生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥和天然藥物開發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)展

程思佳 李順祥

摘要 生物轉(zhuǎn)化技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)種類多以及環(huán)境污染小等特點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于中藥和天然藥物開發(fā)的研究越來越多，可以為現(xiàn)代藥物原料提供新的工藝或新替代品，對發(fā)掘中藥活性成分、擴(kuò)大藥源、保護(hù)中藥資源等有著重要意義?，F(xiàn)以國內(nèi)外最新研究報(bào)道為依據(jù)，分析了生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于中藥和天然藥物開發(fā)的意義，對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的生物體系，其主要反應(yīng)類型以及生物轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行總結(jié)，為進(jìn)一步研究提供思路與方法。

關(guān)鍵詞 生物轉(zhuǎn)化;中藥;天然產(chǎn)物;還原反應(yīng);水解反應(yīng);氧化反應(yīng);羥基化反應(yīng);糖基化反應(yīng)

Abstract Biotransformation has strong selectivity，high catalytic efficiency，mild reaction conditions，various reaction types and less environmental pollution properties，and was increasingly applied in Chinese medicinal and natural drugs，which provides a new technolo or substitute for modern pharmaceutical raw materials.It is of great significance in exploring active ingredients，expanding resources and protecting resources of Chinese medicinal.Based on the latest research at home and abroad，the paper analyzes the significance of biotransformation technology for the development of Chinese medicinal，summarizes the biological system of transformation reaction，its main reaction types and the influencing factors of biological transformation，and provides ideas and methods for further research.

Keywords Biotransformation; Chinese medicinal; Natural product; Reduction reaction; Hydrolysis reaction; Oxidation reaction; Hydroxylation; Glycosylation reaction

中圖分類號：R284.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.025

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，從古至今為中國乃至全世界人民的健康事業(yè)做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。但隨著人口增加，中藥市場的需求急劇增加，而野生中藥資源供不應(yīng)求，栽培藥材品質(zhì)參差不齊，存在藥材品質(zhì)欠佳、藥物活性成分含量不穩(wěn)定、生物利用度低等問題，對我國中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。因此，中藥及天然藥物的新型開發(fā)，對促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國際化具有重大意義[1-2]。生物轉(zhuǎn)化技術(shù)因諸多優(yōu)點(diǎn)而逐漸被許多研究者重視，現(xiàn)對該技術(shù)在中藥和天然藥物中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期為其如何更好地作用于中藥和天然藥物資源的開發(fā)與利用提供參考。

1 生物轉(zhuǎn)化技術(shù)

生物轉(zhuǎn)化（Biotransformation），又稱生物催化（Biocatalysis），是指利用生物體系或生物體系的相關(guān)酶制劑對外源性底物進(jìn)行改造或結(jié)構(gòu)修飾所發(fā)生的生理生化反應(yīng)[3]。它比傳統(tǒng)的化學(xué)合成更經(jīng)濟(jì)、更安全、更具區(qū)域選擇性和立體選擇性，能夠得到一些用傳統(tǒng)合成化學(xué)方法很難制備的生物活性化合物[4-6]。由此可見，生物轉(zhuǎn)化具有生成新化合物或更有效地生產(chǎn)已知化合物的巨大潛力。

目前，用于轉(zhuǎn)化研究的生物體系主要有真菌、細(xì)菌、藻類、植物懸浮細(xì)胞、組織或器官以及動物細(xì)胞、組織等，其中應(yīng)用最多的是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系和微生物體系。

由于植物細(xì)胞中存在許多特異性功能酶，通過選擇合適的植物細(xì)胞、反應(yīng)條件和底物，利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，可以獲得活性先導(dǎo)化合物[7-8]。近年來，利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究日漸增多，有研究利用成熟的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系對底物作用的多樣性，對一些生物利用度低的天然化合物和部分人工合成的活性化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得了具有較好活性的衍生物——熊果苷[9-10]。另外，微生物種類繁多、分布廣、繁殖快、易變異、對自然環(huán)境的變化具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力、含酶豐富等特點(diǎn)使得微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)能快速穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)，而且微生物遺傳操作的方法早已確立。Muthukumar等[11]將蕨類植物蜈蚣草的肌動蛋白催化基因轉(zhuǎn)至土壤農(nóng)桿菌中，將富含砒霜的孢子作為底物加入轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)行了穩(wěn)定表達(dá)。人參二醇皂苷以微生物體系為主進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物已被證實(shí)具有抗癌、抗炎、抗過敏以及神經(jīng)保護(hù)和肝保護(hù)作用等藥理活性[12]。目前，利用微生物轉(zhuǎn)化天然藥物是近年來研究的熱點(diǎn)之一，其來源的廣泛性為天然藥物轉(zhuǎn)化進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化提供了可能性，值得深入研究。

1.1 生物轉(zhuǎn)化中常見的反應(yīng)類型

用于生物轉(zhuǎn)化的各生物體系均能使多種化合物發(fā)生不同的反應(yīng)，其中主要涉及羥基化、水解、氧化、還原、糖基化等幾類化學(xué)反應(yīng)。我們可以通過對這些反應(yīng)的研究來尋找具有生物活性的衍生物，也可以通過對促進(jìn)這些反應(yīng)發(fā)生的酶的研究為產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程做準(zhǔn)備。見表1。

1.1.1 羥基化反應(yīng) 羥基化反應(yīng)在生物轉(zhuǎn)化中最為常見，目前可在底物某一位置或多個位置引入羥基，生成多種有意義的衍生物。見圖1?？朔藗鹘y(tǒng)有機(jī)化學(xué)方法難以準(zhǔn)確高效安全羥基化的瓶頸。此外，在羥基化反應(yīng)中扮演重要角色的羥基化酶具有特異性，可以立體選擇、專一地對底物進(jìn)行羥基化，得到特定高活性成分或新化合物來增加藥物療效。人類最早對羥基化反應(yīng)的關(guān)注始于Mason等[13]和Hayaishi等[14]對有機(jī)底物分子通過羥基化酶的作用結(jié)合氧生成氫氧化物的報(bào)道。生物轉(zhuǎn)化中進(jìn)行羥基化反應(yīng)的酶類型見表2。1952年，Morray和Pereroon首次從黑根霉中將黃體酮轉(zhuǎn)化為11α-羥基黃體酮，將研究者的注意力轉(zhuǎn)向了生物轉(zhuǎn)化和藥物合成的結(jié)合。其中，細(xì)胞色素P450酶系在合成活性物質(zhì)的羥基化反應(yīng)中扮演著重要角色，能夠介導(dǎo)甾體的羥基化反應(yīng)，而甾體類化合物在脂肪代謝、糖代謝、蛋白質(zhì)合成、礦物質(zhì)合成等方面發(fā)揮著重要的作用[15]。這些酶參與了植物次生代謝中的大部分羥基化反應(yīng)，如24-亞甲基膽固醇經(jīng)細(xì)胞色素P450酶催化的氫酰化反應(yīng)合成了多種烯醇類化合物，大約有14個細(xì)胞色素P450酶基因參與了紫杉醇途徑[16-18]。羥基化反應(yīng)在中藥和天然藥物開發(fā)中的應(yīng)用見表3。

1.1.2 水解反應(yīng) 常見于糖苷類、蛋白質(zhì)及多肽、酯類等中藥和天然藥物的水解作用，尤其是糖苷類。目前國內(nèi)外對人參皂苷和薯蕷皂苷水解反應(yīng)研究最多，對大豆皂苷和甘草皂苷水解反應(yīng)的研究次之，對齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷的研究相對較少。許多研究者通過生物轉(zhuǎn)化途徑改變皂苷的糖鏈結(jié)構(gòu)來避免物理法和化學(xué)法水解皂苷糖苷鍵對生態(tài)環(huán)境的破壞。另外，通過生物水解酶體系，可特異有效地水解糖類、蛋白質(zhì)及多肽等大分子物質(zhì)，使原本被視為雜質(zhì)的組分重新產(chǎn)生活性而得以利用。雖然現(xiàn)在大部分生物轉(zhuǎn)化水解反應(yīng)還處于較初級的篩選和發(fā)現(xiàn)階段，但只要通過優(yōu)化反應(yīng)條件和優(yōu)化克隆酶的基因等手段，發(fā)揮生物轉(zhuǎn)化的長處，一定能更好地將其應(yīng)用于中藥和天然藥物的研發(fā)。見表4。

1.1.3 氧化反應(yīng) 當(dāng)前對氧化反應(yīng)的研究主要集中于羥基氧化、羰基氧化、環(huán)氧化等方面。環(huán)氧化反應(yīng)在轉(zhuǎn)化的過程中也很普遍，多發(fā)生在化合物的雙鍵部位，尤其在菇類中常見，除環(huán)氧化反應(yīng)，雙鍵部位也很容易形成鄰二醇結(jié)構(gòu)[40]。最具代表性的便是沒藥醇在炭疽病毒作用下生成的幾種代謝產(chǎn)物的表現(xiàn)。另外，環(huán)氧化反應(yīng)生成的手性化合物的中間體在手性藥物的研究中起重要作用。不對稱環(huán)氧化反應(yīng)的研究與發(fā)展能對手性藥物的有效性和安全性提供基礎(chǔ)保障，以及更經(jīng)濟(jì)和更安全的用藥條件。見表5。

1.1.4 還原反應(yīng) 目前報(bào)道的還原反應(yīng)有羰基還原、雙鍵還原等。還原酮和醛中的羰基可以制備手性醇，生成新的手性中心，其在生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用廣泛，對藥物化學(xué)的發(fā)展具有重要意義[41]。利用還原酶催化進(jìn)行還原反應(yīng)與傳統(tǒng)化學(xué)方法進(jìn)行還原相比具有高效、環(huán)保等顯著優(yōu)勢。手性醇可以用來合成多種手性藥物，發(fā)現(xiàn)和發(fā)展新型、高效的不對稱還原催化，是極具前景的研究，其對于手性藥物的制備也是至關(guān)重要的。見表6。

1.1.5 糖基化反應(yīng) 常見的外源化合物中易發(fā)生糖基化的官能團(tuán)有羥基、氨基、羧基、甲氧基等，主要的轉(zhuǎn)化體系為植物懸浮細(xì)胞。而微生物體系內(nèi)相應(yīng)催化酶的缺乏，大多靠克隆外源基因構(gòu)建工程菌來完成糖基化反應(yīng)。糖基化通常是天然產(chǎn)物生物合成的最后一個環(huán)節(jié)，其實(shí)質(zhì)上是糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷轉(zhuǎn)移酶參與的高專一性反應(yīng)。糖基化產(chǎn)物具有高穩(wěn)定性、高水溶性和低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)，能讓藥效更好地發(fā)揮，為藥物的生產(chǎn)和開發(fā)助力。見表7。

1.2 生物轉(zhuǎn)化體系對中藥和天然藥物的影響

1.2.1 擴(kuò)大藥源，為新藥開發(fā)提供基礎(chǔ) 生物轉(zhuǎn)化技術(shù)因其對外源底物作用的多樣性、反應(yīng)的強(qiáng)選擇性和高效性，可以應(yīng)對目前天然活性成分在中藥和天然藥物中含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、合成困難等難題，緩解需求巨大的市場壓力，為高品質(zhì)的中藥和天然藥物走向現(xiàn)代化和國際化提供保障。近期有許多學(xué)者對發(fā)揮藥用價值的活性成分進(jìn)行研究，F(xiàn)ischer等[52]研究發(fā)現(xiàn)含H6H基因同源物的工程菌能使低山莨菪堿-6β-羥化酶在東莨菪堿生物合成中的活性大幅度提高。孫敏鴿等[53]利用黑曲霉將莪術(shù)醇轉(zhuǎn)化為抗流感、呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒作用更強(qiáng)的3α-羥基莪術(shù)醇。蘇玲等[54]利用人參-靈芝共發(fā)酵過程的復(fù)雜反應(yīng)類型，將原人參二醇型及原人參三醇型人參皂苷轉(zhuǎn)變?yōu)橄∮腥藚⒃碥誖g3、20S-Rg3、Rf。為了進(jìn)一步滿足醫(yī)藥市場對活性物質(zhì)的需求，有學(xué)者對生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)路進(jìn)行了研究，如郭雙雙等[55]利用菌種HQ-10產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶對黃芩進(jìn)行發(fā)酵，獲得了超過原藥材5倍以上的黃芩素提取率。為了解決青蒿素有效活性基團(tuán)過氧橋的不穩(wěn)定性、無法在酮基以外的部位進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的難題，有研究者將生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用在青蒿素的開發(fā)利用上，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了16個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并通過結(jié)構(gòu)鑒定確定其中10個為新化合物[56]。

1.2.2 減小不良反應(yīng)，優(yōu)化生產(chǎn)工藝 由于部分中藥存在有效成分穩(wěn)定性差、水溶性低、生物利用度低、不良反應(yīng)強(qiáng)等問題，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用，故對這些有效成分加以結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或修飾，對改善其性質(zhì)意義重大。羥基化反應(yīng)一般會在底物某一位置或多個位置引入羥基，可以改變底物極性，能有效改善藥物水溶性。李銳等[57]發(fā)現(xiàn)，利用華根霉將雙脫甲氧基姜黃素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化成雙脫甲氧基姜黃素-O-葡萄糖苷，不僅增加了其水溶性，并增強(qiáng)了其抗腫瘤活性，大大提高了其生物利用度。葉敏[58]利用連格孢霉對華蟾毒精進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用羥基化、脫氫、脫乙酰基反應(yīng)得到了6種羥基化和乙?；a(chǎn)物，大大降低了華蟾毒精的毒性，還增加了其藥效。孫鵬等[59]利用黑曲霉對附子進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，利用酯化反應(yīng)降低了烏頭堿含量，得到一種毒性較小的苯甲酰烏頭原堿，提高了附子的藥用價值。

1.2.3 作為體外模型，輔助藥物代謝研究 Reighard和楊金銘[60]于1974年提出了“哺乳動物藥物代謝的微生物代謝模型”理論。該理論建立在真菌與哺乳動物均為真核生物、其代謝機(jī)制所設(shè)計(jì)的酶系具有相似性的基礎(chǔ)上。因此，這一研究領(lǐng)域的開啟，為預(yù)測藥物代謝和建立體外藥物毒性代謝模型提供了良好平臺[61]。目前有關(guān)人體腸內(nèi)菌群對天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化作用報(bào)道較多，其中有研究發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)菌群也可以在體外幫助皂苷成分轉(zhuǎn)化為易被吸收的苷元，再對其進(jìn)一步利用，從而提高藥物的生物利用度[62]。有研究利用人腸內(nèi)菌群模型對藥物代謝進(jìn)行了深入研究，為入胃藥的體內(nèi)代謝研究提供了豐富的研究基礎(chǔ)[63-72]。

2 小結(jié)

由此可見，生物轉(zhuǎn)化體系中強(qiáng)大且多樣的生物酶體系可克服傳統(tǒng)研究方法難以實(shí)現(xiàn)的化學(xué)結(jié)構(gòu)改造或修飾的難題，以更低廉的成本得到自然界含量稀少的物質(zhì)或具有活性的新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)，以此擴(kuò)大藥源選擇范圍以促進(jìn)中藥新藥的開發(fā)。酶體系對原活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造或修飾，大幅度擴(kuò)大了高活低毒活性物質(zhì)的篩選范圍，有望從根本上解決某些藥物的毒性問題，為中藥活性成分的應(yīng)用拓寬了道路，更為新藥開發(fā)和應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。目前微生物模型在中藥活性物質(zhì)代謝方面的應(yīng)用研究報(bào)道較少，但近幾年生物信息學(xué)的快速發(fā)展，加上微生物代謝模型低成本、好調(diào)控和多樣性等優(yōu)點(diǎn)，其在活性、毒性評測以及活性物質(zhì)代謝研究上的作用十分可期。

3 討論

生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用，為傳統(tǒng)中藥和天然藥物研究提供了良好的機(jī)會和方法。目前取得的許多創(chuàng)新性成果也得到了廣泛認(rèn)同和高度肯定。但是生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在國內(nèi)的研究大部分仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，欲將其運(yùn)用于工業(yè)化大生產(chǎn)仍需克服許多技術(shù)問題。面對這一境況，我們需要對轉(zhuǎn)化機(jī)制和轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行系統(tǒng)化認(rèn)知，對各學(xué)科知識進(jìn)行整理和融合，結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行深入研究。生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊，我們應(yīng)該將二者有效結(jié)合，加快推進(jìn)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，為我國傳統(tǒng)中藥文化走向世界做出貢獻(xiàn)。

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（2020-11-17收稿 責(zé)任編輯：吳珊，徐穎）