殼聚糖季銨鹽/海藻酸鈉納米粒子對(duì)溶菌酶/NO的雙重藥物負(fù)載

孫 燕，柳 永，李偉東，費(fèi)驥慧，陳興江

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.杭州師范大學(xué)錢(qián)江學(xué)院，浙江 杭州 310036；3.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023)

1 前 言

自然界中的細(xì)菌既可呈自由漂浮存在，亦可附著于某些表面形成生物膜[1]。不少抗菌劑雖能有效抑制自由漂浮的細(xì)菌，但不能很好地殺滅生物膜細(xì)菌[2-3]。細(xì)菌生物膜的本質(zhì)是微生物在基體表面形成的群落，群落被胞外多糖包圍，抗菌劑難以有效地穿透胞外多糖層的保護(hù)。殺滅生物膜中細(xì)菌所需抗菌劑的劑量，通常是消滅浮游細(xì)菌所需劑量的1000 倍[4-6]。更值得注意的是，許多醫(yī)學(xué)上的細(xì)菌感染是由于細(xì)菌生物膜引起的，如手術(shù)植入、未愈合的傷口感染、糖尿病以及囊性纖維化等[1-2]。因此，迫切需要啟動(dòng)新的能夠根除細(xì)菌生物膜的抗菌模式的研究和應(yīng)用。

NO是二十世紀(jì)八十年代后期發(fā)現(xiàn)的氣質(zhì)性細(xì)胞信使分子，除參與多種生理反應(yīng)外，在哺乳動(dòng)物對(duì)病原體的免疫應(yīng)答反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[7]。NO的抗菌活性是由于其反應(yīng)性副產(chǎn)物如三氧化二氮和過(guò)氧化亞硝酸鹽等所激發(fā)的亞硝化反應(yīng)和氧化反應(yīng)引起的，可最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的破裂[8]。目前，NO釋放材料已經(jīng)在病菌致滅領(lǐng)域出現(xiàn)了較廣泛的研究，原因是NO不會(huì)導(dǎo)致耐藥細(xì)菌產(chǎn)生。NO供體研究包括小分子親核NO，如二乙胺和精胺親核NO、大分子如殼聚糖親核NO[9-10]和超支化大分子親核NO等[11-12]。研究顯示多數(shù)親核NO供體的釋放不可控，釋放太快，緩釋效果并不明顯。溶菌酶(lysozyme，EC3.2.1.17)也是一種細(xì)菌難以產(chǎn)生耐受性的藥物，它水解的部位是細(xì)菌細(xì)胞壁上的通用肽聚糖結(jié)構(gòu)，形成細(xì)胞壁破損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外滲死亡。溶菌酶(以雞蛋白溶菌酶為例)等電點(diǎn)為10.8，在人體液pH值為7.4下帶正電荷，可與酸性病毒因子，如病毒外殼蛋白和核酸等結(jié)合，達(dá)到失活病毒的效果。有機(jī)整合NO和溶菌酶的抗菌作用，有可能形成雙重殺菌的高效殺菌劑。

本研究擬探索一種特異性抗菌的新途徑-NO和溶菌酶協(xié)同修飾的復(fù)合納米材料的制備改性，以獲得便于識(shí)別致病菌并及時(shí)釋放NO和溶菌酶的復(fù)合納米材料。為達(dá)到緩釋效果，研究選取兩種天然存在、可生物降解并可生物醫(yī)用的高分子材料，即N-(2-羥基)丙基-3-三甲基氯化銨殼聚糖(HTCC)和海藻酸鈉(SA)，作為載體材料。首先利用兩種大分子之間的離子交聯(lián)作用，制成負(fù)載溶菌酶的納米粒子，然后將負(fù)載溶菌酶的納米粒子與NO氣體在高壓下反應(yīng)，最終制得協(xié)同負(fù)載溶菌酶和NO兩種藥物的納米材料。選取HTCC是因?yàn)榭梢砸?guī)避純的殼聚糖的正電性與正常細(xì)胞表面存在豐富的靜電絡(luò)合作用，因?yàn)檫@種作用在體內(nèi)和體外都不可控，最終會(huì)在一定程度上導(dǎo)致細(xì)胞的毒性效應(yīng)[13]。另外，HTCC具備永久正電性和生理環(huán)境下的水溶性，而且這種殼聚糖衍生物的抗菌活性在制藥學(xué)上有潛在的應(yīng)用價(jià)值[14-15]。選擇SA是由于其可以與帶正電的多糖形成很好的離子交聯(lián)作用，制備成粒徑大小可控的納米粒子，并且對(duì)水溶性藥物的包封效果顯著[16]。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材料與試劑

殼聚糖(CS，Mv=400 kDa，脫乙酰度≥90%),SA，溶菌酶(23500 U/mg),為生物純。冰醋酸、異丙醇、硝酸銀(AgNO3)、亞硝酸鈉、無(wú)水甲醇、2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAS)、磺胺和甲醇鈉等均為分析純。PBS緩沖溶液，化學(xué)純。溶菌酶檢測(cè)試劑盒、NO測(cè)定試劑盒(Griess試劑盒)、NO氣體(純度99.9%)，均為國(guó)產(chǎn)試劑。大腸桿菌DH5α菌株，煙草青枯菌FSQ、生防菌枯草芽孢桿菌BS136菌株和解淀粉芽孢桿菌BaS菌株為貴州省煙草科學(xué)院保存菌種。

2.2 溶菌酶負(fù)載HTCC/SA復(fù)合納米粒子的制備及表征方法

2.2.1HTCC的制備 參照文獻(xiàn)[17]的方法，合成HTCC：在150 mL三頸燒瓶中加入CS 4.0；GTMAC 3.6 g和60 mL蒸餾水。80 ℃下回流，恒溫?cái)嚢?400 r/min，7 h)。反應(yīng)結(jié)束，將產(chǎn)物裝入截留分子量14 kDa的透析袋中，于蒸餾水中透析，至透析液經(jīng)AgNO3(0.1 mol/L)檢測(cè)無(wú)白色沉淀時(shí)止。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后烘干得到粉末狀HTCC。

2.2.2負(fù)載溶菌酶的HTCC/SA復(fù)合納米粒子的制備 (1)將所制得的HTCC溶于蒸餾水中，配成1 mg/mL的HTCC溶液。

(2)將1 mg/mL的SA水溶液與1 mg/mL的溶菌酶水溶液按不同體積比混合，不斷攪拌至有微弱藍(lán)色熒光出現(xiàn)并穩(wěn)定存在，即得到SA/溶菌酶復(fù)合納米粒子溶液;取上述SA/溶菌酶復(fù)合納米粒子溶液，滴于1 mg/mL的HTCC溶液中，并不斷磁力攪拌，至有藍(lán)色熒光出現(xiàn)并穩(wěn)定存在(記為A納米溶液)。

(3)將A納米溶液低溫高速(4 ℃，20000 g)離心，去掉上清液，沉淀冷凍干燥，得到干燥的負(fù)載溶菌酶的HTCC/SA復(fù)合納米粒子。

2.2.3測(cè)定溶菌酶的載藥量和包封率 依照溶菌酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 ①試劑配制：取菌粉1支，在勻漿管中，與1 mL菌粉溶劑輕緩研磨3 min，即得貯備菌液；將貯備菌液以菌粉溶劑稀釋20倍即得應(yīng)用菌液；取2 mg標(biāo)準(zhǔn)品分散于1 mL蒸餾水中，混勻得到2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，再取適量的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用蒸餾水稀釋成不同濃度。將應(yīng)用菌液及各種濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液置于0 ℃的冰水中預(yù)冷5 min以上。

②測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的透光度，按表1進(jìn)行操作。

表1 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)試配方

37 ℃準(zhǔn)確水浴15 min，立即取出置于0 ℃冰水浴中3 min，逐管于530 nm處，以蒸餾水為100%透光度，測(cè)各管透光度。

③按上述方法測(cè)定第2.2.2節(jié)(3)中上清液的透光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成游離溶菌酶的濃度。

④按式(1)、(2)計(jì)算包封率和載藥量，求3次求平均值：

包封率=(溶菌酶的總濃度-游離溶菌酶的濃度)/溶菌酶的總濃度×100%

(1)

載藥量=包封率×溶菌酶總質(zhì)量/納米粒子的質(zhì)量×100%

(2)

2.3 負(fù)載溶菌酶的HTCC/SA復(fù)合納米粒子接枝NO的制備

取少量負(fù)載溶菌酶的HTCC/SA復(fù)合納米粒子加入到甲醇鈉與無(wú)水甲醇(50 mL)溶液中，要求[Na+]/[NH]的物質(zhì)的量之比等于3。高壓反應(yīng)釜先用N2鼓泡30 min，然后抽真空。接著再通NO，維持壓力0.6 MPa，室溫下攪拌反應(yīng)4 d。反應(yīng)完成后，通N2鼓泡30 min。過(guò)濾釜中產(chǎn)物，以無(wú)水甲醇洗滌3 次后，于室溫下真空干燥12 h，轉(zhuǎn)移至真空干燥器中-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 負(fù)載溶菌酶的HTCC/SA復(fù)合納米粒子的透射電鏡(TEM)觀測(cè)

采用懸滴法于噴涂超薄碳膜的銅網(wǎng)上制備透射電子顯微鏡觀測(cè)樣本，以2%磷塢酸溶液染色，并于室溫下自然風(fēng)干。使用型號(hào)為A JEM-2010 JEOL的TEM對(duì)干態(tài)納米粒子的形貌、結(jié)構(gòu)與尺寸大小進(jìn)行觀測(cè)。

2.5 溶菌酶/NO協(xié)同負(fù)載HTCC/SA復(fù)合納米粒子的紅外光譜(FTIR)分析

對(duì)負(fù)載NO前后的復(fù)合納米粒子樣品進(jìn)行紅外光譜表征。采用KBr壓片法光譜掃描樣本：取少量干燥復(fù)合納米粒子粉末于瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr粉末在紅外燈下充分研磨混合，壓片并進(jìn)行紅外分析。紅外光譜的掃描精度為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，掃描范圍為4000～400 cm-1。

2.6 溶菌酶/NO協(xié)同負(fù)載HTCC/SA復(fù)合納米粒子的差示掃描量熱(DSC)分析

HTCC/SA復(fù)合納米粒子的DSC測(cè)試：首先將溫度從室溫升到100 ℃，保持5 min；然后降低到-20 ℃，同樣保持5 min；再次從-20 ℃即熱到290 ℃，保持5 min，最后降回到25 ℃。升降溫速率均設(shè)為10 ℃/min。溶菌酶/NO協(xié)同負(fù)載HTCC/SA復(fù)合的米粒子的DSC測(cè)試：除不做升到100 ℃并保持5 min步驟外，其余操作同HTCC/SA復(fù)合納米粒子的DSC測(cè)試。

2.7 溶菌酶和NO的體外釋放

取10 mg協(xié)同負(fù)載溶菌酶/NO的HTCC/SA復(fù)合納米粒子樣品干粉于透析袋中，加入PBS緩沖液5 mL，放入盛有35 mL PBS緩沖液的密閉玻璃瓶中，在37 ℃的水浴下磁力攪拌釋放。每隔一定時(shí)間取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)充PBS緩沖溶液2 mL。

取出的1 mL樣品液用第2.2.3節(jié)中的測(cè)定透光度的方法來(lái)計(jì)算溶菌酶的釋放量。

用PBS緩沖溶液配制0～25 nmol的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取出的1 mL樣品液依次與GriessⅠ(1 mL)和GriessⅡ(1 mL)混合，在閉光的條件下，穩(wěn)定15 min后會(huì)觀察到紫色或紫紅色出現(xiàn)，此時(shí)NO已反應(yīng)生成亞硝酸鹽，然后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-Vis)測(cè)定其540 nm處的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定NO釋放濃度。

2.8 復(fù)合納米粒子的體外抗菌效果分析

以革蘭氏陰性菌大腸桿菌DH5α菌株，煙草青枯菌FSQ菌株，革蘭氏陽(yáng)性菌生防菌枯草芽孢桿菌BS136和解淀粉芽孢桿菌BaS菌株為實(shí)驗(yàn)菌株。于超凈工作臺(tái)中，在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中倒入約20 mL溶化的固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨 10.0 g/L，牛肉浸膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH值為7.3 ± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min)，靜置冷卻固化。向固化培養(yǎng)基上加入0.2 mL試驗(yàn)菌株懸液(菌液濃度為OD600=0.1)，并將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，保持培養(yǎng)皿蓋敞開(kāi)狀態(tài)下于超凈工作臺(tái)中吹干至表面無(wú)流動(dòng)液體。最后在培養(yǎng)基上等距離取5個(gè)點(diǎn)，各放置直徑5 mm無(wú)菌濾紙圓片1 片，并在濾紙片上分別加入以下測(cè)試樣品溶液10 μL：(a)HTCC∶SA=15∶5、(b)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶1(NO接枝)、(c)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3(NO接枝)、(d)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5(NO接枝)和(e)濃度與(d)相同的溶菌酶水溶液。將培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱中于30 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，然后觀察記錄透明圈有無(wú)與大小。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)合納米粒子的FTIR分析

圖1是溶菌酶/NO雙重載藥復(fù)合納米粒子的紅外譜圖。圖中曲線a可見(jiàn)CS在1596 cm-1處有一個(gè)伯胺N-H的特征峰，而此峰在HTCC的紅外譜圖(曲線b)中消失，取而代之的是HTCC在1536 cm-1處出現(xiàn)了仲胺的特征峰。同時(shí)HTCC在1483 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新的峰，這是季胺基團(tuán)的甲基上的C-H反對(duì)稱彎曲振動(dòng)，反映出CS的2位NH2上發(fā)生了反應(yīng)，生成了仲胺鍵，表明季銨鹽改性殼聚糖成功，制得了HTCC。

圖1 復(fù)合納米粒子的紅外光譜圖

同時(shí)，SA在與HTCC復(fù)合后，HTCC與SA之間強(qiáng)的靜電作用導(dǎo)致HTCC在3440 cm-1處的羧基和氨基的伸縮振動(dòng)峰向高波數(shù)移動(dòng)并變窄，表明靜電作用消弱了HTCC中的分子內(nèi)氫鍵作用；經(jīng)過(guò)包埋溶菌酶后這個(gè)峰又重新變寬；溶菌酶在1530 cm-1處仲酰胺的C-N伸縮振動(dòng)峰消失，在1624 cm-1處的羧基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)向高波數(shù)移動(dòng)，這表明溶菌酶是發(fā)生化學(xué)作用包埋在了HTCC/SA復(fù)合納米粒子中。而經(jīng)過(guò)NO修飾后的溶菌酶負(fù)載復(fù)合納米粒子紅外譜圖在1376和1319 cm-1處為N-N=O基團(tuán)的N=O伸縮振動(dòng)。

3.2 復(fù)合納米粒子中溶菌酶的包封率和載藥量

當(dāng)HTCC∶SA∶Lys的質(zhì)量比=15∶5∶1時(shí)，納米粒子的包封率和載藥量分別為52.90%和6.80%；當(dāng)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3時(shí)，包封率和載藥量分別為84.20%和27.81%；當(dāng)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5時(shí)，包封率和載藥量分別為92.10%和46.20%。圖2結(jié)果顯示，隨著溶菌酶用量的增多，溶菌酶與SA之間的離子交聯(lián)作用加大，所以包封率和載藥量均逐漸增大。

圖2 復(fù)合納米粒子中溶菌酶的載藥量和包封率

3.3 復(fù)合納米粒子的TEM分析

圖3為HTCC/SA負(fù)載溶菌酶的復(fù)合納米粒子的TEM照片。從圖3(a)可見(jiàn)HTCC與SA進(jìn)行離子復(fù)合形成的納米粒子尺寸較小，大約在40～200 nm左右，且形成的納米粒子結(jié)構(gòu)較致密，說(shuō)明HTCC與SA之間的離子交聯(lián)作用較充分。當(dāng)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶1時(shí)(圖3(b))，可以清晰地看到形成的納米粒子尺寸變大，大部分都在300 nm左右，這說(shuō)明溶菌酶與SA的離子交聯(lián)作用出現(xiàn)的同時(shí)，削弱了SA與HTCC之間的離子交聯(lián)作用，導(dǎo)致HTCC和SA通過(guò)離子交聯(lián)作用形成的納米粒子變得較松散，所以納米粒子尺寸明顯增加。隨溶菌酶濃度進(jìn)一步增加，當(dāng)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3時(shí)(圖3(c))，形成的納米粒子尺寸進(jìn)一步增加到400～500 nm左右；當(dāng)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5時(shí)(圖3(d))，由于溶菌酶與SA的離子交聯(lián)作用較顯著，直接導(dǎo)致SA與HTCC之間的作用進(jìn)一步削弱，在TEM照片中甚至找不到形狀較規(guī)整的納米粒子。

圖3 不同復(fù)合納米粒子的TEM照片

3.4 復(fù)合納米粒子的DSC分析

從圖4A可見(jiàn)，負(fù)載Lys的HTCC/SA復(fù)合納米粒子系列產(chǎn)物都出現(xiàn)了HTCC的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(102 ℃)，同時(shí)在227 ℃都出現(xiàn)了放熱峰，可能是因?yàn)镾A發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致，且與純的SA相比，此氧化反應(yīng)溫度提前，峰形寬而矮，這可能是由于SA物理交聯(lián)所致。另一方面，Lys在200 ℃出現(xiàn)熔融吸熱峰(圖4B)，此峰在載藥納米粒子中消失，說(shuō)明Lys很好地包裹進(jìn)HTCC和SA組成的載藥系統(tǒng)中，且Lys在納米粒子中是以化學(xué)包埋的方式存在的，發(fā)生了化學(xué)鍵合作用。從圖4C結(jié)果看，負(fù)載Lys的HTCC/SA復(fù)合納米粒子進(jìn)行NO接枝后，其DSC曲線與單純的負(fù)載Lys的HTCC/SA復(fù)合納米粒子有明顯的不同。接枝NO后的樣品(圖4C-b)在15 ℃和38 ℃左右分別出現(xiàn)一個(gè)較弱的吸熱峰；從50 到100 ℃還有一個(gè)是較強(qiáng)的吸熱峰。上述三個(gè)吸熱峰可能是納米粒子和NO分子之間的鍵解離作用導(dǎo)致的。

3.5 復(fù)合納米粒子的Lys體外釋放性能研究

選擇pH=7.4的PBS緩沖溶液作為釋放介質(zhì)，從釋放曲線圖5可以看出，首先出現(xiàn)一個(gè)Lys的突釋，釋放量達(dá)到了12%～15%左右。圖5c顯示Lys的最大突釋率為14.72%，之后連續(xù)緩慢釋放，60 h后達(dá)到23.50%。Lys的突釋是由于納米粒子表面吸附的Lys快速?gòu)募{米粒子表面解吸造成的。接下來(lái)的幾十個(gè)小時(shí)釋放緩慢，這主要是由于Lys的釋放需要一個(gè)較復(fù)雜的過(guò)程，首先是介質(zhì)中的水分子通過(guò)納米粒子表面的空隙擴(kuò)散滲透到納米粒子內(nèi)部，從而使得納米粒子在緩沖液中出現(xiàn)溶脹，然后納米粒子孔隙尺寸隨之變大，進(jìn)而藥物分子才能有效擴(kuò)散出來(lái)。納米粒子的這種特點(diǎn)有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的控制釋放，從而達(dá)到緩慢恒速釋放。

圖5 復(fù)合納米粒子的Lys的體外釋放曲線圖

3.6 復(fù)合納米粒子中NO的體外釋放性能研究

選擇pH=7.4的PBS緩沖溶液作為釋放介質(zhì)，進(jìn)行NO體外釋放研究(圖6)。從圖可見(jiàn)，納米粒子系列產(chǎn)物的NO釋放性能相似，釋放最大總量接近，集中在90～110 nmol/mg，其中NO的最大釋放總量為108.10 nmol/mg(圖6a)。另外要說(shuō)明的是溶菌酶的載藥量和包封率對(duì)NO的釋放沒(méi)有明顯交互影響。

圖6 復(fù)合納米粒子中NO的體外釋放曲線圖

3.7 復(fù)合納米粒子體外抗菌性能研究

從圖7可以看出溶菌酶/NO雙重載藥復(fù)合納米材料，雖然在大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)中，其抑菌圈不明顯，但是復(fù)合納米材料對(duì)另外三種菌株：青枯菌FSQ菌株、枯草桿菌BS136菌株和解淀粉芽孢桿菌BaS菌株均具有較好的抑菌活性。尤其對(duì)青枯菌FSQ的抑菌活性表現(xiàn)出明顯的溶菌酶濃度正相關(guān)性，如圖7中的d和e所示，這兩個(gè)不同樣品處理中溶菌酶濃度是相當(dāng)?shù)?，但抑菌圈差異顯著，這反映出溶菌酶、NO修飾與HTCC在抑制青枯菌FSQ菌株上具有一定的協(xié)同增效作用。

圖7 溶菌酶/NO協(xié)同負(fù)載HTCC/SA復(fù)合納米粒子的抗菌圖(a)HTCC∶SA=15∶5；(b)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶1(NO接枝)；(c)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶3(NO接枝)；(d)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5(NO接枝)；(e)與(d)濃度相等的Lys水溶液

4 結(jié) 論

本研究以HTCC/SA復(fù)合納米粒子作為藥物載體，先包埋溶菌酶，再接枝NO，研究了不同復(fù)合納米粒子的載藥量和包封率，對(duì)納米粒子進(jìn)行了表征，并測(cè)定了溶菌酶和NO的體外釋放性能。研究結(jié)果表明：

1.復(fù)合納米粒子成功負(fù)載了溶菌酶。隨著溶菌酶用量的增多，包封率和載藥量逐漸增大。當(dāng)HTCC∶SA∶Lys=15∶5∶5時(shí)，包封率和載藥量分別達(dá)到最大值，為92.10%和46.20%。

2.HTCC存在NH仲胺基團(tuán)，能夠負(fù)載NO可以形成N-N=O結(jié)構(gòu)。

3.溶菌酶的最大釋放百分率為23.50%，NO的最大釋放總量為108.10 nmol/mg。

4.復(fù)合納米粒子對(duì)青枯菌FSQ菌株、枯草芽孢桿菌BS136菌株、解淀粉芽孢桿菌BaS菌株均具有較好的抑制效果。