血清中microRNA對非小細胞肺癌早期轉移潛在的診斷價值

蔡 睿，王振興，安 南，賀云靖，楊文卓，王 星，許哲男*

（1.吉林大學臨床醫(yī)學院，長春 130012；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科，長春 130033）

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率已經(jīng)成為世界范圍內的公共衛(wèi)生問題[1]。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌中常見的一種分型[2]。隨著診療技術的發(fā)展和改進，NSCLC的總體生存率有所提升，但其5年生存率仍處于較低水平[3]。目前NSCLC發(fā)生早期遠處轉移的分子機制尚不清楚，研究[4]發(fā)現(xiàn)，外泌體介導的細胞間信號傳導在腫瘤轉移過程中發(fā)揮重要作用。本研究主要通過對NSCLC轉移和非轉移患者血清外泌體進行提取、分離、測序以及實驗驗證的方式，闡述血清中微小RNA（miRNA）對NSCLC早期轉移潛在的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 外泌體提取和分離

隨機收集就診于我院胸外科的2例NSCLC轉移患者全血10 mL，2例NSCLC未轉移患者全血10 mL以及2例健康體檢患者全血10 mL。同期選取30例NSCLC轉移患者和30例NSCLC未轉移患者進行實時定量聚合酶鏈式反應驗證基因芯片準確性。4℃下1 900 g離心10 min，搜集上層血漿并在4℃下3 000 g離心15 min，搜集上清液進行外泌體提取。提取方法選擇超高速離心法，即3 00 g條件下離心10 min，搜集上清并進行2 000 g條件下離心10 min，搜集上清并進行10 000 g條件下離心30 min，搜集上清并進行100 000 g條件下離心70 min，最終沉淀物即為外泌體。

1.2 外泌體的基因芯片測序

TRIzol法提取6例樣本外泌體中的RNA，應用NanoDrop ND-1000進行RNA濃度和純度的檢測。用含T4連接酶的cyanine 3-pCp標記miRNA，通過濃縮和干燥標記的cRNA然后被重懸。在11 uL體積10×阻斷劑和2.2 uL的25×裂解緩沖液中培養(yǎng)30 min并添加55 uL雜交緩沖液，最終清洗、固定和掃描。

1.3 外泌體測序結果驗證

隨機選取就診于我院的30例NSCLC轉移患者和30例NSCLC未轉移患者，取全血10 mL，進行外泌體的分離和提取。外泌體應用蛋白電泳和電子顯微鏡進行檢測。應用百泰克miRNA提取試劑盒進行外泌體中miRNA的提取，應用吉瑪miRNA逆轉錄試劑盒以及實時定量聚合酶鏈式反應試劑盒對差異表達的miRNA進行實驗驗證。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 NSCLC患者血清外泌體中RNA質量檢測

見表1，圖1。

表1 外泌體中RNA濃度和純度的檢測

圖1 外泌體中RNA質量以及芯片檢測

2.2 NSCLC患者血清外泌體miRNA芯片檢測結果

見圖2。

圖2 血清外泌體miRNA芯片檢測

2.3 外泌體差異表達miRNA檢測結果

見圖3，表2。

圖3 血清外泌體鑒定

表2 血清外泌體miRNA芯片實時定量聚合酶鏈式反應結果（±s，n= 30）

表2 血清外泌體miRNA芯片實時定量聚合酶鏈式反應結果（±s，n= 30）

注：與腺癌轉移比較，# P＜ 0.05

樣本 腺癌轉移（CT值）腺癌未轉移（CT值） 差異倍數(shù)miR-4436a 32.80±2.75 34.52±3.52# 2.11 miR-4687-5p 33.06±2.88 34.79±3.33# 2.09 miR-22-3p 31.96±1.05 31.41±1.02# 0.43 miR-3666 31.00±1.25 30.36±1.12# 0.41 miR-4448 33.05±1.45 32.36±1.18# 0.39 miR-4449 32.81±0.99 32.35±0.58# 0.46 miR-6751-5p 31.78±0.69 31.29±0.88# 0.45 miR-92a-3p 30.37±0.86 29.74±1.03# 0.41

3 討論

外泌體是一種納米級別的雙層膜結構，其內包含有大量的生物活性物質如蛋白質、脂質和核酸[5]。外泌體可以由各種活細胞分泌，并被靶細胞攝取，完成細胞間的生物信息傳遞以及調控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可能參與肺癌特別是NSCLC的遠處轉移。另外，外泌體廣泛分布于血液、尿液、腦脊液以及胸水中[4]，這就為其成為診斷標志物提供便利條件。故本文通過對NSCLC患者血清中外泌體的提取、分離、測序以及驗證發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中miR-4436a，miR-4687-5p，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p可以作為NSCLC遠處轉移的診斷標志物。

微小RNA（miRNA）是一種長度大約為22 nt的非編碼RNA，被認為可能參與到多種腫瘤的生長和遠處轉移的病理學過程[6]。血液中游離的miRNA較易受到酶的分解，因此直接檢測血液中游離的miRNA誤差較大，很難作為臨床診療標志物進行廣泛開展[7]。外泌體具有雙側脂質結構，能夠有效的保護其內搭載的miRNA不被血液中酶分解。因此檢測血液外泌體中的miRNA可能對NSCLC遠處轉移提供早期的診斷信息[8-9]，進而指導臨床治療。

既往文獻報道肺癌外泌體可能參與肺癌細胞的快速增殖、遠處轉移、放射性抵抗以及藥物抵抗等病理生理學過程。研究[10]發(fā)現(xiàn)外泌體中miR-1247-3p誘導癌相關成纖維細胞活化進而促進肝癌細胞肺轉移。研究[11]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導肺癌細胞分泌的包含miR-23a的外泌體可以通過靶向緊密連接蛋白ZO-1增加新生血管生成和血管通透性，進而促進肺癌的轉移。研究[12]通過對NSCLC遠處轉移和未轉移患者血清中外泌體進行miRNA基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-4448可能參與NSCLC的早期轉移。研究[13]發(fā)現(xiàn)外泌體中長鏈非編碼RNA-MMP2-2能夠通過靶向調控MMP2的表達進而促進肺癌細胞的侵襲和遠處轉移。

本研究通過對4例NSCLC患者血清中外泌體測序，發(fā)現(xiàn)NSCLC發(fā)生轉移的患者血清外泌體中miR-4436a，miR-4687-5p呈現(xiàn)差異性上調表達，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p呈現(xiàn)差異性下調表達，提示這8種外泌體中miRNA對NSCLC早期轉移具有潛在的診療價值。miRNA基因芯片能夠快速檢索樣本中差異表達的miRNA，速度快、成本低，但是其準確性尚需要結合實時定量聚合酶鏈式反應實驗進行驗證。因此，我們通過吉瑪公司進行上述8種引物的合成，并通過實時定量聚合酶鏈式反應實驗在10例NSCLC未轉移以及NSCLC轉移的患者血液外泌體中進行驗證，最終確認這8種外泌體中的miRNA發(fā)生差異性表達，和基因芯片檢測結果一致。

綜上所述，肺癌患者血清外泌體中miR-4436a，miR-4687-5p呈現(xiàn)差異性上調表達，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p呈現(xiàn)差異性下調表達，檢測這8種血清標志物可以對NSCLC的早期遠處轉移起到提示作用，指導臨床藥物治療。但本研究尚有一定的局限性，測序樣本較少可能存在結果偏倚，更大樣本的測序以及更多樣本的實驗驗證應該在后續(xù)研究中繼續(xù)開展。