組蛋白去乙?；敢种苿┡cPD98059綴合物對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的療效研究

張良，陳娜，付昱，鄭亮，肖婧，陳柳青

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是源于皮膚組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤，是全世界范圍內(nèi)常見的皮膚癌［1］。目前對(duì)于不能手術(shù)治療的SCC 患者常采用順鉑、5-氟尿嘧啶等化療藥進(jìn)行治療，但這些藥物會(huì)引起糖代謝紊亂等嚴(yán)重不良反應(yīng)［2］。因此，開發(fā)有效、安全的靶向藥物是當(dāng)前SCC診療領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。最近一項(xiàng)關(guān)于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性頭頸鱗狀細(xì)胞癌治療的Ⅱ期臨床試驗(yàn)研究表明，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑丙戊酸聯(lián)合順鉑和西妥昔單抗對(duì)其有良好的治療效果［3］。但是，不同藥物之間存在藥代動(dòng)力學(xué)差異，使得這種“雞尾酒”療法中的藥物難以共同發(fā)揮各自的最佳療效［4］。因此，將多個(gè)藥物拼接成一個(gè)單一的藥物分子來治療腫瘤已是當(dāng)前藥物研發(fā)領(lǐng)域的重點(diǎn)方向［5］。2-（2-氨基-3-甲氧苯基）色酮（PD98059）是絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷劑，可抑制包括SCC在內(nèi)的多種腫瘤的生長(zhǎng)［6］。目前有關(guān)PD98059聯(lián)合其他藥物治療SCC的研究尚少見。本研究將HDAC抑制劑伏立諾他（SAHA）與PD98059偶聯(lián)構(gòu)建單一結(jié)構(gòu)的綴合物（SAHA-PD9805），并在細(xì)胞和動(dòng)物模型上評(píng)價(jià)其抗SCC活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) BALB/c 裸鼠 56 只，4～5 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～24 g，平均（21.0±3.4）g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由攝水、食物，自由光照，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%；本研究經(jīng)武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人皮膚鱗癌細(xì)胞A431、HSC-5、Colo16、SCC-12 和人正常皮膚細(xì)胞TE353.sk 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，由本實(shí)驗(yàn)室凍存使用。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 PD98059（WXCD00602105）、8-氯-8-氧代辛酸甲酯（385565-1G）、鹽酸羥胺（A46614）購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司；HDAC試劑盒（K330-100）購(gòu)自艾美捷科技有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 XT4 型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（溫度未校正）購(gòu)自北京市科儀電光儀器廠；BrukerAM-400 Hz 型磁共振儀（CDCl3或DMSO-d6為溶劑，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)）購(gòu)自瑞士Bruker公司；ELx800型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 中間體1 的制備 氬氣保護(hù)下，將PD98059（1.336 g，5 mmol）、8-氯-8-氧代辛酸甲酯（2.067 g，10 mmol）溶解加入到乙腈（60 mL）中，冰浴下滴加三乙胺（2.8 mL，20 mmol），室溫反應(yīng)12 h 后，減壓脫去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱純化（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，V/V），得1.273 g淺黃色固體，產(chǎn)率58.2%；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.05（d，J=8.0 Hz，1H），7.83～7.87（m，1H），7.76（t，J=7.6 Hz，1H），7.67～7.70（m，1H），7.07（d，J=8.0 Hz，1H），6.96（d，J=8.0 Hz，1H），6.71（t，J=8.0 Hz，1H），6.55（s，1H），3.84（s，3H），3.62（s，3H），2.20～2.27（m，4H），1.58～1.68（m，4H），1.27～1.32（m，4H）。

1.2.2 目標(biāo)綴合物SAHA-PD98059的制備 氬氣保護(hù)下，將中間體1（1.224 g，2.8 mmol）溶解加入無水四氫呋喃（10 mL）中，冰浴下加入氫氧化鉀（0.236 g，4.2 mmol）和新配置的羥胺溶液，室溫反應(yīng)1 h后，減壓脫去溶劑，向殘留物中加入10 mL蒸餾水，用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH=7，加入乙酸乙酯進(jìn)行萃?。ㄝ腿? 次，每次加入25 mL），有機(jī)層用無水Na2SO4干燥，減壓脫去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱純化（二氯甲烷∶甲醇=12∶1，V/V），得591 mg淺黃色固體，產(chǎn)率48.1%。新羥胺溶液的制備如下：將鹽酸羥胺（2.919 g，42 mmol）、氫氧化鉀（2.353 g，42 mmol）溶解到25 mL 甲醇中，反應(yīng)液加熱至40 ℃反應(yīng)15 min后，析出大量的沉淀，經(jīng)過濾得到的濾液即為新鮮的羥胺溶液。

1.2.3 HDAC活性抑制測(cè)試 使用HDAC熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)試綴合物SAHA-PD98059 對(duì)HDAC 活性的抑制作用，以SAHA為陽(yáng)性對(duì)照藥。按照試劑盒操作說明書，在96孔測(cè)試板中加入血清白蛋白（BSA）、HDAC 熒光底物、HDAC 酶（HeLa 細(xì)胞核提取物）和不同濃度梯度（1×104、1×103、1×102、10、1、0.1、1×10-2nmol/L）的綴合物SAHA-PD98059。將測(cè)試板在37 ℃下反應(yīng)30 min 后，每孔再加入HDAC 緩沖液，于37 ℃下繼續(xù)放置15 min，使用酶標(biāo)儀在359 nm 和440 nm 波長(zhǎng)測(cè)定每孔的熒光強(qiáng)度，計(jì)算半抑制濃度（IC50）。

1.2.4 分子模擬 從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載HDAC（PDB code：1ZZ1）［7］的結(jié)構(gòu)。通過 ChemBio 3D ultra 14.0 和Autodock 4.2D 中的Ligand 模塊進(jìn)行小分子結(jié)構(gòu)的預(yù)處理。對(duì)接軟件使用Autodock 4.2D，利用晶體結(jié)構(gòu)中的配體定義口袋盒子，對(duì)接盒子邊長(zhǎng)設(shè)置為30 ?，使用半經(jīng)驗(yàn)自由能進(jìn)行評(píng)價(jià)，拉馬克遺傳算法循環(huán)100 次，其余參數(shù)保持默認(rèn)，進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果使用PyMOL1.8.6進(jìn)行繪圖。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng) A431、HSC-5、Colo16、SCC-12和TE353.sk細(xì)胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，濕度為95%。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 體外抗增殖作用實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度約為8×103個(gè)/孔，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL 不同濃度的待測(cè)綴合物SAHA-PD98059，并以SAHA和PD98059為陽(yáng)性對(duì)照，而空白組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育3 d，每孔再加入25 μL 5-［3-（羧基甲氧基）苯基］-3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內(nèi)鹽（MTS）溶液，繼續(xù)孵育4 h，在波長(zhǎng)為490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔光密度（OD）值，計(jì)算抑制率（I）=［1-（OD1-OD0）（/OD2-OD0）］×100%。其中OD0為空白孔OD值，OD1為加藥組細(xì)胞OD值，OD2為不加藥的對(duì)照組細(xì)胞OD值。

1.2.7 急性毒性實(shí)驗(yàn) 為探討綴合物SAHA-PD98059 在動(dòng)物體內(nèi)的毒性，按照文獻(xiàn)［8］的方法，選取4～5周齡的裸鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5個(gè)不同的給藥劑量組，給藥劑量分別為346.4、457.1、603.9、798.0、1 054.4 mg/kg，每組8只，雌雄各半，于灌胃給藥后1 h、5 h、第4天、第5～18天觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的存活狀態(tài)，并通過寇氏法［8］計(jì)算出綴合物SAHAPD98059的半數(shù)致死量（LD50）及LD50的95%可信區(qū)間。

1.2.8 體內(nèi)抗增殖作用實(shí)驗(yàn) 根據(jù)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇A431 細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物模型，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)綴合物SAHA-PD98059的體內(nèi)抗人皮膚鱗癌能力。將A431細(xì)胞接種到4～5周齡的BALB/c 裸鼠左側(cè)肩部皮下（每只100 μL，5×106細(xì)胞），待腫瘤體積大小為80 mm3后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為SAHA-PD98059組、SAHA組、PD98059組和空白對(duì)照組，每組4 只，雌雄各半，將綴合物SAHA-PD98059、SAHA和PD98059用聚乙烯蓖麻油∶DMSO∶PBS（1∶1∶8）溶解后進(jìn)行灌胃給藥。SAHA-PD98059 組、SAHA 組和PD98059組的給藥劑量均為25 mg（/kg·d），其中空白對(duì)照組給予等體積的溶劑（聚乙烯蓖麻油∶DMSO∶PBS=1∶1∶8），連續(xù)給藥18 d。每隔2 d 稱量實(shí)驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量，計(jì)算小鼠體質(zhì)量變化率=Mn/M0×100%，其中M0為給藥治療前小鼠的體質(zhì)量（g），Mn為給藥第n天小鼠的體質(zhì)量（g）。測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、寬，計(jì)算腫瘤體積（V，mm3）=a×b2/2，其中a為腫瘤的最長(zhǎng)徑（mm），b為腫瘤的最短徑（mm）。在治療18 d后，取出腫瘤并稱量質(zhì)量。

1.2.9 HE染色觀察小鼠主要器官的病理學(xué)變化 空白對(duì)照組和SAHA-PD98059 組小鼠在給藥治療結(jié)束后通過頸椎脫臼法將其處死，取下心、腦、肝、脾、腎，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后用石蠟包埋，切片厚度為5 μm。按照HE 試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行染色，于倒置顯微鏡下對(duì)組織形態(tài)進(jìn)行觀察，掃描拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，不同時(shí)點(diǎn)組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 綴合物SAHA-PD98059 的制備與表征 綴合物SAHA-PD98059 按照?qǐng)D1 路線進(jìn)行合成。首先，通過親核取代反應(yīng)制得中間體1，然后用羥胺將中間體1的甲酯轉(zhuǎn)化成肟酸制得了目標(biāo)綴合物SAHAPD98059，其結(jié)構(gòu)通過氫質(zhì)子磁共振波譜進(jìn)行了確證：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（s，1H），9.41（s，1H），8.70（s，1H），8.06（d，J=8.4 Hz，1H），7.80～7.84（m，1H），7.78（t，J=8.0 Hz，1H），7.48（d，J=8.0 Hz，1H），7.08（d，J=8.0 Hz，1H），7.02（d，J=7.6 Hz，1H），6.68（t，J=8.4 Hz，1H），6.54（s，1H），3.87（s，3H），2.22（t，J=6.8 Hz，2H），1.96（t，J=6.4 Hz，2H），1.48～1.54（m，4H），1.26～1.31（m，4H）。

Fig.1 Synthetic route of conjugate SAHA-PD98059圖1 SAHA-PD98059綴合物的合成路線

2.2 綴合物SAHA-PD98059 對(duì)HDAC 的抑制活性 綴合物SAHA-PD98059抑制HDAC的量效曲線見圖2，其IC50為（142.9±1.2）nmol/L。

Fig.2 Dose-response curves of conjugate SAHA-PD98059 against HDAC圖2 綴合物SAHA-PD98059抑制HDAC的量效曲線

2.3 綴合物SAHA-PD98059 與HDAC 相互作用的分子對(duì)接 綴合物SAHA-PD98059與SAHA均采用了最佳的結(jié)合結(jié)構(gòu)與HDAC 的活性口袋相結(jié)合。SAHA 在HDAC 活性口袋中能夠與氨基酸殘基H142、H143和T312形成氫鍵，同時(shí)其肟酸基團(tuán)也均與鋅離子進(jìn)行了螯合。綴合物SAHA-PD98059 在HDAC 活性口袋中也與氨基酸殘基H142 和T312 形成氫鍵作用，因此綴合物SAHA-PD98059 對(duì)HDAC有較強(qiáng)的抑制活性。進(jìn)一步分析對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管綴合物SAHA-PD98059 未與H143 形成氫鍵作用（圖3A），但是與另外一個(gè)氨基酸殘基G151 形成了氫鍵（圖3B）。

Fig.3 Docked complexes of SAHA and SAHA-PD98059 bound to HDAC圖3 SAHA和綴合物SAHA-PD98059與HDAC分子對(duì)接結(jié)果

2.4 綴合物SAHA-PD98059 的體外抗增殖作用結(jié)果 與母體化合物PD98059 及SAHA 相比，綴合物 SAHA-PD98059 對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞 A431、HSC-5、Colo16和SCC-12的抗增殖作用均更強(qiáng)，其中綴合物SAHA-PD98059 對(duì)A431 細(xì)胞的抗增殖作用最強(qiáng)。此外，綴合物SAHA-PD98059 抑制人正常皮膚細(xì)胞TE353.sk 的 IC50＞100 μmol/L，表明其基本無毒性。見表1。

Tab.1 Anti-proliferative activity of conjugate PD98059-SAHA表1 綴合物PD98059-SAHA的抗增殖作用（n=3，）

Tab.1 Anti-proliferative activity of conjugate PD98059-SAHA表1 綴合物PD98059-SAHA的抗增殖作用（n=3，）

＊P＜0.05；a與PD98059組比較，b與SAHA組比較，P＜0.05

組別PD98059組SAHA組PD98059-SAHA組F IC50（μmol/L）A431 11.1±2.0 9.6±1.5 1.7±0.2ab 37.141＊HSC-5 15.7±1.4 10.3±1.2a 6.8±0.7ab 47.823＊Colo16 14.8±1.2 8.1±0.9a 5.3±0.5ab 92.580＊SCC-12 17.5±1.6 11.7±1.2a 9.3±1.2ab 29.799＊TE353.sk＞100＞100＞100-

2.5 綴合物SAHA-PD98059 的急性毒性結(jié)果 當(dāng)給予實(shí)驗(yàn)小鼠346.4 mg/kg 劑量時(shí)，在18 d 內(nèi)全部存活；而當(dāng)給予大劑量1 054.4 mg/kg時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠全部死亡，見表2。根據(jù)不同劑量組的小鼠死亡情況，計(jì)算綴合物 PD98059-SAHA 的 LD50為 647.5 mg/kg，其95%的可信區(qū)間為435.1～970.4 mg/kg。

Tab.2 Acute toxicity of conjugate PD98059-SAHA in mice表2 綴合物PD98059-SAHA的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（例）

2.6 體內(nèi)抗腫瘤活性

2.6.1 體質(zhì)量變化率 組內(nèi)比較：PD98059 組給藥6～15 d時(shí)體質(zhì)量變化率高于給藥0、3 d，給藥18 d時(shí)體質(zhì)量變化率高于0～12 d（P＜0.05）；SAHA 組給藥9～15 d時(shí)體質(zhì)量變化率高于給藥0、3 d，給藥18 d時(shí)體 質(zhì)量 變 化 率 高于 0～12 d（P＜0.05）；SAHAPD98059組給藥后不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量變化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組間比較：給藥 18 d 時(shí)，SAHA-PD98059 組體質(zhì)量變化率均低于空白對(duì)照組、PD98059組和SAHA組（P＜0.05），其余時(shí)點(diǎn)各組間體質(zhì)量變化率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Average weight changes in mice after drug treatment表3 給藥后不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠體質(zhì)量變化率的比較 （n=4，%，）

Tab.3 Average weight changes in mice after drug treatment表3 給藥后不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠體質(zhì)量變化率的比較 （n=4，%，）

＊P＜0.05；F組間=4.676，P＞0.05；F時(shí)間=15.830，P＜0.05；F交互=0.583，P＞0.05；組間比較：a與空白對(duì)照組比較，b與PD98059組比較，c與SAHA組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 d比較，B與3 d比較，C與6 d比較，D與9 d比較，E與12 d比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組PD98059組SAHA組SAHA-PD98059組F 0 d 100.0±3.1 100.0±1.3 100.0±2.9 100.0±3.0 0.480 3 d 101.6±3.1 101.9±1.2 101.9±2.7 102.0±2.2 0.769 6 d 103.0±3.3 103.6±2.1AB 104.6±2.6 104.4±1.8 0.809 9 d 104.3±3.5 104.8±1.6AB 105.6±1.2AB 103.6±2.3 0.898 12 d 104.8±4.0 105.0±1.2AB 105.9±1.1AB 104.1±2.4 0.711 15 d 106.7±3.6A 106.2±1.1AB 107.5±2.1AB 103.6±2.8 0.959 18 d 108.4±3.4AB 108.1±1.2ABCDE 108.9±2.2ABCDE 104.2±2.6abc 3.724＊F 2.702＊14.038＊7.602＊1.728

2.6.2 腫瘤體積 各組小鼠腫瘤體積均隨給藥時(shí)間呈基本增大趨勢(shì)（P＜0.05）。給藥0、3 d 時(shí)，各組腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥6～18 d時(shí)，PD98059 組、SAHA 組和 PD98059-SAHA 組腫瘤體積均低于空白對(duì)照組，PD98059-SAHA 組腫瘤體積低于PD98059組和SAHA組（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Average tumor volume changes in mice after drug treatment表4 給藥后各組小鼠腫瘤體積的變化 （n=4，mm3，）

Tab.4 Average tumor volume changes in mice after drug treatment表4 給藥后各組小鼠腫瘤體積的變化 （n=4，mm3，）

＊P＜0.05；F組間=98.577，F(xiàn)時(shí)間=178.818，F(xiàn)交互=12.476，均P＜0.01；組間比較：a與空白對(duì)照組比較，b與PD98059組比較，c與SAHA組比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與0 d比較，B與3 d比較，C與6 d比較，D與9 d比較，E與12 d比較，F(xiàn)與15 d比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組PD98059組SAHA組PD98059-SAHA組F給藥時(shí)間0 d 85.7±4.1 86.2±7.1 86.3±8.9 85.4±7.5 0.010 3 d 160.1±15.8A 155.6±26.9A 152.8±22.8A 137.6±7.9A 0.729 6 d 288.5±38.4AB 205.8±20.4ABa 198.9±19.9ABa 157.9±11.3ABabc 14.923＊9 d 390.6±45.3ABC 294.6±47.3ABCa 282.8±45.9ABCa 180.0±20.4ABabc 13.071＊12 d 608.9±113.5ABCD 382.8±67.6ABCa 367.4±63.9ABCa 200.9±24.9ABCabc 15.220＊15 d 823.9±108.9ABCD 539.4±80.4ABCDEa 515.8±69.5ABCDEa 243.1±33.4ABCDabc 27.828＊18 d 1 000.5±138.7ABCDE 711.3±55.1ABCDEFa 686.9±52.4ABCDEFa 309.1±49.8ABCDEabc 35.077＊F 51.876＊59.623＊64.865＊22.871＊

2.6.3 腫瘤質(zhì)量 治療18 d 后，空白對(duì)照組、SAHA組、PD98059 組和SAHA-PD98059 組小鼠腫瘤質(zhì)量（mg）分別為 1 259.5±60.9、693.5±12.4、657.1±5.9 和253.8±18.8（n=4，F(xiàn)=78.317，P＜0.05）。其中 SAHA組和PD98059 組低于空白對(duì)照組，SAHA-PD98059組較其他3組均低（均P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Tumors in mice after 18 days of drug treatment圖4 治療18 d后小鼠的腫瘤

2.7 HE染色觀察小鼠主要器官的病理學(xué)改變 與空白對(duì)照組相比，SAHA-PD98059 組心、腦、肝、脾、腎均無明顯病理變化；心臟的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；腦神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；肝臟的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；脾的淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；腎臟中腎單位細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，見圖5。

Fig.5 The pathological changes of main organs of A431 tumor-bearing mice observed by HE staining(×400)圖5 HE染色觀察A431荷瘤鼠主要器官病理改變（×400）

3 討論

HDAC 是參與表觀遺傳調(diào)控的蛋白酶家族，在染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［9-10］。大量研究表明，在 SCC［11］、乳腺癌［12］、肝癌［13］等多種腫瘤組織中均存在HDAC異常高表達(dá)的現(xiàn)象，HDAC是腫瘤治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。HDAC抑制劑通過阻斷HDAC 的功能，影響基因表達(dá)和細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；此外，HDAC 抑制劑還能抑制腫瘤血管生成，導(dǎo)致腫瘤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，從而抑制腫瘤增殖［14］。目前已有多個(gè)HDAC 抑制劑被批準(zhǔn)用于癌癥治療，例如FK228被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療外周T 細(xì)胞淋巴瘤；西本達(dá)胺被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)及難治性外周T 細(xì)胞淋巴瘤等［7，15-16］。有研究報(bào)道，將HDAC 抑制劑與雌激素受體［17］、Janus 激酶［18］、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體［19］等靶向藥物偶聯(lián)制成多靶點(diǎn)抑制劑較單靶點(diǎn)藥物具有更好的抗腫瘤效果。Thakur等［20］將HDAC 與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制劑偶聯(lián)成單一分子后對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病具有良好的療效，且對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性。

有研究表明，HDAC 抑制劑在與HDAC 蛋白相互作用時(shí)，HDAC抑制劑結(jié)構(gòu)中的表面識(shí)別區(qū)（Cap）基團(tuán)僅占據(jù)了HDAC 活性口袋的一小部分，若使用一些空間位阻較大基團(tuán)取代HDAC抑制劑的Cap，可增強(qiáng)其與HDAC 蛋白的相互作用，明顯提高其對(duì)HDAC 活性的抑制作用［21］。本研究通過將PD98059引入到HDAC 抑制劑SAHA 上，擬得到對(duì)HDAC 和SCC 抑制活性較SAHA 與PD98059 更強(qiáng)的綴合物SAHA-PD98059。有研究顯示，先導(dǎo)化合物SAHA抑制HDAC的IC50為196.0 nmo/L［22］，而本研究結(jié)果顯示綴合物SAHA-PD98059 的IC50為（142.9±1.2）nmo/L。通過分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，SAHA-PD98059 抑制HDAC 的IC50較低的可能原因是其在HDAC 酶活性口袋中形成了一個(gè)新氫鍵。這個(gè)新氫鍵是與氨基酸殘基G151形成了氫鍵，而該氫鍵作用對(duì)配體的抑制活性至關(guān)重要［23］。此外，與SAHA的苯環(huán)相比，綴合物SAHA-PD98059 具有更大的帽子結(jié)構(gòu)（PD98059基團(tuán)），增強(qiáng)了其與HDAC 活性口袋的相互作用，從而提高了其對(duì)HDAC活性的抑制作用［24］。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與母體化合物PD98059及SAHA相比，綴合物SAHA-PD98059對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞A431、HSC-5、Colo16和SCC-12的抗增殖作用均更強(qiáng)，其中綴合物SAHA-PD98059 對(duì)A431 細(xì)胞的抗增殖作用最強(qiáng)。此外，綴合物SAHA-PD98059 抑制人正常皮膚細(xì)胞TE353.sk 的 IC50＞100 μmol/L，表明其基本無毒性。進(jìn)一步體內(nèi)急性毒性及抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，綴合物SAHA-PD98059 對(duì)小鼠的LD50高達(dá)647.5 mg/kg；在A431荷瘤鼠中，與母體化合物PD98059和SAHA 相比，綴合物SAHA-PD98059 可顯著抑制腫瘤體積以及質(zhì)量的增長(zhǎng)。HE染色亦顯示，綴合物SAHA-PD98059對(duì)心、腦、肝、脾、腎等主要器官均無明顯毒性。綜上，綴合物SAHA-PD98059 用于治療SCC 安全有效，且其效果強(qiáng)于單一使用SAHA 或PD98059。