不同產(chǎn)地沙棘中總黃酮、總多酚含量測定及其抗氧化活性研究

李 娜，胡月月，葛 亮*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科沙棘屬多年生灌木或喬木，又名酸醋柳、黑刺等[1]，在維護(hù)和改善水、土壤等環(huán)境起著重要作用[2]。我國沙棘產(chǎn)地多元化，多分布在新疆、內(nèi)蒙、陜西、青海等地，占世界沙棘99%以上[3]。沙棘含有豐富的化學(xué)成分[4]，其中酚類和黃酮類具有抗氧化活性[5]。沙棘是國家衛(wèi)健委公布的藥食同源中藥[6]，含有大量的營養(yǎng)與生物活性物質(zhì)，具有較好的營養(yǎng)保健作用和較高的藥用價(jià)值，具有增強(qiáng)脾胃運(yùn)化功能、止咳化痰、活血化瘀的功效，可用于治療心血管疾病、脾虛食欲不佳、食物積聚、腹痛、心胸痛、瘀血經(jīng)閉等[7-10]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

沙棘，產(chǎn)自新疆、內(nèi)蒙、陜西、山西、青海、甘肅等，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為胡頹子科沙棘屬。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號809F024)，北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號2014052801)，成都科龍化工試劑廠；DPPH自由基(批號217-591-8)，東京化工產(chǎn)業(yè)；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、Folin-酚等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋，金壇醫(yī)療儀器廠；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.04 mg，加入60%乙醇，超聲溶解后，定容至刻度，配制成0.200 4 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg，加入蒸餾水充分溶解后，定容至刻度，配制成0.100 5 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液：稱取2 g沙棘粗粉，按料液比1∶20(g∶mL)加入60%乙醇，水浴回流1 h，過濾；殘余沙棘渣重復(fù)上述操作，合并濾液，用60%乙醇補(bǔ)足至100 mL；取25 mL，用蒸餾水補(bǔ)足至50 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%NaNO2溶液，混勻后靜置6 min；再加入1 mL 10%Al(NO3)3溶液，混勻后靜置6 min；最后加入10 mL NaOH溶液，用60%乙醇補(bǔ)足，混勻后靜置15 min，測定各溶液在500 nm處吸光度，以未加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的試液置于樣品池內(nèi)用于扣除空白；以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為A=10.993c+0.0055，R2=0.9997，線性范圍為0.024～0.064 mg·mL-1。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL Folin-酚試劑、1.5 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸餾水補(bǔ)足，混勻，75 ℃水浴15 min，測定各溶液在760 nm處吸光度，以未加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的試液置于樣品池內(nèi)用于扣除空白；以沒食子酸濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為A=100.38c+0.027，R2=0.9995，線性范圍為0.002～0.007 mg·mL-1。

1.2.3 樣品測定

分別吸取適量新疆、內(nèi)蒙、陜西、山西、青海、甘肅沙棘提取物溶液，按1.2.2方法測定吸光度，依據(jù)線性回歸方程計(jì)算6個(gè)產(chǎn)地沙棘中總黃酮、總多酚的含量。

1.2.4 抗氧化活性評價(jià)

1.2.4.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11-14]配制0.4 mg·mL-16個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物溶液，稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為0.027、0.053、0.08、0.11、0.13、0.16、0.19、0.21、0.24、0.27、0.30的樣品溶液。取3 mL各濃度樣品溶液，加入2 mL 1×10-4mol·L-1DPPH自由基溶液，混勻，靜置于背光處，30 min后測定溶液在516 nm處吸光度，每個(gè)沙棘樣品溶液測3次，按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。以VC為陽性對照，將無水乙醇置于樣品池內(nèi)用于扣除空白。

(1)

式中：A0為2 mL DPPH自由基溶液+3 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL無水乙醇+3 mL沙棘樣品溶液的吸光度；A2為2 mL DPPH自由基溶液+3 mL沙棘樣品溶液的吸光度。

1.2.4.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11-14]配制10 mg·mL-16個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物溶液，稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為0.01、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00的樣品溶液。取0.2 mL各濃度樣品溶液，加入3.9 mL ABTS自由基溶液，混勻，靜置于背光處，15 min后測定溶液在734 nm處吸光度，每個(gè)沙棘樣品溶液測3次，按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。以VC為陽性對照，將無水乙醇置于樣品池內(nèi)用于扣除空白。

(2)

式中：A0為3.9 mL ABTS自由基溶液+0.2 mL無水乙醇的吸光度；A1為3.9 mL無水乙醇+0.2 mL沙棘樣品溶液的吸光度；A2為3.9 mL ABTS自由基溶液+0.2 mL沙棘樣品溶液的吸光度。

(3)

式中：A0為1 mL蒸餾水替代沙棘樣品溶液的吸光度；A1為1 mL蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的吸光度；A2為Tris-HCl溶液+沙棘樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

精密度：分別取同一蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份，按1.2.2方法測定吸光度，其RSD值分別為0.19%和0.10%。表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性：分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各1份，按1.2.2方法在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min測定吸光度，發(fā)現(xiàn)吸光度在90 min內(nèi)穩(wěn)定，其RSD值分別為0.60%和0.50%。

重復(fù)性：取同一沙棘樣品溶液6份，按1.2.2方法測定吸光度，計(jì)算沙棘總黃酮和總多酚吸光度的RSD值分別為1.0%和2.2%。表明該方法重復(fù)性良好。

加標(biāo)回收率：取6份已知含量的同一沙棘樣品溶液，分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法測定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率(表1)。沙棘總黃酮、總多酚加標(biāo)回收率分別為：120%：(99.72±0.62)%、(102.22±0.01)%；100%：(100.77±0.48)%、(102.03±0.01)%；80%：(101.83±0.13)%、(102.78±0.01)%，RSD值均小于1%。表明該方法穩(wěn)定可行。

表1 加標(biāo)回收率測定結(jié)果(n=6)/%

2.2 樣品含量測定

新疆、內(nèi)蒙、陜西、山西、青海、甘肅等6個(gè)產(chǎn)地沙棘中的總黃酮和總多酚含量見表2。

表2 不同產(chǎn)地沙棘中的總黃酮和總多酚含量(n=3)

由表2可知，不同產(chǎn)地沙棘中的總黃酮和總多酚含量有差異。內(nèi)蒙沙棘中的總黃酮和總多酚含量均最高，分別為38.84 mg·g-1、33.31 mg·g-1；而甘肅沙棘中的總黃酮和總多酚含量均最低，分別為8.50 mg·g-1、12.36 mg·g-1。

2.3 沙棘提取物對DPPH自由基的清除作用

按1.2.4.1方法測定6個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物對DPPH自由基的清除率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 沙棘提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.extract on DPPH free radicals

由圖1可知，6個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物對DPPH自由基的清除率均低于VC，但均隨濃度的增加逐漸升高；在測定濃度范圍內(nèi)，6個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物對DPPH自由基的清除作用具有一定量效關(guān)系；當(dāng)濃度高于0.11 mg·mL-1時(shí)，新疆沙棘提取物對DPPH自由基的清除率最高；當(dāng)濃度低于0.11 mg·mL-1時(shí)，陜西沙棘提取物對DPPH自由基的清除率最高。

2.4 沙棘提取物對ABTS自由基的清除作用

按1.2.4.2方法測定6個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物對ABTS自由基的清除率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 沙棘提取物對ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.extract on ABTS free radicals

由圖2可知，6個(gè)產(chǎn)地沙棘提取物對ABTS自由基的清除率均低于VC，但均隨濃度的增加逐漸升高而后趨于穩(wěn)定；新疆、內(nèi)蒙、山西沙棘提取物對ABTS自由基的清除作用相近，陜西、青海、甘肅沙棘提取物對ABTS自由基的清除作用相近。

2.5 沙棘提取物對的清除作用

圖3 沙棘提取物對的清除作用Fig.3 Scavenging effect of Hippophae rhamnoides L.

2.6 討論

前期對不同產(chǎn)地沙棘鮮果和干果中的總黃酮和總多酚含量進(jìn)行對比研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，干果中總黃酮與總多酚的含量高于鮮果中的，可能是鮮果中含有較多水分的緣故。

3 結(jié)論