脯氨酰寡肽酶抑制劑S17092 對(duì)脂質(zhì)超載人肝細(xì)胞株LO2脂質(zhì)沉積的改善作用及其機(jī)制

舍玲，丁永年，紀(jì)文靜，阿孜古力·阿不來(lái)提

新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，烏魯木齊830011

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是一種由遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積為主要表現(xiàn)的臨床病理綜合征［1］。NAFLD的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，但已知脂質(zhì)的合成和代謝在其發(fā)病中起著重要作用［2］。在肝臟中，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控者，可調(diào)控與脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TG）合成相關(guān)的靶基因，如硬脂酰輔酶A 去飽和酶（SCD1）、脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）等，激活脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄過(guò)程［3］。脯氨酰寡肽酶（POP）是一種可以裂解短肽中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，參與多肽的成熟和降解，可調(diào)控炎癥因子、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等［4-6］。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，在單純脂肪變細(xì)胞及NAFLD 動(dòng)物模型中POP 表達(dá)增高，提示POP在NAFLD 進(jìn)展中起重要作用，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。2019年11月1日—2020年12月1日，本研究觀察了POP 抑制劑S17092 對(duì)脂質(zhì)超載人肝細(xì)胞株LO2 脂質(zhì)沉積的改善作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑 人肝細(xì)胞株LO2購(gòu)自購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。POP 抑制劑S17092 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone 公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司，棕櫚酸鈉（P9767）、油酸鈉（O7501）、油紅O 試劑盒購(gòu)自Sig?ma-Aldrich 公司，GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，POP 抗體購(gòu)自Abcam 公司，蛋白提取試劑盒、蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，甘油三酯試劑盒購(gòu)自中生北控生物技術(shù)有限公司，SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒及組織細(xì)胞RNA 微量提取試劑盒購(gòu)自索萊寶公司，SYBR Green 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒購(gòu)自Life Technologies，RT-PCR 試劑盒購(gòu)自TaKa?Ra 公 司，AcSDKP ELISA 試 劑 盒 購(gòu) 自SPI Bio and CEA公司，PCR引物由生工生物工程公司合成。

1.2 脂質(zhì)超載模型制備、分組及POP 抑制劑給予方法 參照文獻(xiàn)［9］方法，將LO2 細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d 更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)且長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，將配置好的油酸和棕櫚酸（2∶1）的混合物按1 mmol/L加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，建立脂質(zhì)超載模型。綜合前期試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)［8］，本研究選擇10μg/mL S17092 處理細(xì)胞。將LO2 細(xì)胞隨機(jī)分為3 組，對(duì)照組LO2 細(xì)胞用1%無(wú)FFA 的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組LO2 細(xì)胞制備脂質(zhì)超載模型后再用1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組LO2 細(xì)胞制備脂質(zhì)超載模型后再加入含S17092 的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積觀察 采用油紅O 染色法。將三組細(xì)胞用PBS 洗滌3 次并用4%多聚甲醛固定15 min，然后再用PBS 沖洗3 次，加入丙二醇試劑，室溫下脫水5 min，然后用新鮮稀釋的油紅O 溶液染色10 min，將細(xì)胞用60%異丙醇洗滌兩次，每次1 min，用水沖洗，并用蘇木精復(fù)染30 s，用PBS 洗滌后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。

1.4 各組細(xì)胞內(nèi)TG 檢測(cè) 采用Bio-Rad 蛋白質(zhì)測(cè)定法。取三組細(xì)胞，PBS洗滌兩次后，用0.25%胰酶消化，添加100μL 細(xì)胞裂解緩沖液孵育10 min 后離心5 min，收集上清液，按照TG 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書要求檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各 組 細(xì) 胞 內(nèi)POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取三組細(xì)胞，提取RNA 后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH 為內(nèi)參，配置20 μL 的PCR 反應(yīng)液，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：50 ℃2 min、95 ℃2 min 預(yù)變性，95 ℃15 s、60 ℃15 s、72 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：POP 正 向 引 物 為5′-CATCTCCCAAGAGGCT?GACTA-3′，反向引物為5′-GGGCAATAACACAAC?CAAAGA-3′；SREBP-1c 正 向 引 物 為 5′-GA?CAGCCCAGTCTTTGAGGA-3′，反向引物為5′-CAG?GACAGGCAGAGGAAGAC-3′；FAS 正向引物為5′-TTCCGAGATTCCATCCTACG-3′，反 向 引 物 為5′-AGGCTCACAAACGAATGGAC-3′；ACC1 正向引物為5′-TCACACCTGAAGACCTTAAAGCC-3′，反向引物 為5′-AGCCCACACTGCTTGTACTG-3′；SCD1 正向引物為5′-TTCCTACCTGCAAGTTCTACACC-3′，反 向 引 物 為5′-CCGAGCTTTGTAAGAGCGGT-3′；GAPDH 正 向 引 物 為 5′-GAAGGTGAAGGTCG?GAGTC-3′，反 向 引 物 為5′-GAAGATGGTGAT?GGGATTTC-3′。以2-ΔΔCt法表示細(xì)胞中目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況比較 油紅O 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組LO2細(xì)胞內(nèi)含有大量的紅染顆粒，而實(shí)驗(yàn)組較模型組紅染顆粒相對(duì)較少，見(jiàn)圖1。

圖1 顯微鏡下觀察油紅O染色的LO2細(xì)胞（×200）

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)TG 水平比較 對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)TG水平為（1.995 ± 0.221）pmole/μL，模型組細(xì)胞內(nèi)TG 水平為（2.910 ± 0.030）pmole/μL，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)TG 水平為（2.573±0.113）pmole/μL，組間相比，P均<0.05。

2.3 各 組 細(xì) 胞 內(nèi)POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞內(nèi)POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表1。由表1 可知，與對(duì)照組相比，模型組、實(shí)驗(yàn) 組 細(xì) 胞 中POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD 1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P均<0.05）；與模型組 相 比，實(shí) 驗(yàn) 組 細(xì) 胞 中POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P均<0.05）。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組細(xì)胞內(nèi)POP、SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

組別實(shí)驗(yàn)組模型組對(duì)照組POP mRNA 1.369±0.0819*#1.595±0.040*1.060±0.021 SREBP1c mRNA 1.381±0.083*#2.626±0.066*1.043±0.032 FAS mRNA 1.639±0.113*#2.955±0.095*1.051±0.019 ACC1 mRNA 1.376±0.045*#1.821±0.066*1.062±0.036 SCD1 mRNA 1.311±0.019*#1.869±0.109*1.073±0.014

3 討論

近年來(lái)，隨著肥胖等代謝性疾病的增加，NAFLD的發(fā)病率明顯增高。研究［11］發(fā)現(xiàn)，NAFLD是終末期肝病和肝癌的重要病因，即使是肝臟輕度脂肪變性，也會(huì)增加71%的死亡風(fēng)險(xiǎn)，而高循環(huán)FFA濃度可通過(guò)破壞NAFLD 患者的脂質(zhì)代謝而加重肝臟脂肪的積累［12］，因此研究FFA 如何影響代謝調(diào)節(jié)將進(jìn)一步增進(jìn)我們對(duì)NAFLD 發(fā)病機(jī)制的了解。本研究的目的是在FFA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)超載細(xì)胞模型中研究POP抑制劑對(duì)NAFLD 的影響，這可能有助于闡明與疾病進(jìn)展有關(guān)的機(jī)制。在正常人和NAFLD 患者中，棕櫚酸和油酸都是肝甘油三酯中最豐富的FFA。根據(jù)GOMEZ-LECHON 等的報(bào)告，載有含油酸/棕櫚酸（比例為2∶1）的FFA（1 mmol/L）混合物的肝細(xì)胞模擬了人類的肝臟慢性脂肪變性［9］。因此，我們通過(guò)將LO2 細(xì)胞與1 mmol/L FFA 一起孵育，建立了細(xì)胞脂肪變性的脂質(zhì)超載模型，油紅O 染色顯微觀察可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)液泡中大量脂質(zhì)沉積證實(shí)了建模成功。

目前研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，POP 與糖尿病、多發(fā)性硬化、肝硬化、抑郁癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥相關(guān)，在肝臟中發(fā)現(xiàn)POP 可促進(jìn)肝臟的再生和修復(fù)。此外有研究［13］表明，POP 可作為肝硬化嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)。而ZHANG 等［7-8］研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型中POP表達(dá)上調(diào)，抑制POP可降低肝脂肪變性的嚴(yán)重性和炎癥反應(yīng)，而抑制POP 對(duì)肝臟炎癥的保護(hù)作用與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸（PGP）的產(chǎn)生受抑制以及嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制有關(guān)。而另一項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［15］表明，POP 過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致Smad7 蛋白和PPAR-γ 上調(diào)，減弱大鼠肝星狀細(xì)胞的活化，進(jìn)而延緩肝纖維化。目前POP 在肝臟脂肪變性過(guò)程中的機(jī)制尚未闡明。一般認(rèn)為，脂肪肝是由肝臟攝取FFA、TG 合成和排泄之間的不平衡引起的，與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因失調(diào)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組POP mRNA 相對(duì)表達(dá)量更高，而實(shí)驗(yàn)組則表現(xiàn)出細(xì)胞脂肪變性減輕。SREBP-1c 是調(diào)節(jié)肝臟新生脂肪形成的最重要轉(zhuǎn)錄因子，可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性TG、膽固醇、FFA 等合成所需的酶的表達(dá)來(lái)維持脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。SREBP-1c 及其靶基因的異?？梢鹨葝u素抵抗、糖尿病、心臟功能障礙、血管并發(fā)癥和肝脂肪變性等一系列代謝性疾病。研究［16］發(fā)現(xiàn)，NAFLD 患者肝臟內(nèi)的SREBP-1c 含量明顯升高，表明SREBP-1c在NAFLD 發(fā)生進(jìn)展中起重要作用。本研究中，F(xiàn)FA 刺激下的L02 細(xì)胞中SREBP-1c 基因表達(dá)顯著上升，其調(diào)控的靶基因FAS、ACC1、SCD1 的表達(dá)同步上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)TG 含量亦增加，并伴有肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴生成，表明SREBP-1c基因表達(dá)的上調(diào)啟動(dòng)了相關(guān)脂質(zhì)生成的級(jí)聯(lián)過(guò)程，促進(jìn)NAFLD 的發(fā)生及進(jìn)展。而與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組肝LO2 細(xì)胞抑制POP 后，內(nèi)源性長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵基因SREBP-1c及其靶向基因FAS、ACC1、SCD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量亦顯著降低，細(xì)胞內(nèi)TG含量和脂滴的生成減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，在L02 細(xì)胞中進(jìn)行FFA 處理導(dǎo)致脂質(zhì)蓄積可能是由POP介導(dǎo)的，而SREBP-1c及其靶基因FAS、ACC1、SCD1 相對(duì)表達(dá)量升高是POP誘導(dǎo)脂肪變性的機(jī)制的重要組成部分。

總之，POP 抑制劑S17092 可改善脂質(zhì)超載LO2細(xì)胞的脂質(zhì)沉積，其機(jī)制可能與抑制SREBP-1c及其靶基因的表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞中POP 表達(dá)與脂肪合成相關(guān)基因之間的密切關(guān)系可能是治療干預(yù)NAFLD的潛在目標(biāo)。然而，POP 促進(jìn)肝脂肪變性的確切機(jī)制仍有待闡明。