基于高通量測(cè)序技術(shù)探究加味二陳湯對(duì)肥胖大鼠腸道微生物組的影響

杜 恒

（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，武漢 430022）

隨著人類工業(yè)文明發(fā)展，人們生活水平提高，兒童肥胖率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)研究表明，2014年我國(guó)7～18歲兒童肥胖與超重總檢出率高達(dá)19.4%。肥胖會(huì)引起兒童心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)疾病，還會(huì)對(duì)兒童心理、骨骼以及肝臟等產(chǎn)生影響[1-3]。據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征等也與肥胖有著密不可分的聯(lián)系[4-5]。鑒于單純性肥胖對(duì)我國(guó)兒童健康的巨大威脅，且西藥減肥藥存在的對(duì)兒童健康的未知影響，本課題組從5年前開(kāi)始針對(duì)中藥減肥展開(kāi)了一系列的研究。加味二陳湯為研究成果之一，是武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科徐輝甫主任醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)方，其主要功效是運(yùn)脾和胃，燥濕化痰，可治療以痰濁中阻為主要證候的單純性肥胖。本實(shí)驗(yàn)借助小窩喂養(yǎng)誘導(dǎo)肥胖幼鼠模型，對(duì)其進(jìn)行加味二陳湯灌胃，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，治療后小窩喂養(yǎng)肥胖幼鼠體質(zhì)量、Lee’s 指數(shù)、膽固醇、三酰甘油及游離脂肪酸等指標(biāo)具有明顯改變[6-7]。本文通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，進(jìn)一步研究加味二陳湯對(duì)肥胖大鼠腸道微生物組的影響，從分子生物學(xué)水平分析治療小兒?jiǎn)渭冃苑逝植捎眉游抖悳膽?yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 肥胖大鼠模型建立及分組

從湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購(gòu)買成年SPF級(jí)SD大鼠雌性10只，雄性5只（根據(jù)2:1比例使其交配并自然分娩）。將出生后的雄性大鼠分為大窩組與小窩組，其中大窩組每只母鼠哺乳10只雄鼠，小窩組每只母鼠哺乳3只雄鼠。給予哺乳母鼠常規(guī)飲食，并在大鼠出生21 d后斷奶，將小窩喂養(yǎng)后的肥胖幼鼠（體質(zhì)量≥大窩組體質(zhì)量均值+1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差）隨機(jī)分成2組：加味二陳湯組（予加味二陳湯灌胃）與對(duì)照組（予生理鹽水灌胃），均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物

治療組方：法半夏、蒼術(shù)、生山楂、茯苓、決明子、陳皮、甘草，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供中藥顆粒劑。

1.3 給藥方法

參照5歲兒童生理體質(zhì)量確定大鼠灌胃劑量，大鼠劑量與人劑量等效。治療組采用加味二陳湯灌胃，時(shí)間為5周，直至處死；對(duì)照組采用生理鹽水灌胃，時(shí)間為5周，直至處死。

1.4 糞便收集、測(cè)序及DNA提取

灌胃后采集大鼠腸道微生物樣品。固定大鼠后，在肛門周圍涂抹75%乙醇刺激其排便。用無(wú)菌棉簽涂抹糞便后，放入10 mL無(wú)菌EP管中，快速放入干冰箱，-80℃冰箱中保存待后續(xù)送實(shí)驗(yàn)室。樣本送到上海美吉生物公司進(jìn)行抗微生物DNA的提取，PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16 s區(qū)域后，采用Hiseq 2 500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Vsearch算法，將相似性大于97%的序列讀數(shù)定為一個(gè)OTU（operational taxonomic units）。對(duì)于相似度水平的OTU代表序列采用RDPclassifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)比對(duì)分分析。2組大鼠腸道微生物組在門（phylum）和屬（genes）水平上的豐度，采用t檢驗(yàn)評(píng)估。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后采用LEfSe分析，比較組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序原始數(shù)據(jù)分析

通過(guò)高通量測(cè)序，2組大鼠共12個(gè)樣本，共獲得了340 263條高質(zhì)量的序列讀數(shù)，占總序列的96.86%，序列平均長(zhǎng)度為300～500 bp。各組樣本數(shù)據(jù)分析結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（±s）

表1 序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（±s）

分組 Raw tags均數(shù) Valid tags均數(shù) Valid tags均數(shù)百分比/%對(duì)照組 32 273±3 632 23 718±2 689 73.51±2.57加味二陳湯組 43 818±6 000 34 848±5 025 79.15±5.72

2.2 2組大鼠腸道微生物多樣性探究

對(duì)照組與加味二陳湯組大鼠腸道菌群多樣性分析結(jié)果顯示：1）加味二陳湯灌胃導(dǎo)致大鼠腸道菌群特有的OTU減少。2）對(duì)照組的腸道菌群均勻度低于加味二陳湯組，說(shuō)明加味二陳湯組的腸道菌群物種豐富度較高。3）對(duì)照組和加味二陳湯組大鼠Shannon指數(shù)相近，但經(jīng)t檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4）對(duì)照組的Simpson指數(shù)高于加味二陳湯組，且t檢驗(yàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明加味二陳湯組腸道菌群生物多樣性高于對(duì)照組。5）加味二陳湯組大鼠的Chao1指數(shù)較對(duì)照組高，數(shù)據(jù)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明加味二陳湯對(duì)腸道微生物群落具有改善作用。

2.3 2組大鼠菌群差異探究

通過(guò)物種分析，研究對(duì)照組和加味二陳湯組大鼠腸道菌群的組成。2組中腸道菌群相對(duì)較高的前12門見(jiàn)表2。從表中可以看出，在2組大鼠的糞便樣本中，12個(gè)門中有9個(gè)門出現(xiàn)。但經(jīng)t檢驗(yàn)，大部分門的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，只有螺旋菌門、柔性菌門2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加味二陳湯組大鼠腸道菌群中僅存在疣狀微菌和螺旋菌，其Mean豐度分別為（0.010±0.013）%、（0.010±0.014）%、（0.010±0.005）%。

表2 2組大鼠腸道菌群組成中主要門的相對(duì)豐度

研究結(jié)果顯示，菌屬水平對(duì)照組和治療組大鼠腸道菌群的組成。1）對(duì)照組和加味二陳湯組腸道菌群豐度最高的三個(gè)門分別是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。對(duì)照組和加味二陳湯組腸道菌群豐度在細(xì)菌在屬水平上的差異，其中對(duì)照組菌群排名前3的是毛霉、紫色單孢子菌和乳酸菌。2）加味二陳湯組大鼠中豐度較高的前3種細(xì)菌分別為瘤胃菌、毛霉菌和紫色單孢子菌。在細(xì)菌屬的分類水平上，2組大鼠的腸道菌群有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，如瘤胃細(xì)菌、螺桿菌、副桿菌、真細(xì)菌、布魯氏菌、梭菌等。

2.4 2組大鼠腸道菌群LEfSe差異分析

對(duì)照組和加味二陳湯組大鼠腸道微生物的LEfSe多級(jí)物種層級(jí)樹(shù)圖結(jié)果顯示：2組之間特定細(xì)菌門的差異主要表現(xiàn)在厚壁菌門、變形菌門和柔性膜菌門的豐度上。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，加味二陳湯組大鼠腸道微生物多樣性高于對(duì)照組。

3 討論

單純性肥胖是指由于卡路里攝入量超出利用與消耗量，導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)不斷積累，體質(zhì)量超標(biāo)，不產(chǎn)生器質(zhì)性病變的肥胖[8-10]。西醫(yī)治療單純性肥胖主要以健康教育、改善生活方式、堅(jiān)持體育鍛煉、藥物以及手術(shù)等方式[11-12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，兒童單純性肥胖主要與飲食不節(jié)有關(guān)?！端貑?wèn)·通評(píng)》中指出：“甘肥貴人，則膏梁之疾也?！眱和捎诒╋嫳┦骋约懊τ趯W(xué)習(xí)而忽視體育鍛煉致使肥胖發(fā)生[13-14]?！端貑?wèn)宣明正氣論》有“久坐傷氣，久坐傷肉”的描寫，《丹溪治法必要》有“肥人多痰”“肥人多濕”的論述。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，飲食不節(jié)，脾失健運(yùn)，運(yùn)化失施導(dǎo)致小兒肥胖。彭真等[15]研究發(fā)現(xiàn)，兒童單純型肥胖主要病機(jī)與病理發(fā)展轉(zhuǎn)歸的重要因素與痰濕有關(guān)。我院兒科徐輝甫教授在治療兒童單純性肥胖方面以加味二陳湯為經(jīng)驗(yàn)方，通過(guò)多年臨床驗(yàn)證，治療效果較好，不易反彈，并且副作用較小。治療組方在二陳湯基礎(chǔ)上加生山楂、決明子、蒼術(shù)。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，主要功效是理氣和中、化痰燥濕，屬于治療痰濕證經(jīng)典方?！兜は姆ǜ接唷分赋觯?“此方半夏豁痰燥濕，橘紅消痰利氣，茯苓降氣滲濕，甘草補(bǔ)脾和中?！奔游抖悳诙悳降幕A(chǔ)上增加生山楂健胃消脂，降低血清中的膽固醇[16]，增加決明子清肝祛濕，調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖和脂肪代謝[17]，另加蒼術(shù)加強(qiáng)運(yùn)脾燥濕之功，理氣燥濕化痰治標(biāo)的同時(shí)，運(yùn)脾健脾截生痰之源兼顧治本。在本課題組的前期研究中，加味二陳湯在改善小窩喂養(yǎng)肥胖幼鼠的血脂代謝，減輕體質(zhì)量和降低 Lee’s 指數(shù)等方面獲得了很好的效果。

腸道內(nèi)微生物主要依靠動(dòng)物腸道生活，并幫助寄主完成諸多生理功能[18-19]。腸道具有消化吸收的作用，是人體最大的免疫器官，能夠維持人體正常免疫防御功能。微生物是人體內(nèi)最復(fù)雜、最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，人體腸道是其主要生長(zhǎng)環(huán)境，其本身以及代謝產(chǎn)物除能夠調(diào)節(jié)人體健康外，還可以溝通膳食與宿主之間的關(guān)系?；诖?，本研究在分析加味二陳湯的減肥功效時(shí)，亦探討加味二陳湯對(duì)人體腸道微生物的相關(guān)影響。

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果顯示，加味二陳湯組大鼠腸道微生物多樣性高于對(duì)照組，而腸道生物多樣性可協(xié)助宿主進(jìn)行能量吸收與儲(chǔ)存[20]。加味二陳湯可能通過(guò)調(diào)控腸道微生物組來(lái)達(dá)到減肥效果。埃希氏菌屬是條件菌，通常情況下不致病，但是如果發(fā)生特殊情況，會(huì)導(dǎo)致宿主腹痛或者腹瀉[21]。本研究中服用了加味二陳湯大鼠埃希氏菌屬豐度要明顯高于對(duì)照組，可見(jiàn)加味二陳湯可通過(guò)促進(jìn)排泄降低體質(zhì)量。值得注意的是，顫螺菌屬和乳桿菌菌屬都屬于益生菌，在宿主對(duì)食物的消化中起著必不可少的作用[22]，加味二陳湯組大鼠腸道中的相對(duì)豐度要少于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)，加味二陳湯的使用導(dǎo)致了肥胖大鼠的腸道微生物多樣性明顯升高，其中一些和食物消化相關(guān)的菌屬豐度發(fā)生了改變，但是這些改變對(duì)于宿主健康的影響是未知的，值得我們更進(jìn)一步的研究。本課題組未來(lái)的探索中，會(huì)考慮使用更多的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且設(shè)置空白對(duì)照組，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更有說(shuō)服力。