正交試驗(yàn)優(yōu)選蛇莓總酚酸提取工藝

趙鴻賓，劉曉夢(mèng)，韓忠耀，李雪營(yíng)，魏學(xué)軍，張林甦*，余躍生

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558013；2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000)

蛇莓為薔薇科蛇莓屬植物蛇莓(Duchesneaindica(Andr) Focke )的全草，別名“三匹風(fēng)”“地莓”“一點(diǎn)紅”“蛇含草”[1]，為民間常用草藥。蛇莓性寒，味甘、苦，有小毒，入肺、肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散瘀、收斂止血、涼血之功效，用于治療熱病驚癇、咽喉腫痛、咳嗽吐血、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、濕疹、痢疾及燙火傷等[2-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)蛇莓不僅具有抑菌活性和抗氧化作用，而且具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗誘變活性，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[4-10]。在臨床上，蛇莓常與其他中藥配伍用來(lái)治療婦科炎癥和腫瘤[11]，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌和子宮肌瘤等。

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，蛇莓水提取物抗腫瘤活性顯著，且水提物中酚酸類成分活性較強(qiáng)[12-16]。然而近年對(duì)于蛇莓總酚酸提取工藝未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究以酚酸類成分的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)蛇莓中酚酸類成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期促進(jìn)民間常用草藥的研究與開發(fā)，同時(shí)也為蛇莓產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材與試劑

蛇莓：采自黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校沙木湖校區(qū)附近山坡和荒地，經(jīng)魏學(xué)軍教授鑒定為薔薇科蛇莓屬植物Duchesneaindica(Andr) Focke的干燥全草。

試劑：沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201605)；十二烷基磺酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180919)；鐵氰化鉀(成都金山化學(xué)試劑有限公司)；三氯化鐵(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙醇均為分析純，蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制雙重蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent Cary 100型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京安捷倫公司)，奧豪斯DV215CD型分析天平(奧豪斯儀器有限公司)，電熱恒溫干燥箱、電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

精密稱取蛇莓藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，精密加入一定體積的不同濃度的乙醇溶液，精密稱定其總質(zhì)量，在一定溫度的水浴中加熱回流提取1～2.5 h。待提取液冷卻后稱重并補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，即得。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

精密稱定沒(méi)食子酸對(duì)照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解至刻度，得到濃度為0.10 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 總酚酸含量測(cè)定

2.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密量取0.10 mg/mL的沒(méi)食子酸儲(chǔ)備液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，分別精密量取0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL至25 mL容量瓶中，各加甲醇5.0 mL，0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2.0 mL，0.06%的鐵氰化鉀-0.9%的三氯化鐵溶液(1∶1)混合溶液1.0 mL，搖勻，暗處放置5 min。加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，搖勻，在暗處放置20 min。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)某一濃度供試液進(jìn)行全波長(zhǎng)(400～900 nm)掃描。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得到吸收曲線，確定745 nm為最大吸收波長(zhǎng)。然后在745 nm波長(zhǎng)下測(cè)定剩余供試液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度(μg/mL)橫坐標(biāo)，得回歸方程：Y=0.552 2X+0.315 6，R2=0.998 6。數(shù)據(jù)表明沒(méi)食子酸濃度在0.04～0.48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密量取0.10 mg/mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液6份，每份1.00 mL，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色處理，在745 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.2%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取蛇莓干燥粉末6份，每份1.0 g，分別置于錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，80 ℃水浴回流提取2 h。待提取液冷卻后稱重，補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾。取續(xù)濾液按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測(cè)定其吸光度。RSD=1.6%，說(shuō)明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取1.0 g蛇莓干燥粉末，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，取續(xù)濾液分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測(cè)定其吸光度。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.2%，結(jié)果表明蛇莓提取液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.4 總酚酸提取工藝優(yōu)化

2.4.1 液固比 精密稱取蛇莓干燥粉末15份，每份1.0 g，分成5組，每組平行3份，各組分別按照液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入70%乙醇，于80 ℃水浴加熱回流提取2 h。待提取液冷卻后稱重，補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾。取續(xù)濾液按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總酚酸提取率。所得數(shù)據(jù)滿足方差齊性要求，均值依次為1.98%、2.67%、2.95%、3.12%、3.15%，單因素方差分析結(jié)果表明組間差異顯著。總酚酸提取率隨著液固比變化如圖1(a)所示：液固比在30∶1以上，總酚酸提取率較高。

2.4.2 乙醇濃度 按“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組方法，各組均按照液固比20∶1分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液，于80 ℃水浴加熱回流提取2 h。按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行后續(xù)處理，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總酚酸提取率?？偡铀岬奶崛÷示捣謩e為2.45%、3.01%、2.85%、2.38%、1.87%，各測(cè)定結(jié)果均符合方差分析要求，且組間差異顯著?？偡铀崽崛÷孰S著乙醇濃度的變化如圖1(b)所示：乙醇濃度為60%時(shí)，總酚酸提取率較高。

2.4.3 提取溫度 按“2.4.1”項(xiàng)下分組方法，各組均按照液固比20∶1加入60%乙醇，分別于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴加熱回流提取2 h。按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行后續(xù)處理，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總酚酸提取率均值分別為2.76%、2.98%、3.16%、2.93%、2.71%，結(jié)果如圖1(c)所示：在80 ℃水浴條件下，總酚酸的提取率達(dá)到2.08%。數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析，組間差異顯著。

2.4.4 提取時(shí)間 按“2.4.1”項(xiàng)下分組方法，各組均按照液固比20∶1加入60%乙醇，于80 ℃水浴加熱回流提取，各組提取時(shí)間按照30 min、60 min、90 min、120 min、150 min進(jìn)行，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行后續(xù)處理，測(cè)定其吸光度，計(jì)算總酚酸提取率均值分別2.11%、2.58%、2.93%、3.04%、2.65%，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析顯示，組間差異顯著。結(jié)果如圖1(d)所示：提取時(shí)間為120 min時(shí)總酚酸提取率最佳。

圖1 液固比、乙醇濃度、加熱溫度、提取時(shí)間對(duì)總酚酸提取率的影響

2.4.5 提取次數(shù) 按“2.4.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法，精密稱取蛇莓干燥粉末3份，每份1.0 g，按照液固比20∶1加入60%乙醇，于80 ℃水浴加熱回流提取120 min，待提取液冷卻后稱重，補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾。將過(guò)濾后的濾渣同法提取第2、3次，分別按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行后續(xù)處理，測(cè)定其吸光度，分別計(jì)算總酚酸提取率。第1、2、3次的提取率分別為2.1%、0.84%、0.51%，第2、3次提取率明顯降低，從節(jié)約資源和縮短生產(chǎn)周期的角度考慮，選擇提取1次為宜。

2.4.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素方差分析可知，液固比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間均對(duì)總酚酸提取率有顯著影響，且組間差異顯著，由此確定正交試驗(yàn)的因素和水平。L9(34)正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.4.7 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 按照L9(34)正交試驗(yàn)表依次進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次。試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。由表3方差分析可知，固液比(A)對(duì)總酚酸提取率影響極其顯著(P<0.01)，乙醇濃度(B)對(duì)總酚酸提取率影響顯著(P<0.05)，而提取溫度(C)和提取時(shí)間(D)影響不顯著(P>0.05)，各因素影響程度依次為：A>B>C>D。優(yōu)化工藝參數(shù)為A3B2C2D2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.4.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳條件下，對(duì)蛇莓總酚酸進(jìn)行5次平行提取試驗(yàn)，平均提取率為3.75%，RSD=1.41%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)4因素3水平9次正交試驗(yàn)得到優(yōu)選的總酚酸工藝參數(shù)為液固比40∶1，乙醇濃度(V/V)60%，提取時(shí)間120 min，提取1次。按照優(yōu)選的工藝參數(shù)平行提取5次，平均提取率為3.75%，RSD=1.41%，說(shuō)明此工藝合理可行。

蛇莓作為貴州少數(shù)民族地區(qū)常用藥材，臨床應(yīng)用廣泛，其活性成分種類較多，尤其是黃酮類和酚酸類活性較強(qiáng)。但考慮到中草藥的習(xí)慣用法是水煎法，其活性成分并不能有效提取，造成資源浪費(fèi)。各類活性成分的藥理作用也不盡相同，分別提取單一成分對(duì)提高臨床用藥的有效性、安全性有重要作用。本研究對(duì)提取的蛇莓總酚酸進(jìn)行純化，得到高純度的蛇莓總酚酸，可為進(jìn)一步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)蛇莓藥用價(jià)值的發(fā)掘與利用。