甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組鑒定與分析

黃小芳 畢楚韻 王和壽 陳其俊 胡韻卓 陳選陽(yáng) 林世強(qiáng)

摘? 要：利用生物信息學(xué)方法對(duì)甘薯（Ipomoea batatas）基因組中NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行鑒定、保守結(jié)構(gòu)域分析、motif查找、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析以及逆境脅迫下基因表達(dá)分析。結(jié)果表明：甘薯全基因組序列中含有91個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，非均勻分布于甘薯15條染色體上;系統(tǒng)進(jìn)化樹及motif分析結(jié)果顯示，91個(gè)甘薯NAC家族成員可分為16個(gè)亞組，共包含20個(gè)motif，其中大部分家族成員中均含有motif 2、motif 4、motif 1、motif 8和motif 3，這5個(gè)motif分別對(duì)應(yīng)NAC結(jié)構(gòu)域中的5個(gè)子域A、B、C、D和E。在與擬南芥（Arabidopsis thaliana）NAC轉(zhuǎn)錄因子共同構(gòu)建的進(jìn)化樹中，有64個(gè)甘薯NAC家族成員被歸入擬南芥NAC基因家族的14個(gè)亞組，其中，NAC2亞組包含的成員數(shù)最多，有9個(gè)，TIP和AtNAC3亞組均僅有1個(gè)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在蔓割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. batatas， Fob）脅迫下甘薯NAC基因家族中有10個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生變化;而在低溫環(huán)境下有25個(gè)NAC基因差異表達(dá)。本研究結(jié)合利用基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，該結(jié)果為進(jìn)一步研究甘薯NAC基因家族的功能提供參考。

關(guān)鍵詞：甘薯;NAC;轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S531????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Genome-wide Identification and Analysis of NAC Transcription Factor Family of Ipomoea batatas

HUANG Xiaofang1，2， BI Chuyun1，2， WANG Heshou3， CHEN Qijun4， HU Yunzhuo1， CHEN Xuan-yang1，2，5*， LIN Shiqiang1，6*

1. Key Laboratory of Crop Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. College of Agriculture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 3. Ningde Agricultural and Rural Bureau， Ningde， Fujian 352100， China; 4. Seed Centre of Fujian， Fuzhou， Fujian 350002， China; 5. Key Lab of Genetics， Breeding and Multiple Application of Crops， Ministry of Education， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 6. College of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： The bioinformatic methods were used to conduct the identification， conservative domain analysis， motif search， chromosomal localization， phylogenetic analysis and gene expression analysis under stress with regard to the NAC transcription factors of the Ipomoea batatas genome. The results showed that there existed 91 genes of NAC transcription factors within the I. batatas genome， which were distributed unevenly in the 15 chromosomes. Phylogenetic and motif analysis indicated that the 91 members of NAC transcription factors could be classified into 16 subgroups and there were 20 motifs in total. Most members of the NAC family contained motif 2， motif 4， motif 1， motif 8 and motif 3， which corresponded to the subdomains A， B， C， D and E of the NAC domain. Within the phylogenetic tree constructed with the transcription factors of I. batatas and Arabidopsis thaliana， there were 64 I. batatas NAC transcription factors categorized into the 14 subgroups of A. thaliana NAC transcription factors， of which the NAC2 subgroup was the largest in number and the TIP subgroup and AtNAC3 subgroup both had only one member. Analysis of the transcriptomics data demonstrated that 10 genes of the I. batatas NAC transcription factors were differentially expressed under Fusarium oxysporum f. sp. batatas stress; whereas under the low temperature condition， there were 25 NAC genes differentially expressed. This study combined the analysis of genomic and transcriptomics data of I. batatas and the results provided reference for the functional inquiry into the I. batatas NAC transcription factors.

Keywords： Ipomoea batatas; NAC; transcription factor; bioinformatics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.004

近幾年來(lái)，對(duì)植物轉(zhuǎn)錄因子的研究越來(lái)越廣泛。轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同可分為WRKY、MYB、bHLH、bZIP和NAC等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子超家族，最早在矮牽牛和擬南芥中發(fā)現(xiàn)，Aida等[2]研究發(fā)現(xiàn)矮牽牛NAM基因和擬南芥ATAF1、ATAF2以及CUC2的3個(gè)基因所編碼的蛋白序列N端均有一段高度保守的氨基酸序列，因此將這一段高度保守的區(qū)域命名為NAC結(jié)構(gòu)域。典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的N端包含一個(gè)大約由150個(gè)氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)域由A、B、C、D和E共5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，其中，A、C和D亞結(jié)構(gòu)域高度保守，B和E保守性較弱;序列C端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，在氨基酸組成和功能方面均呈現(xiàn)高度多樣化[3]。

目前，越來(lái)越多的研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)以及生物與非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。Ooka等[4]以水稻和擬南芥為研究對(duì)象，將這2種植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子分為Ⅰ組和Ⅱ組，2個(gè)大組又進(jìn)一步分為18個(gè)亞類，其中I組中含有TERN、ONAC022、SENU5、NAP、AtNAC3、ATAF、OsNAC3、NAC2、ANAC011、TIP、OsNAC8、OsNAC7、NAC1和NAM等14個(gè)亞類，Ⅱ組中含有ANAC001、ONAC003、ONAC001和ANAC063等4個(gè)亞類。分類后的水稻和擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)結(jié)構(gòu)域相似性對(duì)其功能進(jìn)行分析，擁有motif x和motif xi的NAM及NAC1亞類與植物形態(tài)發(fā)生有關(guān);含有motif v的ATAF亞類則在植物響應(yīng)壓力刺激的反應(yīng)中起著重要作用。

甘薯（Ipomoea batatas）中關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究還比較少，張歡等[5]利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)從甘薯品種栗子香中鑒定得到一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子IbNAC72，在煙草中過(guò)表達(dá)IbNAC72基因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱性顯著提高。甘薯屬于六倍體植物，基因組高度多態(tài)且非常難以組裝，Yang等[6]通過(guò)使用新型單倍型基因組裝配方法，以甘薯品種‘泰中6號(hào)為研究對(duì)象進(jìn)行測(cè)序，獲得了甘薯栽培種的全基因組測(cè)序結(jié)果。本研究基于甘薯‘泰中6號(hào)測(cè)序得到的全基因組序列，應(yīng)用隱馬爾可夫方法，從中挖掘出甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子家族序列，分析NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域保守性、基因之間的進(jìn)化關(guān)系以及結(jié)構(gòu)特征等，為研究NAC轉(zhuǎn)錄因子在甘薯生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫等過(guò)程中的調(diào)控作用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/？term= Ipomoea+batatas）下載甘薯‘泰中6號(hào)[6]15條染色體的基因組序列。利用snap程序分別對(duì)甘薯15條染色體的基因組序列進(jìn)行CDS區(qū)檢索，檢索所選用的HMM模型為擬南芥（At.hmm）、線蟲（Ce.hmm）和水稻（Os.hmm），最終得到178 458個(gè)甘薯全基因組CDS序列，翻譯后得到蛋白組數(shù)據(jù)[7]。

1.2? 方法

1.2.1? 甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子挖掘與篩選? 從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）下載NAC結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型NAC.hmm（PF01849）和NAM.hmm（PF02365）。下載的2種HMM模型利用hmmsearch程序分別檢索甘薯全基因組蛋白序列，獲得甘薯NAC基因家族候選蛋白，從中選取特異的序列構(gòu)建甘薯特異的NAC結(jié)構(gòu)域HMM模型，再次對(duì)甘薯全基因組蛋白序列進(jìn)行檢索，將2次檢索得到的候選蛋白合并去除重復(fù)序列及氨基酸序列長(zhǎng)度小于150的序列（已知NAC結(jié)構(gòu)域大約由150個(gè)氨基酸組成[8]），剩余序列提交到NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（conserved domain database，CDD）進(jìn)行NAC結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證。經(jīng)CDD驗(yàn)證后的候選蛋白通過(guò)Interproscan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）、Augustus[9]以及結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[10]利用IGV軟件進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)，最終得到甘薯完整的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。

1.2.2? 甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析? 研究表明，NAC結(jié)構(gòu)域的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域中以A、C和D亞結(jié)構(gòu)域較為保守[11]。使用Clustal Omega程序[12]對(duì)篩選到的甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，截取較保守區(qū)域并對(duì)其氨基酸組成特征進(jìn)行分析。

1.2.3? 甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子分類及motif分析?? 應(yīng)用MEME程序[13]預(yù)測(cè)甘薯NAC蛋白序列的保守基序，查找的保守基序最大數(shù)目為20，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。甘薯NAC蛋白序列經(jīng)ClustalO比對(duì)后，利用MEGA X[14]構(gòu)建甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用鄰接法（Neighbor- joining），p-distance模型，空位選項(xiàng)為pairwise deletion，重復(fù)次數(shù)設(shè)為1000。

1.2.4? NAC轉(zhuǎn)錄因子染色體定位及重復(fù)基因篩選? 從甘薯基因的ZFF文件中，提取NAC基因在染色體上的位置信息，通過(guò)circos程序[15]將其標(biāo)注在染色體對(duì)應(yīng)的位置上。進(jìn)一步利用Blastn計(jì)算甘薯NAC家族中各基因之間的序列相似度，根據(jù)2個(gè)基因之間的相似度是否大于75%及比對(duì)區(qū)域覆蓋度是否超過(guò)較長(zhǎng)序列的75%，篩選出具有潛在復(fù)制關(guān)系的基因?qū)Γ谌D中用線條進(jìn)行連接[16]。

1.2.5? 甘薯及擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建? 從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https：//www. rabidopsis.org/）下載得到99條擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。將甘薯和擬南芥的NAC蛋白序列合并，經(jīng)多重序列比對(duì)后，通過(guò)MEGA X軟件[14]中的Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap=1000）。構(gòu)建成功的甘薯及擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹，參考擬南芥NAC基因家族已知的分類信息[4]，對(duì)甘薯NAC基因家族成員進(jìn)行整理和歸類。

1.2.6? 甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)分析? 從EBI（https：//www.ebi.ac.uk/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到甘薯蔓割病菌（Fusarium oxysporum f. sp. batatas， Fob）脅迫和低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。利用Hisat2[17]將下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子DNA序列進(jìn)行比對(duì)，手動(dòng)統(tǒng)計(jì)每個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子DNA序列所比對(duì)上的read數(shù)目，并通過(guò)DESeq2[18]對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。篩選出其中l(wèi)og2FoldChange大于1或小于?1的值，p adjust<0.05，利用pheatmap（https：//cran.r-project. rg/web/packages/pheatmap/index.html）構(gòu)建甘薯差異基因的表達(dá)模式聚類圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 甘薯基因組中NAC轉(zhuǎn)錄因子鑒定

利用NAM.hmm和NAC.hmm檢索甘薯全基因組蛋白序列，分別得到161個(gè)和8個(gè)甘薯NAC家族成員。從NAM.hmm模型檢索得到的161個(gè)家族成員中選取47個(gè)（Evalue<1e-30）作為高特異的序列構(gòu)建甘薯特異的NAM.hmm模型（Ib-nam.hmm），再次檢索甘薯全基因組蛋白序列，得到197條NAC蛋白序列，新增36條;以NAC.hmm檢索得到的8個(gè)家族成員為基礎(chǔ)構(gòu)建的甘薯特異的NAC.hmm模型（Ib-nac.hmm），再次檢索后得到10條NAC蛋白序列，新增2條，合并全部結(jié)果后得到207條甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子候選蛋白。因此對(duì)篩選到的207條甘薯NAC蛋白序列進(jìn)行排序，去除60條長(zhǎng)度小于150個(gè)氨基酸的序列，余下的147條去除其中不含有NAC結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域缺失嚴(yán)重的序列后，最終得到91條含有完整NAC結(jié)構(gòu)域的甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子序列。

2.2? 甘薯NAC保守結(jié)構(gòu)域分析

利用ClustalO軟件將甘薯91條NAC蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，參考擬南芥和水稻中NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的比對(duì)結(jié)果，用不同的顏色顯示甘薯NAC蛋白中NAC結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成特征，同時(shí)截取A、B、C、D和E亞結(jié)構(gòu)域的序列范圍（圖1），其中，C亞結(jié)構(gòu)域最長(zhǎng)，A、D亞結(jié)構(gòu)域次之，B和E亞結(jié)構(gòu)域相對(duì)較短（包括gap區(qū)域）;A、C和D亞結(jié)構(gòu)域中含有較明顯的空位（gap）區(qū)域，主要是因?yàn)楸葘?duì)過(guò)程中個(gè)別序列長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)或其中的NAC結(jié)構(gòu)域過(guò)短所造成的，例如A亞結(jié)構(gòu)域中，有2個(gè)明顯的gap區(qū)域，而在這2個(gè)區(qū)域中分別只有CM008342.1-snap.9597和CM008344. 1-snap.11179 2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列。

對(duì)甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子NAC結(jié)構(gòu)域保守性進(jìn)行分析，在甘薯NAC蛋白的NAC結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)68個(gè)保守性大于50%的位點(diǎn)，其中A亞結(jié)構(gòu)域中有17個(gè)，B亞結(jié)構(gòu)域中有6個(gè)，C亞結(jié)構(gòu)域中有21個(gè)，D和E亞結(jié)構(gòu)域中分別有19個(gè)和5個(gè)。A、C和D亞結(jié)構(gòu)域保守位點(diǎn)明顯多于B、E亞結(jié)構(gòu)域。

2.3? 甘薯NAC基因家族在染色體上的分布

利用circos分析甘薯NAC基因在染色體上的分布（圖2），91個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在甘薯15條染色體上均有分布，但并不均勻。8號(hào)染色體上分布數(shù)量最多，為15個(gè)，1、11、15號(hào)染色體上分別含有9、12、9個(gè);而在3、5、7、9、10、13以及14號(hào)染色體上所分布的NAC家族成員數(shù)則明顯偏少，僅為2～4個(gè)。為了研究甘薯NAC各家族成員之間的聯(lián)系，通過(guò)比對(duì)獲得各個(gè)基因序列之間的序列相似性，從中找到了46對(duì)含有潛在復(fù)制關(guān)系的基因并用線條在圖中連接。其中屬于染色體間的基因?qū)τ?對(duì)（紅色連線），分別為CM008339.1-snap.1484和CM008332.1-snap. 2449、CM008339.1-snap.1484和CM008332.1-snap. 2480、CM008340.1-snap.4820和CM008331.1-snap. 507、CM008340.1-snap.4820和CM008331.1-snap. 544、CM008341.1-snap.11042和CM008338.1-snap. 97、CM008341.1-snap.11042和CM008338.1-snap. 30、CM008342.1-snap.230和CM008331.1-snap. 423、CM008343.1-snap.5394和CM008338.1-snap. 0930。染色體內(nèi)的基因?qū)τ?8對(duì)（圖2中綠色連線），且部分染色體內(nèi)的基因?qū)υ谌旧w上的排列位置相近，形成基因簇，例如第15號(hào)染色體上的CM008345.1-snap.7738、CM008345.1-snap.7741、

CM008345.1-snap.7773、CM008345.1-snap.7775、CM008345.1-snap.8482和CM008345.1-snap.8483每2個(gè)基因之間均存在潛在重復(fù)關(guān)系，形成15個(gè)基因?qū)?，從圖2可看出，這6個(gè)基因在染色體上的分布位置相近。

2.4? 甘薯NAC基因家族分類及基序分析

對(duì)甘薯91個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)序列之間Bootstrap值的大小分為16個(gè)亞組，以I～ⅩⅥ命名。利用MEME軟件對(duì)甘薯NAC蛋白進(jìn)行保守基序分析，得到20個(gè)motif信息，將甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子motif的組成結(jié)果根據(jù)基因名字對(duì)應(yīng)到進(jìn)化樹的相應(yīng)位置上。從圖3中可發(fā)現(xiàn)，甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子motif的組成存在一定的規(guī)律，例如motif 1、motif 2、motif 3、motif 4和motif 8存在于50%以上的甘薯NAC家族成員中，含有motif 2、motif 3和motif 8的家族成員更是高達(dá)90%。另外，這5個(gè)高頻率出現(xiàn)的基序在甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列中呈motif 2-motif 4- motif 1-motif 8-motif 3的排布順序。

進(jìn)一步對(duì)這5個(gè)保守基序的氨基酸組成進(jìn)行分析（表1），發(fā)現(xiàn)motif 2、motif 4、motif 1、motif 8、motif 3分別對(duì)應(yīng)NAC結(jié)構(gòu)域中的A、B、C、D、E這5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，與圖1中甘薯NAC蛋白序列的比對(duì)結(jié)果相一致。結(jié)合進(jìn)化樹的分組結(jié)果，發(fā)現(xiàn)同一亞組中的成員具有極為相似的motif組成特征，個(gè)別亞組成員擁有其他亞組成員所不含有的motif類型，如VII組中的7個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子均含有其他亞組所沒有的motif 9;motif 17和motif 19分別僅存在于XIV亞組以及XVI亞組中;XV亞組和XVI亞組motif組成高度相似，且均含有其余亞組所沒有的motif 6，在進(jìn)化樹分支上的位置也極為相近，推測(cè)這2個(gè)亞組中的NAC蛋白具有相似的功能。

2.5? 甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

本研究將甘薯91條NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列和擬南芥99條NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列合并后共

同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)擬南芥NAC基因家族中

已知的家族成員分類信息對(duì)甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行歸類。結(jié)果表明（圖4），甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子中有64個(gè)家族成員被歸入擬南芥NAC基因家族的14個(gè)亞組中，NAC2亞組中包含的甘薯NAC家族成員數(shù)最多，有9個(gè);而TIP和AtNAC3亞組中均只有1個(gè)甘薯NAC家族成員。II組的4個(gè)亞組中，除了ANAC001亞組并未在圖中顯示，其余的亞組ANAC063和ANAC001中不含有甘薯NAC家族成員，僅ONAC003亞組中含有7個(gè)甘薯NAC家族成員。

2.6? 甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫和非生物脅迫條件下的差異表達(dá)

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法獲得了甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在尖孢鐮刀菌脅迫下表達(dá)量的變化（圖5A）。

從圖5中可發(fā)現(xiàn)，甘薯響應(yīng)尖孢鐮刀菌脅迫的NAC轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目較少，91個(gè)NAC家族成員中僅10個(gè)基因的表達(dá)量明顯變化，其中JS57_F07組中未發(fā)現(xiàn)NAC基因表達(dá)量的變化;JS57_F04和XZH_F07中分別有4個(gè)（CM008?331.1-snap.8055、CM008336.1-snap.1170、CM008337.1-snap.10711、CM008342.1-snap.9597）和6個(gè)（CM008331.1- snap.5177、CM008332.1-snap.3271、CM008332.1- snap.7031、CM008333.1-snap.3899、CM008338.1- snap.10930、CM008343.1-snap.5394）NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量發(fā)生上調(diào)或下調(diào)。

本研究利用Xushu15-1和Xushu15-4在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，繪制甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫下的基因表達(dá)模式聚類圖（圖5B）。甘薯91個(gè)NAC家族成員中有25個(gè)成員響應(yīng)低溫脅迫，其中有11個(gè)家族成員在4個(gè)分組中表達(dá)量均有明顯變化。從圖5B中可發(fā)現(xiàn)，大部分響應(yīng)低溫脅迫的NAC轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，如CM008333.1-snap.3899、CM008336.1-snap.1170、CM008338.1-snap.197及CM008343.1-snap.1246等均出現(xiàn)明顯的表達(dá)量下調(diào);其中CM00?8333.1- snap.3899在Xushu15_1和Xushu15_4中表達(dá)量雖均有下調(diào)，但相比于Xushu15_4 （log2Fo?ld?Change值2w和6w分別為?1.78和?1.52），CM008333.1- snap.3899在Xushu15_1中表達(dá)量下調(diào)更加顯著，在Xushu15_1中l(wèi)og2FoldChange值2w和6w分別為?5.13和?4.38。另外，部分甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫下表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，如CM008331.1- snap.5177、CM008332.1-snap.7031、CM008335.1- snap.5994、CM008341.1-snap.976和CM008345.1- snap.5188，這些在低溫環(huán)境下表達(dá)量顯著提高的基因可能在植物響應(yīng)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用。

3? 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)生物與非生物脅迫以及調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素信號(hào)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要的作用。本研究利用生物信息學(xué)方法從甘薯全基因組蛋白序列中鑒定得到91個(gè)含有完整NAC結(jié)構(gòu)域的NAC轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其進(jìn)行染色體定位、保守基序查找與分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建以及逆境脅迫下基因表達(dá)量的變化等進(jìn)行了研究，以期為研究甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能提供數(shù)據(jù)參考。

NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于多種植物中。目前，對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究越來(lái)越多，除了在模式植物擬南芥（105）、煙草（152）以及水稻（151）[11]中鑒定出了一定數(shù)量的NAC轉(zhuǎn)錄因子，在玉米[19]、大豆[20]以及毛竹[21]的基因組數(shù)據(jù)中分別鑒定出了128、152和125個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子。相比于其他植物中鑒定得到的NAC蛋白家族成員數(shù)量，甘薯基因組中NAC轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量（91）偏少。進(jìn)一步對(duì)甘薯的NAC轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將其分為16個(gè)亞組，對(duì)每個(gè)亞組氨基酸序列保守基序的組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子擁有相同的若干保守基序，但在不同的亞組之間保守基序的組成存在不同程度的變化。NAC2亞組中包含的9個(gè)甘薯NAC家族成員，推測(cè)它們可能與擬南芥NAC2亞組功能相似，與植物氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[22];ONAC003亞組中含有7個(gè)甘薯NAC家族成員，推測(cè)其與擬南芥中ONAC003亞組的NAC有相同的功能，參與調(diào)節(jié)開花時(shí)間[23]。

在對(duì)擬南芥NAC基因家族功能的研究過(guò)程中，Jensen等[24]研究表明ANAC019蛋白的NAC結(jié)構(gòu)域可通過(guò)識(shí)別并結(jié)合DNA的核心序列調(diào)控?cái)M南芥體內(nèi)與低溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。低溫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)生理代謝活動(dòng)的紊亂，轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物響應(yīng)低溫脅迫的重要部分[25]。Ji等[26]將具有不同低溫貯藏能力的甘薯品種‘Xushu15-1（高）和‘Xushu15-4（低）的塊根在4 ℃條件下貯藏0周、2周和6周后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較分析2個(gè)品種在低溫脅迫下的基因差異表達(dá)。本研究將甘薯與擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子序列合并共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)擬南芥中參與調(diào)節(jié)低溫脅迫的ANAC019基因所在的AtNAC3亞組中包含有甘薯CM008333.1-snap. 9506基因，該基因在對(duì)甘薯低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析的結(jié)果中表達(dá)量下調(diào);另外，在對(duì)甘薯NAC基因家族進(jìn)行分類的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，CM008333.1-snap.9506基因所在的I組成員還包括CM008332.1-snap.7031、CM008338.1-snap. 10186、CM008335.1-snap.5994、CM008335.1-snap. 6006、CM008341.1-snap.976、CM008333.1-snap. 3899以及CM008344.1-snap.4045，7個(gè)基因與CM008333.1-snap.9506在進(jìn)化樹上位置相近，motif的分布模式相似，說(shuō)明這7個(gè)NAC基因家族成員與CM008333.1-snap.9506基因可能具有類似的功能;比較低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這7個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析結(jié)果中均出現(xiàn)明顯的上調(diào)/下調(diào)表達(dá)。

為研究甘薯在病菌脅迫下其基因組中基因表達(dá)量的變化，Lin等[9]將高感品種‘新種花（XZH）和高抗品種‘金山57（JS57）植株接種蔓割病菌生理小種F04和F07，取樣測(cè)定了轉(zhuǎn)錄組。為了更全面地分析甘薯NAC轉(zhuǎn)錄因子在生物與非生物脅迫下的基因表達(dá)模式，本研究分別以蔓割病菌脅迫和低溫脅迫下的2個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中有多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量出現(xiàn)變化，響應(yīng)低溫脅迫的NAC基因數(shù)量（25）明顯多于蔓割病菌脅迫下的數(shù)量（10）。這些表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)或下調(diào)變化的NAC轉(zhuǎn)錄因子，可為后續(xù)的功能研究包括基因克隆、基因過(guò)表達(dá)、干擾、敲除和編輯等提供數(shù)據(jù)參考。

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責(zé)任編輯：黃東杰