1家系2例X-連鎖低血磷性佝僂病基因突變研究*

王懷波 殷常瑜 郭偉韜 何生 劉思景 張錦祥 鄒尚瀏

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，廣東 湛江 524000)

X-連鎖低血磷性佝僂病(X-Linked Hypophosphatemicrickets，XLH)是一種以腎臟磷酸鹽排泄增多引起低磷血癥為特征的骨代謝異常性疾病，其患病率為1/20000，最早由Albright等報(bào)道[1]。XLH為X染色體顯性遺傳，多為家族性發(fā)病，部分為散發(fā)性病例。主要臨床表現(xiàn)為骨骼發(fā)育不良、畸形、身材矮小、骨質(zhì)疏松、骨痛和牙釉質(zhì)發(fā)育不良等[2]，成年患者主要癥狀包括軟骨病和骨關(guān)節(jié)畸形[3]，生化方面主要表現(xiàn)為低血磷、1,25(OH)2D3水平正?；蚱?、血鈣正常，甲狀旁腺激素(PTH)正常，堿性磷酸酶水平升高，高尿磷，低尿鈣等。其臨床表現(xiàn)與維生素D缺乏性佝僂病比較相似，但按照維生素D缺乏性佝僂病的治療并不能改善癥狀，容易誤診延誤病情。早期診斷和及時(shí)治療是決定預(yù)后的關(guān)鍵[4]。本研究采用全外顯子組測(cè)序并應(yīng)用QPCR對(duì)一家系XLH突變基因PHEX進(jìn)行分析，同時(shí)給予藥物和手術(shù)干預(yù)，從而探討該家系XLH的致病機(jī)制和臨床治療效果。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年我院經(jīng)過(guò)全面臨床評(píng)估的疑似XLH的1家系2例患兒為研究對(duì)象，家系圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 XLH家系圖譜

1.1.1 病例1 先證者Ⅱ:1為9歲男性，因“生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，雙下肢“O”型腿6年余?！庇?016年11月至我院骨科門(mén)診。該患兒為第一胎第一產(chǎn)，2歲開(kāi)始站立行走，自幼較同齡兒童生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，身材矮小，雙下肢呈“O”型畸形，能正?；顒?dòng)。診斷為“佝僂病”，予補(bǔ)充鈣、維生素D等治療，上述癥狀未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)，雙下肢“O”型改變逐漸加重。于2017年3月行雙下肢DR示：雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻畸形，呈“O”形改變，干骺端寬大呈“杯口狀”，雙下肢各骨普遍骨質(zhì)疏松，符合佝僂病活動(dòng)期改變，見(jiàn)圖2A?？紤]到患者雙下肢畸形嚴(yán)重，于2017年4月收入院并行“雙股骨截骨矯形術(shù)”，術(shù)后復(fù)查下肢DR示股骨截骨對(duì)位、力線(xiàn)可，內(nèi)固定物位置良好，見(jiàn)圖2B。術(shù)后6個(gè)月復(fù)查下肢DR示股骨截骨處仍未見(jiàn)明顯愈合，見(jiàn)圖2C。

圖2 先證者Ⅱ:1影像學(xué)資料

家族史：母親和妹妹有類(lèi)似病史，父親身體健康，其他家族成員無(wú)類(lèi)似病史，患兒母親自幼身體發(fā)育遲緩，行走年齡較同齡兒童晚，身高1.25米，存在雙下肢“O”型畸形，行走呈搖曳步態(tài)，可做簡(jiǎn)單家務(wù)，間有骨骼疼痛。體格檢查：身高102 cm(-5.6 SD)，體重21 Kg。發(fā)育較同齡兒童低下，脊柱生理彎曲正常，雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻畸形，呈“O”型改變，四肢關(guān)節(jié)活動(dòng)正常，四肢肌力、肌張力正常，心肺腹查體未見(jiàn)異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：血磷 0.68 mmol/L，血鈣 2.37 mmol/L，堿性磷酸酶559 U/L，尿磷6.05 mmol/L，尿鈣1.42 mmol/L，甲功7項(xiàng)、皮質(zhì)醇未見(jiàn)異常。影像學(xué)檢查：胸部X線(xiàn)檢查：胸廓大致對(duì)稱(chēng)，左側(cè)肋骨形態(tài)欠佳，未除外陳舊性骨折畸形愈合，雙側(cè)前肋邊緣模糊，氣管居中。雙下肢及腕關(guān)節(jié)X線(xiàn)檢查：四肢骨骨質(zhì)密度減低，雙側(cè)尺橈骨、雙側(cè)股骨、雙側(cè)脛腓骨干骺端模糊，邊緣毛糙呈“毛刷狀”改變，擬佝僂病。四肢關(guān)節(jié)對(duì)位良好，關(guān)節(jié)間隙無(wú)明顯增寬或變窄。

1.1.2 病例2 患者Ⅱ:2為4歲女性，為先證者Ⅱ:1妹妹，因“生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，雙下肢“O”型腿2年余”于2018年1月至我院骨科門(mén)診就診，第二胎第二產(chǎn)，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，身高較同齡兒童低，雙下肢出現(xiàn)“O”型畸形。家族史：母親和哥哥有類(lèi)似病史，父親身體健康，其他家族成員無(wú)類(lèi)似病史，患者母親自幼身體發(fā)育遲緩，行走年齡較同齡兒童晚，身高102 cm，存在雙下肢“O”型畸形，行走呈搖曳步態(tài)，可做簡(jiǎn)單家務(wù)，間有骨骼疼痛。體格檢查：身高90 cm(-5.0 SD)，體重14 Kg，發(fā)育較同齡兒童低下，脊柱生理彎曲正常，雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻畸形，呈“O”型改變，四肢關(guān)節(jié)活動(dòng)無(wú)障礙，四肢肌力、肌張力正常，心肺腹檢查未見(jiàn)明顯異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：血磷0.87 mmol/L，血鈣2.4 mmol/L，堿性磷酸酶667 U/L。影像學(xué)檢查：雙下肢DR示：骨質(zhì)密度減低，干骺端模糊，呈“杯口狀”膨大，邊緣呈“毛刷狀”改變，雙下肢變形呈“O”形腿，符合佝僂病表現(xiàn)，見(jiàn)圖3。

圖3 患者Ⅱ:2影像學(xué)資料

1.2 全外顯子組測(cè)序和突變驗(yàn)證 本研究遵循《赫爾辛基宣言》關(guān)于人體醫(yī)學(xué)研究的道德原則，同時(shí)通過(guò)我院倫理審查委員會(huì)審查及患者家屬知情同意。

1.2.1 全外顯子組測(cè)序 抽取患兒外周靜脈血5 mL至EDTA抗凝管，使用Qiagen全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA，使用Covaris LE220超聲波儀將DNA樣本打斷成主帶為300 bp左右的DNA片段，然后使用AMPure XP beads進(jìn)行磁珠篩選，DNA片段末端補(bǔ)平后，在3′ 端加堿基“A”，使DNA片段能與3′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接，經(jīng)過(guò)LM-PCR擴(kuò)增并純化后，完成單個(gè)受檢者樣本的文庫(kù)構(gòu)建。使用定制的基因片段捕獲探針(Roche NimbleGen，Madison，USA)，與10～20個(gè)標(biāo)記好的患者DNA文庫(kù)在PCR儀中47℃下雜交16～24 h，雜交結(jié)束后進(jìn)行探針的洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進(jìn)行捕獲樣品的Post-PCR反應(yīng)。樣本使用Agilent 2100 生物分析儀進(jìn)行DNA文庫(kù)片段長(zhǎng)度、濃度檢測(cè)，質(zhì)量合格的樣本按照有效濃度和目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量pooling、定量。將pooling文庫(kù)進(jìn)行環(huán)化形成單鏈環(huán)狀DNA，然后擴(kuò)增2～3個(gè)數(shù)量級(jí)形成DNA納米球(DNB)，使用Pattern array技術(shù)實(shí)現(xiàn)DNB在硅芯片上的固定，最后使用高通量測(cè)序儀BGISEQ-500進(jìn)行50個(gè)循環(huán)測(cè)序，得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。(該過(guò)程在深圳華大基因公司進(jìn)行)。

1.2.2 序列分析 數(shù)據(jù)下機(jī)后進(jìn)入信息分析部分。首先對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的reads。隨后用對(duì)比軟件BWA將樣本與人的參考基因組HG19/HG20進(jìn)行序列比對(duì)得到樣本全部變異位點(diǎn)信息，突變類(lèi)型。使用GATK軟件做局部重對(duì)比和堿基質(zhì)量值重校正處理?；趯?duì)比結(jié)果得到每個(gè)樣品的測(cè)序深度、覆蓋度、對(duì)比率等指標(biāo)。接下來(lái)使用GATK v3.3.0的HaplotypeCaller檢測(cè)基因組變異，包括SNP(Single-Nucleotide Polymorphism)和Indel(Insertion And Deletion)并過(guò)濾掉NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults數(shù)據(jù)庫(kù)正常人群變異頻率大于0.01的變異，使用SnpEff軟件對(duì)變異結(jié)果進(jìn)行注釋及影響預(yù)測(cè)。PHEX基因除了點(diǎn)突變致病外，還可出現(xiàn)拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations，CNVs)。對(duì)于全外顯子組測(cè)序未找到PHEX基因突變者，推測(cè)可能存在CNVs，使用基于深度信號(hào)方法的CNVnator檢測(cè)CNVs。接下來(lái)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法對(duì)PHEX基因CNVs進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 QPCR驗(yàn)證 登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載PHEX基因序列，使用Primer 5軟件按照引物設(shè)計(jì)原則由深圳華大基因公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

取血液樣本100 μL行總RNA提取，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒去除基因組DNA，隨后加入PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 2 4 μL、無(wú)核酸酶水4 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應(yīng)結(jié)束得到總cDNA。在25 μL反應(yīng)體系中，含SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×)12.5 μL、PCR Forward Primer (10 μL) 1 μL、PCR Reverse Primer (10 μL)1 μL、cDNA2 μL、滅菌蒸餾水8.5 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min→(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)× 40 cycles→95 ℃ 15 s→ 60 ℃ 1 min→ 95 ℃ 15 s→得到融解曲線(xiàn)。本研究用2-ΔΔCt值相對(duì)定量法將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線(xiàn)性形式分析，所得結(jié)果是實(shí)驗(yàn)組中參照基因表達(dá)水平校準(zhǔn)的目的基因相對(duì)于對(duì)照組中目的基因增加或減少的倍數(shù)。相對(duì)定量RQ(relative quantity)=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 臨床治療隨訪(fǎng) 對(duì)先證者Ⅱ:1確診后，給予口服磷酸鹽合劑(磷酸二氫鈉1.8 g，磷酸氫二鈉14.5 g，加水至100 mL)，15～20 mL/次 ，每天4～5次。同時(shí)羅鈣全40 ng/kg每天分兩次服用。服藥期間定期復(fù)查血磷、血鈣等，根據(jù)檢查結(jié)果調(diào)整藥物劑量，防止高血鈣發(fā)生。定期復(fù)查腎臟彩超未發(fā)現(xiàn)腎鈣質(zhì)沉著，復(fù)查下肢DR了解病情變化及截骨處骨折愈合情況，治療6個(gè)月后股骨截骨處愈合并取出內(nèi)固定，見(jiàn)圖4。根據(jù)中國(guó)兒童身高標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線(xiàn)[5]，將身高轉(zhuǎn)換成身高標(biāo)準(zhǔn)差SDS，計(jì)算公式為身高SDS=(實(shí)際身高-同年齡同性別平均身高)/同年齡同性別人群身高標(biāo)準(zhǔn)差。經(jīng)過(guò)24個(gè)月治療后，患者身高較前有明顯增長(zhǎng)，由102 cm升至127 cm，身高SDS由-5.6 SD升至-2.8 SD。

圖4 先證者Ⅱ:1術(shù)后16個(gè)月、治療后6個(gè)月后雙下肢DR

對(duì)患者Ⅱ:2確診后，給予口服磷酸鹽合劑(配方同上)，15～20 mL/次 ，每天4～5次。同時(shí)羅鈣全40 ng/kg每天分兩次服用。囑其定期復(fù)查生化指標(biāo)，根據(jù)檢查結(jié)果調(diào)整藥物劑量。定期復(fù)查腎臟彩超未發(fā)現(xiàn)腎鈣質(zhì)沉著，復(fù)查下肢DR了解病情變化，考慮到患兒雙下肢畸形嚴(yán)重，于2018年8月行“雙股骨、脛骨截骨矯形術(shù)”，術(shù)后6個(gè)月截骨處骨折愈合，并于2019年7月行“雙股骨、脛骨內(nèi)固定物取出術(shù)”，見(jiàn)圖5A～B。經(jīng)過(guò)24個(gè)月治療后，患者身高較前有明顯增長(zhǎng)，由82 cm升至103 cm，身高SDS由-5.0 SD升至-2.3 SD。

圖5 患者Ⅱ:2 術(shù)后隨訪(fǎng)影像學(xué)資料

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)收錄明確致病關(guān)系的所有基因進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)與受檢者臨床表現(xiàn)相符的致病變異。這兩例患兒出現(xiàn)PHEX基因CNVs，通過(guò)對(duì)比患兒PHEX基因測(cè)序結(jié)果與正常序列得到具體CNVs為PHEX Exon10-11 del。使用引物X-PHEXex10和X-PHEXex11得到擴(kuò)增曲線(xiàn)圖(Amplification Plot)、原始熒光組分曲線(xiàn)圖(Multicomponent Plot)、熔解曲線(xiàn)(Melt Curve)，見(jiàn)圖6～8。計(jì)算得到先證者Ⅱ:1的PHEX ex10、PHEX ex11相對(duì)定量RQ值為0，患者Ⅱ:2的PHEX ex10相對(duì)定量RQ值為0.53，PHEX ex11相對(duì)定量RQ值為0.52，見(jiàn)圖9。在男性X染色體中，RQ≤0.1代表純和缺失；在女性X染色體中，0.4≤RQ≤0.6代表雜合缺失。證實(shí)致病基因突變?yōu)镻HEX Exon10-11 del，先證者Ⅱ:1為半合子突變，患者Ⅱ:2為雜合突變。

圖6 擴(kuò)增曲線(xiàn)圖表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線(xiàn)

圖7 原始熒光組分曲線(xiàn)圖出現(xiàn)正常的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖8 熔解曲線(xiàn)圖出現(xiàn)一個(gè)較窄的單峰表示擴(kuò)增具有極好的特異性

圖9 先證者Ⅱ:1和患者Ⅱ:2的RQ值

3 討論

XLH是由PHEX基因突變功能缺失引起，是遺傳性佝僂病中最常見(jiàn)的疾病[6]。由于其臨床表現(xiàn)與維生素D缺乏性佝僂病相似，常被誤診維生素D缺乏性佝僂病，國(guó)內(nèi)已有多篇類(lèi)似報(bào)道[7-8]。本研究中病例1的男性患兒曾在我院誤診，誤診原因?yàn)閷?duì)XLH發(fā)病機(jī)理認(rèn)識(shí)不足，對(duì)兒童佝僂病不能很好的進(jìn)行鑒別診斷。以往研究[9-10]顯示，XLH發(fā)病機(jī)制是PHEX基因突變使具有水解作用的PHEX蛋白失去功能，失去功能的PHEX蛋白對(duì)FGF23水解作用消失導(dǎo)致其在體內(nèi)堆積。FGF23可通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟磷酸鹽排泄、維生素D的產(chǎn)生和腸道對(duì)磷酸鹽的吸收來(lái)降低血磷和1,25(OH)2D3水平[11-13]，最終發(fā)生低磷血癥導(dǎo)致骨礦化不足等一系列骨并發(fā)癥。在本研究中，對(duì)臨床工作中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)家系兩個(gè)疑似XLH患者進(jìn)行基因檢測(cè)，顯示存在PHEX基因拷貝數(shù)變異(CNVs)：PHEX Exon10-11 del。這說(shuō)明本XLH家系的致病基因亦是PHEX。同時(shí)本家系研究顯示先證者Ⅱ:1(男性)為半合子突變，患者Ⅱ:2(女性)為雜合突變，證實(shí)了XLH的發(fā)病為X染色體連鎖顯性遺傳模式。

XLH患者的臨床表現(xiàn)異質(zhì)性強(qiáng)，同一家系的成員臨床表現(xiàn)、嚴(yán)重性可不一樣，甚至相同PHEX突變的患者臨床表現(xiàn)也可不同[14]。本研究中兩例患兒在下肢畸形程度、佝僂病嚴(yán)重程度及生化參數(shù)上并沒(méi)有顯著差異，但在治療前后患者Ⅱ:2(女性)的身高SDS值較先證者Ⅱ:1(男性)高。男女之間不同的突變型是否影響疾病的嚴(yán)重程度，多項(xiàng)關(guān)于性別與疾病表型嚴(yán)重程度研究得到的結(jié)論各不一致。有研究表明女性患者臨床癥狀往往比男性患者更輕[15]，這可能是因?yàn)榕噪s合子上正常X染色體等位基因的功能性補(bǔ)償作用[16]，但也可能與非基因因素有關(guān)。在后續(xù)的研究中將擴(kuò)大樣本量，將對(duì)PHEX基因表型和異質(zhì)性進(jìn)一步探討。

全外顯子組測(cè)序是一種利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的技術(shù)，可選擇性的對(duì)人類(lèi)基因組的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)及常見(jiàn)疾病相關(guān)的異常基因[17]。與昂貴的全基因組測(cè)序相比，全外顯子組測(cè)序更適用于臨床的高深度測(cè)序技術(shù)。雖然全外顯子組測(cè)序可檢測(cè)突變包括約2萬(wàn)個(gè)基因的點(diǎn)突變及20 bp以?xún)?nèi)的小片段缺失或插入突變，但無(wú)法完全覆蓋高重復(fù)、高復(fù)雜度或假基因區(qū)域，不能對(duì)基因組結(jié)構(gòu)變異如CNVs、大片段插入突變?nèi)鏏LU介導(dǎo)的插入進(jìn)行檢測(cè)。本研究中對(duì)于患兒樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序未找到PHEX基因突變，推測(cè)可能存在PHEX基因拷貝數(shù)變異(CNVs)。通過(guò)對(duì)比與患兒PHEX基因一同上機(jī)的其他正常樣本PHEX基因的測(cè)序深度，最終找到CNVs，證實(shí)了這一推測(cè)。

當(dāng)前XLH的藥物治療首選方案是磷酸鹽聯(lián)合骨化三醇[18]。本次研究的兩名兒童患者使用該療法治療后較治療前身高SDS有明顯升高，使用該療法6個(gè)月治療后截骨處達(dá)骨性愈合。這說(shuō)明該藥物聯(lián)合方案對(duì)本家系XLH確實(shí)有效。以往研究顯示，在該方案治療中30%～80%的患者中出現(xiàn)腎結(jié)石和甲狀旁腺功能亢進(jìn)[19]。本研究中暫未觀(guān)察到這樣的并發(fā)癥，可能是樣本量較小或是隨訪(fǎng)時(shí)間還不夠長(zhǎng)，在后期隨訪(fǎng)中將重點(diǎn)關(guān)注此類(lèi)并發(fā)癥。對(duì)于嚴(yán)重畸形的患者除了藥物治療外可能還需要手術(shù)治療。Petje等[20]甚至建議患者在畸形的早期階段進(jìn)行手術(shù)矯正，并計(jì)劃在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中進(jìn)行2～3次手術(shù)。本研究中的兩名患兒由于雙下肢嚴(yán)重畸形而行截骨矯形手術(shù)，術(shù)后雙下肢畸形得到較好的糾正，目前截骨部位已骨性愈合并拆除了內(nèi)固定，患兒活動(dòng)正常。遠(yuǎn)期效果如何，畸形是否會(huì)再次復(fù)發(fā)還需要繼續(xù)觀(guān)察。

4 結(jié)論

PHEX Exon10-11 del突變是這個(gè)XLH家系發(fā)病的主要原因?；純耗壳笆走x磷酸鹽合劑和骨化三醇聯(lián)合治療，對(duì)下肢畸形嚴(yán)重的患兒選擇合適的手術(shù)治療可取得不錯(cuò)的效果。