體外雙分子熒光蛋白檢測化學(xué)交聯(lián)劑的研究

王 菲，滕 霄，曹雪松

(聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000)

蛋白質(zhì)是生命活動最重要的功能分子，蛋白質(zhì)之間特定的相互作用構(gòu)成了細胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，研究蛋白質(zhì)相互作用機理可以加深我們對生命科學(xué)的認識。目前對蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)主要有酵母雙雜技術(shù)、雙分子熒光互補技術(shù)(BiFc)、免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)、噬菌體展示技術(shù)、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)、pull-down技術(shù)等[1-8]。蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在有活性的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)亞基之間，很多是瞬時作用，而且失活蛋白質(zhì)或錯誤折疊蛋白質(zhì)往往會失去原有的與特定蛋白質(zhì)相互作用的能力，這是蛋白質(zhì)相互作用研究面臨的難題。

蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)可以通過化學(xué)物質(zhì)修飾蛋白質(zhì)使其對特定位點或特定類型的位點具有親和力[9]，從而建立牢固的蛋白質(zhì)相互作用復(fù)合體，有效解決了上述難題[10]。蛋白質(zhì)交聯(lián)是指通過一定的化學(xué)試劑或催化劑，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)與其它物質(zhì)結(jié)合在一起，達到改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的目的，交聯(lián)過程中，共價鍵的形成可能伴隨著消去部分基團，也可能伴隨著附加部分基團[11]。目前常用的化學(xué)交聯(lián)劑分為四類：第一類，與伯胺基團反應(yīng)的交聯(lián)劑(如N-羥基琥珀酰亞胺)，被廣泛用于與賴氨酸殘基上的N端和ε-氨基形成穩(wěn)定的共價鍵，具有較高的反應(yīng)效率[12-13]；第二類，巰基反應(yīng)交聯(lián)劑，可以通過烷基化(鹵乙酰基)或二硫鍵交換(馬來酰亞胺、吡啶二硫醇)修飾目標蛋白質(zhì)上的巰基[14]；第三類，可將蛋白質(zhì)C端羧基與天冬氨酸、谷氨酸側(cè)鏈羧基交聯(lián)(如甲醛、戊二醛)[15-16]；第四類，通過紫外光激活形成交聯(lián)的光反應(yīng)性交聯(lián)劑(二疊氮類、芳基疊氮類)，其優(yōu)點在于可以通過控制光源的時間和強度來調(diào)節(jié)反應(yīng)強弱[17-18]。

對于蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)中化學(xué)交聯(lián)劑的選擇一般通過交聯(lián)效率進行篩選，而交聯(lián)效率的評估方法目前主要采用SDS-PAGE法與HPLC-MS法。SDS-PAGE法耗時較長，而HPLC-MS法所需儀器設(shè)備非常昂貴。鑒于此，作者分別以戊二醛和甲醛為交聯(lián)劑，以Ni NTA Beads為固體介質(zhì)，將紅色熒光蛋白(mCherry)和高可溶性綠色熒光蛋白(soluble GFP, sGFP)進行交聯(lián)反應(yīng)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察固體介質(zhì)上雙熒光強弱來判斷交聯(lián)效果并對交聯(lián)效率進行評估，以期開發(fā)一種快速、簡便、高通量的體外初步篩選化學(xué)交聯(lián)劑的新方法[19-21]。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

pET29b(+)、3%戊二醛溶液，自行保存；Ni NTA Beads，北京博奧龍免疫技術(shù)公司；凝血酶(thrombin)，北京百奧萊博科技有限公司；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；37%甲醛，西隴科學(xué)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化(北京)有限公司；膠回收試劑盒，GenStar-康潤公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

SBH130D型恒溫水浴鍋，Stuart公司；3500R型凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；AR2140型電子分析天平，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；Centrifuge 5810R型高速離心機，Eppendorf公司；JY92-2D型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；雜交儀，Stovall Life Science；LB 985型植物活體影像儀，Berthold公司；FV1200型激光共聚焦顯微鏡，Olympus公司。

1.2 pET29b(+)-mCherry和pET29b(+)-sGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建

上游引物F：5′-TATAGGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′；下游引物R：5′-GCGCGTCGACCTGTACAGCTCGTCCAT-3′。在上游引物和下游引物中分別加上限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，mCherry片段擴增，BamHⅠ和SalⅠ酶切，然后連接至經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ酶切后的pET29b(+)載體上，得到重組質(zhì)粒pET29b(+)-mCherry(在C端帶有His6標簽)，將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，提取得到大量重組質(zhì)粒。

同法構(gòu)建pET29b(+)-sGFP重組質(zhì)粒。

1.3 pET29b(+)-mCherry和pET29b(+)-sGFP的原核表達與純化

將pET29b(+)-mCherry、pET29b(+)-sGFP分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，復(fù)蘇擴培至OD600值為0.4～0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為100 μmol·L-1，18 ℃誘導(dǎo)16 h后，收集菌體，加入5 mL非變性裂解液，溶菌酶終濃度為1 mg·mL-1，200 W超聲波破碎(工作40 s、間歇20 s)。

使用Ni NTA Beads對mCherry蛋白進行過柱純化。

sGFP蛋白的去標簽化：取破碎離心后的上清液，按4∶1的比例加入Ni NTA Beads進行孵育，待兩者充分混合后，離心收集Ni NTA Beads；用Wash Buffer洗滌5次，加入1 mL PBS緩沖溶液(pH值7.4)重懸Ni NTA Beads；加入凝血酶至工作濃度為4 U·mL-1，于37 ℃酶切16 h，去除sGFP蛋白所攜帶的His6標簽。

1.4 等比例雙分子熒光蛋白的交聯(lián)

戊二醛為交聯(lián)劑：采用Bradford法測定mCherry蛋白溶液濃度和sGFP蛋白溶液濃度；按等比例(摩爾濃度比，下同)混合mCherry蛋白溶液與sGFP蛋白溶液，總體積80 μL，移入1.5 mL EP管中；加入適量3%戊二醛溶液，至交聯(lián)濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，每個濃度做3個平行，37 ℃交聯(lián)30 min；通過稱取EP空管質(zhì)量、混合均勻Ni NTA Beads的方式等量加入30 μL Ni NTA Beads，旋轉(zhuǎn)孵育30 min。

甲醛為交聯(lián)劑：按上述方法將2種蛋白溶液混合，加入適量37%甲醛溶液，至交聯(lián)濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，每個濃度做3個平行，室溫交聯(lián)30 min；通過稱取EP空管質(zhì)量、混合均勻Ni NTA Beads的方式等量加入30 μL Ni NTA Beads，旋轉(zhuǎn)孵育30 min。

對照組：按上述方法將2種蛋白溶液混合，不加交聯(lián)劑，加入等量Ni NTA Beads，其余條件均相同。

1.5 交聯(lián)濃度的選擇

交聯(lián)結(jié)束后，5 000 r·min-1離心3 min，最大程度取出全部上清液，離心后的Ni NTA Beads加入30 μL PBS緩沖溶液保存。戊二醛交聯(lián)樣品，每個交聯(lián)濃度取100 μL上清液加入96孔板中，不足100 μL的用1% NaCl補足；甲醛交聯(lián)樣品，每個交聯(lián)濃度取60 μL上清液加入96孔板中。利用植物影像儀(參數(shù)設(shè)置為exposure time：1 s，read：low，gain：high)檢測上清液中剩余sGFP的熒光強度，用Indigo軟件(2.0.5.0版)對采集圖片中顯示均勻大小的區(qū)域進行平均熒光強度計算，最終確定最佳交聯(lián)濃度。

1.6 熒光直觀化檢測交聯(lián)效果

充分懸浮Ni NTA Beads，取5 μL置于載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長分別為 488 nm和594 nm，光電倍增管電壓PMT(HV)420 V，激光器透過率(gain)5×，降噪調(diào)整offset為50%，其余參數(shù)默認)觀察，利用Cellsens Standard軟件進行熒光Ni NTA Beads數(shù)目統(tǒng)計及交聯(lián)效率計算，每個結(jié)果重復(fù)統(tǒng)計3次，四舍五入保留整數(shù)值。

1.7 SDS-PAGE檢測交聯(lián)效果

配制12%分離膠10 mL(ddH2O 3.3 mL，30%聚丙烯酰胺儲備膠4.0 mL，pH值8.8的1.5 mol·L-1Tris 2.5 mL，10%SDS 0.1 mL，10%過硫酸銨0.1 mL，TEMED 0.004 mL)、5%濃縮膠4 mL(ddH2O 2.7 mL，30%聚丙烯酰胺儲備膠0.67 mL，pH值8.8的1.5 mol·L-1Tris 0.5 mL，10%SDS 0.04 mL，10%過硫酸銨0.04 mL，TEMED 0.004 mL)。按1.4方法制備交聯(lián)樣品，每個戊二醛交聯(lián)樣品取出32 μL，加入8 μL的5×loading buffer，漩渦振蕩20 s，65 ℃煮樣5 min，5 000 r·min-1離心1 min，上樣量18 μL，120 V電泳1.5 h，考馬斯亮藍染色10 min，脫色3 h，檢測戊二醛交聯(lián)效果。

同法檢測甲醛交聯(lián)效果。

1.8 微量非等比例雙分子熒光蛋白的交聯(lián)

定量sGFP與不同濃度的mCherry經(jīng)戊二醛交聯(lián)：測定2種蛋白溶液濃度后，取sGFP蛋白溶液1 μL，分別按1∶3、1∶9、1∶15、1∶21、1∶27的比例加入2 μL、6 μL、10 μL、15 μL、18 μL的mCherry蛋白溶液，交聯(lián)濃度為1.0%，37 ℃交聯(lián)30 min，將交聯(lián)樣品與20 μL的Ni NTA Beads旋轉(zhuǎn)孵育30 min，用激光共聚焦顯微鏡觀察交聯(lián)效果(參數(shù)設(shè)置為光電倍增管電壓PMT(HV)560 V，激光器透過率(gain)5×，降噪調(diào)整offset為50%，其余參數(shù)默認)，利用Cellsens Standard軟件進行熒光Ni NTA Beads數(shù)目統(tǒng)計及交聯(lián)效率計算。

定量mCherry與不同濃度的sGFP經(jīng)戊二醛交聯(lián)：取mCherry蛋白溶液1 μL，分別按1∶3、1∶9、1∶15、1∶21、1∶27的比例加入4 μL、13 μL、21 μL、30 μL、39 μL的sGFP蛋白溶液，按上述方法檢測交聯(lián)效果。

使用甲醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)濃度為1.5%，同法檢測微量非等比例雙分子熒光蛋白的交聯(lián)效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 pET29b(+)-mCherry重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以p1305N-U6-2×Sap I-MG質(zhì)粒為模板擴增目的基因mCherry，利用引物進行PCR擴增，獲得帶有BamHⅠ、SalⅠ的酶切位點片段，目的片段長度為715 bp，與目標條帶大小一致(圖1a)。利用BamHⅠ、SalⅠ酶切位點將mCherry片段克隆到pET29b(+)載體中，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR擴增結(jié)果顯示存在陽性克隆(圖1b)。菌落PCR擴增后，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切進行鑒定(圖1c)，得到715 bp目的基因片段mCherry。

圖1 pET29b(+)-mCherry重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of pET29b(+)-mCherry recombinant plasmid

2.2 pET29b(+)-mCherry和pET29b(+)-sGFP的原核表達與純化

分別將重組質(zhì)粒pET29b(+)-mCherry和pET29b(+)-sGFP轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。經(jīng)SDS-PAGE檢測，與未誘導(dǎo)對照組相比，在30 kDa處出現(xiàn)mCherry(圖2a)和sGFP(圖2c)條帶，與預(yù)期蛋白相對分子量(28 kDa)位置基本一致，表明誘導(dǎo)表達成功。采用Ni NTA Beads純化2種熒光蛋白，進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，在相對分子量30 kDa處出現(xiàn)明顯目的條帶mCherry(圖2b)和sGFP(圖2d)，且基本無其它雜帶。

圖2 mCherry和sGFP熒光蛋白的誘導(dǎo)、表達與純化Fig.2 Induction,expression,and purification of mCherry and sGFP

2.3 雙分子熒光蛋白的交聯(lián)

2.3.1 mCherry和sGFP蛋白的濃度測定

分別以戊二醛和甲醛為交聯(lián)劑，對mCherry蛋白和sGFP蛋白進行交聯(lián)。采用Bradford法，測定595 nm處吸光度，繪制BSA標準曲線(圖3)。計算得到以戊二醛為交聯(lián)劑時mCherry蛋白溶液濃度為1.537 mg·mL-1，sGFP蛋白溶液濃度為1.068 mg·mL-1；以甲醛為交聯(lián)劑時mCherry蛋白溶液濃度為0.932 6 mg·mL-1，sGFP蛋白溶液濃度為0.935 8 mg·mL-1。

圖3 以戊二醛(a)和甲醛(b)為交聯(lián)劑時，測定蛋白濃度的BSA標準曲線Fig.3 BSA standard curves for detection of protein concentration in cross-linking experiments with glutaraldehyde(a) and formaldehyde(b) as cross-linking agents

2.3.2 最佳交聯(lián)濃度的選擇

在483 nm激發(fā)波長下，檢測不同交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液和甲醛交聯(lián)樣品溶液中剩余sGFP的熒光強度，結(jié)果如圖4所示。

對于戊二醛交聯(lián)樣品溶液，植物影像檢測結(jié)果(圖4a)顯示，交聯(lián)濃度為1.0%、1.5%、2.0%的樣品溶液中剩余sGFP的熒光強度低于交聯(lián)濃度為0.1%、0.5%的(熒光強度由強到弱表現(xiàn)為赤橙黃綠青藍紫)；熒光強度彩色立體圖(圖4b)顯示，交聯(lián)濃度為1.0%的樣品溶液中剩余sGFP的熒光強度低于交聯(lián)濃度為0.1%、0.5%、1.5%、2.0%的；5種交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液3次平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果(圖4c)顯示，交聯(lián)濃度為1.0%的樣品溶液與Ni NTA Beads 孵育吸附后，剩余sGFP的平均熒光強度處于最低值。

圖4 不同交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液(a～c)和甲醛交聯(lián)樣品溶液(d～f)中剩余sGFP的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of residual sGFP in cross-linking sample solution with different cross-linking concentrations by using glutaraldehyde(a-c) and formaldehyde(d-f) as cross-linking agents

對于甲醛交聯(lián)樣品溶液，植物影像檢測結(jié)果(圖4d)顯示，交聯(lián)濃度為1.5%、2.0%的樣品溶液中剩余sGFP的熒光強度低于交聯(lián)濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.5%的；熒光強度彩色立體圖(圖4e)顯示，交聯(lián)濃度為1.5%、2.0%的樣品溶液中剩余sGFP的熒光強度低于交聯(lián)濃度為0.1%、0.5%、1.0%、2.5%的；6種交聯(lián)濃度的甲醛交聯(lián)樣品溶液3次平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果(圖4f)顯示，交聯(lián)濃度為1.5%的樣品溶液與Ni NTA Beads孵育吸附后，剩余sGFP的平均熒光強度處于最低值。

2.3.3 熒光直觀化檢測交聯(lián)效果

分別取5 μL全新Ni NTA Beads、5 μL未加入交聯(lián)劑的陰性對照樣品、5種交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液、6種交聯(lián)濃度的甲醛交聯(lián)樣品溶液，用激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長分別為594 nm、488 nm)觀察，結(jié)果如圖5所示。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig.5 Results of visual observation by laser confocal microscope

由圖5可以看出，全新的Ni NTA Beads不呈現(xiàn)熒光(圖5a、5b)。而未加入交聯(lián)劑的陰性對照樣品在594 nm激發(fā)波長下，Ni NTA Beads呈現(xiàn)紅色熒光(圖5c)，表明帶有His6標簽的mCherry已經(jīng)與Ni NTA Beads結(jié)合；未加入交聯(lián)劑的陰性對照樣品在488 nm激發(fā)波長下，并未呈現(xiàn)綠色熒光(圖5d)，表明去除標簽后的sGFP不再與Ni NTA Beads結(jié)合。5種交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品在594 nm、488 nm激發(fā)波長下，Ni NTA Beads均呈現(xiàn)雙熒光(黃色)(圖5e～i)，表明5種戊二醛交聯(lián)樣品均發(fā)生mCherry和sGFP的交聯(lián)反應(yīng)；并且隨著交聯(lián)濃度的增加，呈現(xiàn)紅色熒光的Ni NTA Beads數(shù)目減少，呈現(xiàn)雙熒光的Ni NTA Beads數(shù)目增多。6種交聯(lián)濃度的甲醛交聯(lián)樣品在594 nm、488 nm激發(fā)波長下，Ni NTA Beads均呈現(xiàn)雙熒光(黃色)(圖5j～o)，且當(dāng)交聯(lián)濃度大于0.5%后，呈現(xiàn)雙熒光Ni NTA Beads數(shù)目顯著增多(圖5k)，表明交聯(lián)濃度較高的甲醛交聯(lián)樣品的交聯(lián)效果較好。在較低交聯(lián)濃度下，戊二醛交聯(lián)樣品和甲醛交聯(lián)樣品Ni NTA Beads均可以呈現(xiàn)雙熒光(黃色)，表明，即使在較低交聯(lián)濃度下，2種交聯(lián)劑也可以使2種熒光蛋白發(fā)生交聯(lián)。

利用Cellsens Standard軟件對激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果進行分析，統(tǒng)計視野下Ni NTA Beads的總數(shù)以及呈現(xiàn)雙熒光的數(shù)目，并計算雙熒光Ni NTA Beads的占比，結(jié)果見表1。

表1 不同交聯(lián)濃度下，視野下Ni NTA Beads的總數(shù)、雙熒光數(shù)以及雙熒光Ni NTA Beads的占比

由表1可知，以戊二醛為交聯(lián)劑時，0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%交聯(lián)濃度下戊二醛交聯(lián)樣品中呈現(xiàn)雙熒光Ni NTA Beads的占比分別為47.4%、67.9%、95.6%、93.5%、93.9%；交聯(lián)濃度為1.0%、1.5%、2.0%時的交聯(lián)效果明顯優(yōu)于交聯(lián)濃度為0.5%、0.1%時的，其中交聯(lián)濃度為1.0%時的交聯(lián)效果最好，交聯(lián)效率最高。因此，后續(xù)實驗以戊二醛為交聯(lián)劑時，選擇交聯(lián)濃度為1.0%進行交聯(lián)。以甲醛為交聯(lián)劑時，0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%交聯(lián)濃度下甲醛交聯(lián)樣品中呈現(xiàn)雙熒光Ni NTA Beads的占比分別為37.5%、55.8%、85.0%、90.9%、86.7%、79.5%；交聯(lián)濃度為1.5%時的交聯(lián)效果最好，交聯(lián)效率最高。因此，后續(xù)實驗以甲醛為交聯(lián)劑時，選擇交聯(lián)濃度為1.5%進行交聯(lián)。

2.3.4 SDS-PAGE檢測交聯(lián)效果

采用SDS-PAGE檢測不同交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液和甲醛交聯(lián)樣品溶液的交聯(lián)效果，結(jié)果如圖6所示。

圖6 SDS-PAGE檢測不同交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液(a)和甲醛交聯(lián)樣品溶液(b)Fig.6 SDS-PAGE of cross-linking sample solution with different cross-linking concentrations by using glutaraldehyde(a) and formaldehyde(b) as cross-linking agents

由圖6a可以看出，與對照組相比，5種不同交聯(lián)濃度的戊二醛交聯(lián)樣品溶液均在55 kDa處顯示明顯特異條帶，證明戊二醛已經(jīng)促使溶液中的2種熒光蛋白發(fā)生交聯(lián)；此外，在100 kDa處存在特異條帶(圖6a中箭頭處)，這可能是因為戊二醛引起多個熒光蛋白發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生的。由圖6b可以看出，與對照組相比，6種不同交聯(lián)濃度的甲醛交聯(lián)樣品溶液均在52 kDa處附近出現(xiàn)特異條帶(圖6b中箭頭處)，證明甲醛已經(jīng)促使溶液中的2種熒光蛋白發(fā)生交聯(lián)。以上結(jié)果表明，即使在較低交聯(lián)濃度下，2種交聯(lián)劑也可以使熒光蛋白發(fā)生交聯(lián)，與激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果一致。

2.3.5 微量非等比例雙分子熒光蛋白交聯(lián)效果檢測

為了研究熒光蛋白溶液在微量非等比例下的交聯(lián)，并進一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察、交聯(lián)效率統(tǒng)計、Cellsens Standard軟件分析、Ni NTA Beads數(shù)目統(tǒng)計以及雙熒光Ni NTA Beads占比計算手段檢測交聯(lián)劑是否發(fā)揮作用的靈敏性，將一種熒光蛋白溶液加入量設(shè)計為1 μL，另一種熒光蛋白溶液加入量按照一定比例加入，分別以戊二醛和甲醛為交聯(lián)劑進行交聯(lián)，其激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖7所示。

圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察微量非等比例雙分子熒光蛋白交聯(lián)效果Fig.7 Visual observation of cross-linking effect of trace bimolecular fluorescent protein with non proportional concentrations by laser confocal microscope

由圖7a可以看出，以戊二醛為交聯(lián)劑，在sGFP蛋白溶液和mCherry蛋白溶液的比例為1∶3、總體積為4 μL的情況下，檢測到呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads，證明交聯(lián)已經(jīng)發(fā)生；隨著mCherry蛋白溶液濃度的增加，呈現(xiàn)紅色熒光的Ni NTA Beads數(shù)目不斷增多，并逐漸覆蓋被交聯(lián)的sGFP所發(fā)出的綠色熒光。

由圖7b可以看出，以甲醛為交聯(lián)劑時的熒光變化趨勢與以戊二醛為交聯(lián)劑時(圖7a)相似，在sGFP蛋白溶液和mCherry蛋白溶液的比例為1∶3、1∶9、1∶15的情況下，檢測到呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads，證明交聯(lián)已經(jīng)發(fā)生；但隨著mCherry蛋白溶液濃度的繼續(xù)增加，無法檢測到呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads。

由圖7c可以看出，以戊二醛為交聯(lián)劑，mCherry蛋白溶液加入量為1 μL，隨著sGFP蛋白溶液濃度的增加，呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads數(shù)目逐漸減少，Ni NTA Beads上激發(fā)發(fā)出的綠色熒光顯著增強。

由圖7d可以看出，以甲醛為交聯(lián)劑時的熒光變化趨勢與以戊二醛為交聯(lián)劑時(圖7c)相似，隨著sGFP蛋白溶液濃度的增加，呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads數(shù)目逐漸減少，Ni NTA Beads上激發(fā)發(fā)出的綠色熒光顯著增強。

利用Cellsens Standard軟件對激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果進行分析，統(tǒng)計視野下Ni NTA Beads的總數(shù)以及呈現(xiàn)雙熒光的數(shù)目，并計算雙熒光Ni NTA Beads的占比，結(jié)果見表2。

表2 微量非等比例條件下，視野下Ni NTA Beads的總數(shù)、雙熒光數(shù)以及雙熒光Ni NTA Beads的占比

由表2可知，在條件a下，呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads占比從最高的37.5%逐漸降低，到1∶21時已經(jīng)無法檢測出sGFP發(fā)出的綠色熒光，整體表現(xiàn)為雙熒光的Ni NTA Beads占比隨mCherry濃度的增加而降低。在條件c下，呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads占比由1∶3時的40.0%降至1∶27時的3.0%。表明，采用本技術(shù)檢測交聯(lián)劑在熒光蛋白質(zhì)交聯(lián)中的作用具有較好的靈敏性與穩(wěn)定性，為利用該技術(shù)篩選其它化學(xué)交聯(lián)劑提供了證據(jù)支持。

2.4 討論

本研究利用紅色熒光蛋白mCherry和高可溶性綠色熒光蛋白sGFP，通過His6標簽與Ni NTA Beads吸附結(jié)合，基于mCherry和sGFP熒光蛋白交聯(lián)樣品在594 nm和488 nm激發(fā)波長下，固體介質(zhì)Ni NTA Beads會呈現(xiàn)雙熒光即黃色熒光的特性，設(shè)計開發(fā)了激光共聚焦顯微鏡觀察、交聯(lián)效率評估技術(shù)體外檢測蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)中的化學(xué)交聯(lián)劑。相較于SDS-PAGE傳統(tǒng)檢測手段，可實現(xiàn)簡便、快速、高效地在體外篩選化學(xué)交聯(lián)劑。

本研究成功克隆帶有His6的mCherry基因原核表達重組質(zhì)粒，并對mCherry和sGFP兩種熒光蛋白進行誘導(dǎo)表達純化，以獲取純化后的mCherry與無任何蛋白標簽的sGFP。在最佳交聯(lián)濃度優(yōu)化和交聯(lián)效果直觀化檢測中，由于sGFP蛋白不含有His6標簽，故其能夠吸附于Ni NTA Beads，依賴于交聯(lián)劑的交聯(lián)作用。而隨著交聯(lián)作用的增強，離心后收集到的交聯(lián)溶液中sGFP含量會隨之減少，植物影像儀所檢測到的熒光強度也隨之降低。以戊二醛作為交聯(lián)劑時，sGFP熒光強度出現(xiàn)最低值是在交聯(lián)濃度為1.0%時；用激光共聚焦顯微鏡也能觀察到每組樣品均存在呈現(xiàn)雙熒光(黃色)的Ni NTA Beads，證明每一組交聯(lián)濃度均已發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，且交聯(lián)濃度為1.0%時交聯(lián)效果非常明顯，交聯(lián)效率最高。以甲醛作為交聯(lián)劑時，sGFP熒光強度出現(xiàn)最低值是在交聯(lián)濃度為1.5%時；同樣用激光共聚焦顯微鏡也能觀察到交聯(lián)濃度為1.5%時交聯(lián)效果顯著且交聯(lián)效率較高。這證明，激光共聚焦顯微鏡觀察、交聯(lián)效率評估技術(shù)在直觀快速檢測蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)中的化學(xué)交聯(lián)劑可能具有一定的普遍適用性。

傳統(tǒng)檢測手段SDS-PAGE法的檢測結(jié)果也表明，戊二醛和甲醛可促使mCherry和sGFP熒光蛋白發(fā)生交聯(lián)，進一步驗證激光共聚焦顯微鏡觀察、交聯(lián)效率評估技術(shù)的真實準確性。SDS-PAGE法是檢測蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)中化學(xué)交聯(lián)劑的主要手段，該方法需要經(jīng)過制膠、煮樣、電泳、染色、脫色等步驟，過程較為繁瑣復(fù)雜。而本研究開發(fā)的激光共聚焦顯微鏡觀察、交聯(lián)效率評估技術(shù)可以在制備交聯(lián)樣品后利用激光共聚焦顯微鏡對交聯(lián)結(jié)果進行直觀化觀察，具有簡便、快速、高效的特點，在體外高通量初步篩選化學(xué)交聯(lián)劑方面具有潛在的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

分別以戊二醛和甲醛為交聯(lián)劑，以Ni NTA Beads為固體介質(zhì)，利用mCherry和sGFP進行交聯(lián)反應(yīng)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察檢測固體介質(zhì)上雙熒光強弱來判斷交聯(lián)效果并對交聯(lián)效率進行評估，開發(fā)了一種快速、簡便、高通量的體外初步篩選化學(xué)交聯(lián)劑的熒光直觀化檢測新方法。結(jié)果表明：以戊二醛為交聯(lián)劑時，最佳交聯(lián)濃度為1.0%，交聯(lián)效果顯著，交聯(lián)效率為95.6%；以甲醛為交聯(lián)劑時，最佳交聯(lián)濃度為1.5%，交聯(lián)效果明顯，交聯(lián)效率為90.9%。通過激光共聚焦顯微鏡觀察及交聯(lián)效率評估，可以直觀地檢測到戊二醛、甲醛均使等比例mCherry和sGFP發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，與傳統(tǒng)檢測技術(shù)SDS-PAGE法的檢測結(jié)果一致；并且對于戊二醛、甲醛作為交聯(lián)劑的微量非等比例熒光蛋白的交聯(lián)反應(yīng)，同樣可以直觀地檢測到交聯(lián)效果。該研究為體外檢測熒光蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)中的化學(xué)交聯(lián)劑的研究提供了一個簡便、高效的直觀化技術(shù)手段，同時也為體外初步大量快速篩選蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)化學(xué)交聯(lián)劑提供了技術(shù)可行性。