地區(qū)桃樹栽培歷史悠久,“南匯水蜜桃”、“金山蟠桃”和“奉賢黃桃”相繼被列為國家地理標志保護農(nóng)產(chǎn)品[1]。黃桃(Amygdalus persicaL.),又稱黃肉桃,屬于薔薇科桃屬,黃桃的果皮、果肉均呈金黃色至橙黃色,肉質(zhì)致密而韌,粘核者多。黃桃果實含有豐富的維生素C和大量人體所需的纖維素、胡蘿卜素、番茄黃素、番茄紅素及多種微量元素[2],具有益氣血、生津液、抗腫瘤、增強免疫力等功效,在抗癌藥物及保健品的研制上具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[3]。近年來,南方地區(qū)鮮食黃桃的消費量持續(xù)上升,促使黃桃種植面積逐年擴大[4]。

黃桃一般成熟于高溫多雨的夏季,采收、貯藏、運輸、銷售等各個過程均會造成其結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)物質(zhì)和生理品質(zhì)的變化,并且果實富含糖分及其他營養(yǎng)成分,易受到微生物的侵染,從而導(dǎo)致腐爛或腐敗,嚴重影響其商品性及經(jīng)濟價值,部分霉菌還可能產(chǎn)生真菌毒素,給消費者帶來了巨大的安全隱患[5-6]。真菌毒素是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物,可導(dǎo)致DNA損傷和細胞毒性,低濃度下即可對人和動物健康造成危害,使肝臟、腎臟和胃腸道發(fā)生病變,甚至致癌、致畸、致突變等[7-8]。據(jù)報道,在被真菌侵染的桃、櫻桃等水果中均能檢測出少量的鏈格孢菌毒素和赭曲霉毒素,且去除腐爛部位后仍可檢測到毒素的存在[9-10]。Reddy等[11]從桃等多種水果中檢測出了展青霉毒素?？梢?真菌污染在桃上的發(fā)生極其常見,但有關(guān)黃桃中污染真菌的種類及發(fā)生規(guī)律目前尚不清楚。本研究擬對上海地區(qū)黃桃樣本中的真菌進行分離鑒定,旨在明確黃桃中污染真菌的種類及污染程度,分析可能造成的毒素污染風險,為防控黃桃中真菌毒素污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(上海源葉生物科技有限公司),基因組DNA小量制備試劑盒(TIANGEN,DP305),DNA凝膠回收試劑盒(美國AXYGEN公司),LA Taq DNA聚合酶(上海桑尼生物科技有限公司)和DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 樣品采集

從上海市奉賢區(qū)、閔行區(qū)、長寧區(qū)、徐匯區(qū)和嘉定區(qū)的超市內(nèi)隨機采集生理成熟度一致、大小均勻的黃桃樣品各3份,共15份,同時從上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗站和上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院金山果樹試驗站采集黃桃樣品,各4份,共8份,合計23份黃桃樣品,每份樣品5個黃桃。樣品采集后裝入無菌塑料包裝袋中,帶回實驗室后4℃保存,并于當天進行菌株的分離。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離

對采集的黃桃樣品進行預(yù)處理:用75%的乙醇漂洗2—3 min,無菌水沖洗2—3次,用滅菌濾紙吸干多余水分,置于無菌濾紙上晾干。用無菌刀切取黃桃果實健康部位與病斑交界處的新鮮組織(0.5 cm×0.5 cm)置于PDA培養(yǎng)基上,28℃黑暗培養(yǎng)2—3 d后,采用尖端菌絲挑取法,挑取形態(tài)不同的菌絲或菌落,將其移接到新鮮PDA培養(yǎng)基上進行純化,之后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 真菌的形態(tài)鑒定

用滅菌牙簽挑取純化后菌株的少量菌絲于PDA平板中央,于28℃真菌培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5—10 d后觀察菌落的培養(yǎng)性狀和顯微特征。在載玻片中央滴加1—2滴無菌水,用滅菌牙簽挑取少量真菌菌絲,放入載玻片上的無菌水中,使菌絲充分浸入,用牙簽讓菌絲分開,避免菌絲堆疊。加蓋潔凈的蓋玻片,輕輕按壓制成壓片,于顯微鏡(Eclipse E200,Nikon,日本)下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

1.3.3 真菌的ITS分子鑒定

采用試劑盒進行真菌基因組DNA的提取,采用通用引物ITS1∕ITS4[12]對真菌ITS區(qū)進行PCR擴增,引物序列如下,ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR擴增體系:DNA模板1μL(約20 ng),10×PCR Buffer(含2.5 mmol∕L Mg2+)5μL,5 U∕μL Taq聚合酶1μL,10 mmol∕L dNTP 1μL,10 mmol∕L ITS1和ITS4引物各1.5μL,dd H2O加至50μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化后由上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定,獲得菌株完整的ITS序列;用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對,得到與待測物種序列相似性最大的物種信息;通過Bankit將獲得的菌株ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫,利用MEGA 6.0軟件進行同源性比對,采用鄰近法(Neighbor-Joining,NJ,bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析序列進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃桃表面污染真菌的分離與鑒定

從上海地區(qū)采集的23份黃桃樣品中共分離得到59株真菌,通過形態(tài)學(xué)特征和18SrDNA的ITS序列比對分析對分離到的真菌進行鑒定,結(jié)果顯示:59株真菌分屬于12個屬,包括鏈格孢屬Alternaria、鐮刀菌屬Fusarium、擬莖點霉屬Phomopsis、枝孢屬Cladosporium、曲霉屬Aspergillus、青霉屬Penicillium、葡柄霉屬Stemphylium、耐堿酵母屬Galactomyces、擬青霉屬Paecilomyces、絲核菌屬Rhizoctonia、小叢殼屬Glomerella、擬暗球腔菌屬Phaeosphaeriopsis。其中鏈格孢屬的真菌有24株,比例高達40.7%,鐮刀菌屬真菌12株,占20.3%(表1)?？梢?鏈格孢屬和鐮刀菌屬真菌為黃桃表面污染的主要真菌。

表1 上海地區(qū)黃桃樣本中污染真菌鑒定結(jié)果Table 1 Identification of fungi contamination on surface of yellow peach collected from Shanghai

2.2 不同來源黃桃表面真菌的比較

比較不同來源(市場和試驗地)的黃桃樣本表面真菌差異(表1)發(fā)現(xiàn),從市場采集的黃桃樣品中,鏈格孢菌的數(shù)量最多,比例高達55.9%,其次為鐮刀菌,比例為14.7%。從試驗地里采集的黃桃樣本中鐮刀菌屬菌株分離數(shù)量最多,比例為28.0%,其次是鏈格孢屬真菌,比例為20.0%。從市場采集的黃桃樣本中分離得到的菌株數(shù)量(34株)明顯高于從試驗地里分離到的菌株數(shù)(25株)。

2.3 主要真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

從23份黃桃樣本中共分離得到59株真菌,其中鏈格孢屬和鐮刀菌屬是最主要的兩種類型,占60%以上(表1)。如表2所示,分離到的24株鏈格孢屬真菌中共有3個種,分別為A.tenuissima、A.alternata、A.ochroleuca,其中A.tenuissima的數(shù)量最多,占比高達62.5%,且其主要是從市場采集的樣品中分離得到。A.alternata在鏈格孢屬中的分離比例達29.2%。A.ochroleuca在鏈格孢屬中的分離比為8.3%,在試驗地和市場樣品中的分離比例為1∶1。分離到的12株鐮刀菌屬真菌至少有3個種,分別為磚紅鐮刀菌F.lateritium、尖孢鐮刀菌F.oxysporum和厚垣鐮刀菌F.chlamydosporum。另外,還有3株鐮刀菌未鑒定出種的類型。磚紅鐮刀菌F.lateritium的種類最多,比例達58.3%,且其主要是從市場采集的樣品中分離得到。3株未鑒定出種的真菌均是從試驗地采集的樣品中分離得到。

表2 鏈格孢屬和鐮刀菌屬菌株數(shù)量Table 2 Number of Alternaria and Fusarium fungi

以菌株YP28為例,對典型的鏈格孢屬真菌進行鑒定,發(fā)現(xiàn)菌株YP28在PDA培養(yǎng)基上生長迅速,2 d后長出乳白色簇狀菌絲,隨著培養(yǎng)時間的延長,菌絲體由白色變成灰褐色,最后變成黑色(圖1)。菌絲褐色,中間有分隔。菌株產(chǎn)孢量豐富,孢子淡褐色至褐色,表面光滑或有微刺。分生孢子倒棍棒形、卵形或近橢圓形,具橫隔、縱隔或斜隔,分隔處縊縮明顯,孢身中部的隔膜較粗,呈黑褐色,喙呈柱狀。通過查閱中國真菌志[13]將其鑒定為交鏈格孢(A.alternata)。

圖1 菌株YP28的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characterization of isolate YP28

以菌株YP05為例,對典型的鐮刀菌屬真菌進行鑒定,發(fā)現(xiàn)菌株YP05在PDA培養(yǎng)基上生長5 d后,呈圓形或近圓形菌落,邊緣整齊呈放射狀。菌株生長迅速,初期為白色,后期呈淺粉色。小型分生孢子為單孢、假頭狀著生,呈卵圓形或腎形;大型分生孢子呈鐮刀形,略彎曲,兩端細胞稍尖,1—7個隔膜,多數(shù)為3個隔膜。厚垣孢子呈球形或近球形,表面光滑,壁厚,產(chǎn)孢細胞直接生長在菌絲上,或叢生狀著生在分生孢子座上。查閱中國真菌志[13]將其鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

圖2 菌株YP05的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characterization of isolate YP05

2.4 主要真菌的分子生物學(xué)鑒定

用ITS1∕ITS4引物對真菌DNA進行擴增,獲得18SrDNA的ITS序列。測序結(jié)果表明,菌株YP28的ITS片段為525 bp(圖3a),經(jīng)BLASTn比對,所得到的ITS序列與鏈格孢菌屬(Alternariasp.)的真菌序列相似度達99.8%。系統(tǒng)進化分析顯示,YP28的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已報道的A.alternata親緣關(guān)系很近(圖4a),故將其命名為A.alternateYP28(GenBank登錄號為MT647244)。

菌株編號為YP05的ITS片段大小為516 bp(圖3b),經(jīng)BLASTn比對后,該株菌的ITS序列與鐮刀菌屬(Fusariumsp.)ITS序列相似性為99.61%。系統(tǒng)進化分析顯示,所分離得到的YP05菌株與已報道的F.oxysporum親緣關(guān)系較近(圖4b),故將其命名為F.oxysporumYP05(GenBank登錄號為MT647243)。

圖3 黃桃中鏈格孢菌(a)和鐮刀菌(b)ITS區(qū)PCR產(chǎn)物電泳檢測Fig.3 PCR product of ITS sequence of Alternaria sp.(a)and Fusarium sp.(b)isolated from yellow peach

圖4 鏈格孢菌屬(Alternaria sp.)和鐮刀菌屬(Fusarium sp.)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees of Alternaria sp.and Fusarium sp.

3 討論

黃桃是上海及周邊地區(qū)重要的經(jīng)濟型果樹,上海地區(qū)黃桃成熟期正值梅雨季節(jié),高溫、高濕的特殊環(huán)境致使黃桃易遭受多種真菌的侵染,導(dǎo)致果實腐爛或腐敗,嚴重影響其商品性,且病斑處產(chǎn)生的大量真菌毒素等次生物質(zhì)會給人畜帶來一定的安全風險。本研究從上海地區(qū)黃桃樣本中共分離得到59株真菌,分屬于12個屬,其中鏈格孢屬的真菌所占比例高達40.7%,鐮刀菌屬真菌占20.3%,表明黃桃污染真菌種類復(fù)雜、多樣,其中鏈格孢屬和鐮刀菌屬真菌為污染黃桃的主要真菌。本研究為有針對地進行病害防治及潛在真菌毒素的污染篩查奠定了基礎(chǔ)。

與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相比,分子生物學(xué)方法在真菌鑒定上更為有效,在進行污染菌種鑒定時,越來越多的科研工作者將形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)的方法相結(jié)合以保證鑒定結(jié)果準確可靠[14-15]。ITS區(qū)高度保守、進化速度快、片段小、易于分析,被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究[16]?；豉i升[17]利用形態(tài)學(xué)方法將從桃黑斑病病枝和病果中分離純化的菌株初步鑒定為杏鏈格孢(A.armeniacae),通過ITS序列分析,發(fā)現(xiàn)分離菌株與GenBank中鏈格孢屬真菌相似性達99%。紀兆林等[18]利用rDNA-ITS序列和系統(tǒng)進化分析對我國8個不同產(chǎn)區(qū)桃褐腐病病原菌進行分離和鑒定,發(fā)現(xiàn)我國桃產(chǎn)區(qū)褐腐病菌主要以果生鏈核盤菌(Monilinia fructicola)為主。本研究利用形態(tài)學(xué)方法將從黃桃上分離到的2株菌株分別鑒定為鏈格孢屬真菌(Alternariasp.)和鐮刀屬真菌(Fusariumsp.),ITS序列分析顯示菌株YP28和YP05與A.alternate和F.oxysporum的相似性分別為99.8%和99.6%,這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相吻合。

黃桃受真菌污染的原因很多,田間收獲時,果園管理水平、環(huán)境溫度、濕度、栽培品種、果實的損傷狀況等均會造成黃桃不同程度的真菌污染[19-20]。黃桃采摘后所處的儲藏環(huán)境及搬運過程中受到的損傷均會造成黃桃表面污染真菌的變化[21]。本研究中,試驗地里采摘的黃桃表面的污染真菌與市售黃桃表面的污染真菌的種類存在一定的差異,試驗地采集的黃桃樣本中,鐮刀菌是主要污染真菌,這可能與試驗地的栽培環(huán)境密切相關(guān)。而市售的黃桃樣本中鏈格孢菌為主要真菌,這或許是由黃桃在運輸、儲藏等過程中的真菌暴露水平不同所引起。

很多鏈格孢屬真菌的菌種均可產(chǎn)生鏈格孢霉毒素,而交鏈格孢(A.alternate)被認為是主要的產(chǎn)毒菌種,其他的產(chǎn)毒菌種有細極鏈格孢(A.tenuissima)、喬木鏈格孢(A.arborescens)等[22]。本研究分離得到24株鏈格孢菌株,其中細極鏈格孢(A.tenuissima)15株,交鏈格孢(A.alternate)7株,說明黃桃中存在鏈格孢霉毒素污染的風險。鐮刀菌(Fusariumsp.)是最主要的植物病原菌之一,可引起100多種植物發(fā)病,嚴重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量,大多數(shù)的鐮刀菌均可產(chǎn)生鐮刀菌毒素[23]。本研究共分離到紅鐮刀菌(F.lateritium)7株、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)1株和厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporum)1株,另外,還有3株鐮刀菌未鑒定出種的類型。可見,黃桃中也存在鐮刀菌毒素污染的潛在風險。上述結(jié)果為了解可能造成黃桃污染的真菌毒素提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究對上海地區(qū)黃桃樣本中的污染真菌進行分離和鑒定,共鑒定出59株真菌,其中鏈格孢屬和鐮刀菌屬真菌的污染嚴重,這為后續(xù)黃桃的病害防治奠定了基礎(chǔ)。