營(yíng)養(yǎng)性肥胖高血壓大鼠動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)

王 靜，董振華，符德玉，桂明泰，姚 磊，蘆 波，李建華，周訓(xùn)杰

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200437）

肥胖和高血壓是心血管疾病發(fā)病和病死的主要原因，肥胖促使多種心血管疾病危險(xiǎn)因素聚集，加速高血壓及心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[1]。超重和肥胖及相關(guān)糖脂代謝紊亂已成為我國(guó)高血壓患病率快速增長(zhǎng)的主要原因之一[2]。肥胖高血壓的發(fā)病機(jī)理及干預(yù)防治已成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）與Wistar-Kyoto（WKY）大鼠是常用的疾病模型大鼠，都屬于突變系大鼠，均由封閉群大鼠Wistar品系繁殖而來(lái)[3-4]。SHR是20世紀(jì)60年代由日本科學(xué)家提出的一種不需藥理或手術(shù)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)性高血壓動(dòng)物模型[5]，是通過(guò)選擇性近親交配獲得穩(wěn)定遺傳的高血壓后代。WKY大鼠作為SHR的正常血壓對(duì)照組，是20世紀(jì)70年代美國(guó)NIH從日本京都引進(jìn)Wistar大鼠后，通過(guò)近親繁殖培育而成的。本研究采用高脂定制飼料喂養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠，以期復(fù)制出與人類肥胖高血壓相似的疾病動(dòng)物模型，并從行為學(xué)、理化指標(biāo)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究奠定前期基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

120只5周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR），體質(zhì)量（150±20）g，12只SPF級(jí)周齡/性別相匹配的正常血壓京都種大鼠（Wistar-Kyoto Rat，WKY)，體質(zhì)量（150±20）g，二者均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（北京）2016-0006]。所有大鼠自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的局部屏障系統(tǒng)中，溫度（22±2）℃，光照/黑暗周期12/12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

普通飼料及高脂定制飼料均由上海普路騰生物科技有限公司提供[生產(chǎn)許可證編號(hào)：滬飼證（2014）04001]。普通飼料主要原料：魚粉、小麥、玉米、豆粕、麩皮、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等；高脂定制飼料配方參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行改進(jìn)：普通飼料60%、豬油12%、蔗糖5%、蛋黃粉10%、奶粉3%、生花生4.7%、麻油1%、食鹽2%、膽固醇2%、膽鹽0.3%。高脂飼料置于冰箱保存，每日投放。

1.3 主要儀器材料

智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)-鼠儀（北京軟隆生物技術(shù)有限公司），全自動(dòng)生化分析儀（科華生物工程有限公司），大鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，12只WKY繼續(xù)喂食普通飼料（WKY-ND組，n= 12），120只SHR根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為SHR普通飼料組（SHR-ND組，n=12），SHR高脂飼料組（SHR-HF組，n= 108）。造模干預(yù)10周。

2.2 造模成功標(biāo)準(zhǔn)

10周后，將SHR-HF組體質(zhì)量位于上游前1/3大鼠判定為肥胖高血壓大鼠（OBH-HF組，n= 36）[7]。

2.3 生理指標(biāo)測(cè)定

造模前及造模后每2周測(cè)量所有大鼠體質(zhì)量、腹圍（腹部經(jīng)劍突與后肢間垂直距離中點(diǎn)一周的長(zhǎng)度[8]）及體長(zhǎng)（鼻尖至肛門長(zhǎng)度[9]），結(jié)合對(duì)應(yīng)體質(zhì)量計(jì)算Lee指數(shù)[Lee指數(shù)=體質(zhì)量（g）1/3 ×103/體長(zhǎng)（cm）]，做好記錄。

2.4 收縮壓測(cè)定

造模前及造模后每2周測(cè)量所有大鼠收縮壓并記錄。測(cè)定方法：13時(shí)至17時(shí)將大鼠放至保溫裝置中固定并預(yù)熱約15 min，使用尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量大鼠日間清醒狀態(tài)下收縮壓，連續(xù)測(cè)量3～5次，取平均值并記錄。

2.5 易激惹程度測(cè)定

造模前后分別進(jìn)行易激惹程度觀察并積分。易激惹程度的積分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[10-11]擬定：1分，捉持頸部時(shí)尖叫、驚跳；2分，捉持頸部時(shí)激怒欲咬人；3分，提尾部時(shí)即尖叫、驚跳，甚至欲咬人或同籠大鼠頻繁打斗，頻咬鐵籠；上述情況不明顯為0分。

2.6 糖脂代謝指標(biāo)測(cè)定

造模結(jié)束時(shí)，WKY-ND組大鼠、SHR-ND組大鼠分別隨機(jī)選取6只，OBH-HF組大鼠隨機(jī)選取18只，禁食12 h處理，行眼眶后靜脈叢采血0.5～1 mL，離心3 000轉(zhuǎn)，8 min，吸取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TG、TC、LDL-C、HDL-C、FBG水平，ELISA法檢測(cè)FIN水平并計(jì)算HOMA-IR。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本均數(shù)比較，符合正態(tài)分布及方差齊性時(shí)采用單因素方差分析，等級(jí)資料采用Ridit分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠造模前后收縮壓比較

見表1。

表1 各組大鼠造模前后收縮壓比較（±s） mm Hg

表1 各組大鼠造模前后收縮壓比較（±s） mm Hg

注：與WKY-ND組比較，## P＜0.01，△△P＜0.01；與SHR-ND組比較，▲▲P＜0.01

組別 n 時(shí)間 收縮壓WKY-ND組 12 造模前 114.83±6.85 WKY-ND組 12 造模后 138.33±10.96 SHR-ND組 12 造模前 135.50±8.61##SHR-ND組 12 造模后 180.67±12.32△△SHR-HF組 108 造模前 141.26±11.05##OBH-HF組 36 造模后 198.11±6.48△△▲▲

3.2 各組大鼠造模前后易激惹程度積分比較

見表2。

表2 各組大鼠造模前后易激惹程度積分比較 只

3.3 各組大鼠造模前后體質(zhì)量、Lee指數(shù)、腹圍比較

見表3。

表3 各組大鼠造模前后體質(zhì)量、Lee指數(shù)、腹圍比較（±s）

表3 各組大鼠造模前后體質(zhì)量、Lee指數(shù)、腹圍比較（±s）

注：與WKY-ND組比較，## P＜0.01；與SHR-ND組比較，△△P＜0.01

組別 n 時(shí)間 體質(zhì)量/g Lee指數(shù) 腹圍/cm WKY-ND組 12 造模前 127.17±7.53 331.15±9.66 14.69±1.00 WKY-ND組 12 造模后 327.33±19.43 369.30±10.55 16.13±0.61 SHR-ND組 12 造模前 130.17±7.60 330.15±13.06 15.03±0.52 SHR-ND組 12 造模后 304.42±19.57## 376.97±13.35 16.61±0.47 SHR-HF組 108 造模前 131.31±8.88 327.42±14.81 14.84±0.62 OBH-HF組 36 造模后 331.89±10.43△△ 389.35±13.36##△△ 17.48±0.64##△△

3.4 各組大鼠造模后糖脂代謝指標(biāo)比較

見表4。

表4 各組大鼠造模后糖脂代謝指標(biāo)比較（±s）

表4 各組大鼠造模后糖脂代謝指標(biāo)比較（±s）

注：與WKY-ND組比較，## P＜0.01；與SHR-ND組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 n FBG/（mmol·L-1）FIN/（mU·L-1） HOMA-IR TG/（mmol·L-1）TC/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）HDL-C/（mmol·L-1）WKY-ND 組 6 4.58±0.94 35.47±3.67 7.33±2.21 0.66±0.07 2.18±0.22 0.47±0.09 0.65±0.05 SHR-ND 組 6 4.67±1.17 31.89±8.23 6.67±2.50 0.61±0.06 1.35±0.18## 0.26±0.11## 0.49±0.08##OBH-HF組 18 4.95±1.53 35.29±4.56 7.68±2.29 0.63±0.08 1.53±0.14##△ 0.35±0.09##△ 0.32±0.04##△△

4 討論

SHR血壓升高與人類高血壓類似，均由多基因遺傳決定并受環(huán)境因素（包括飲食中的鈉、壓力、肥胖等）影響[12]。SHR出生后血壓隨鼠齡不斷升高，早期出現(xiàn)血管阻力增加，交感神經(jīng)過(guò)度激活[13]，4周齡時(shí)出現(xiàn)心臟重量增加，之后隨血壓升高進(jìn)一步出現(xiàn)心血管并發(fā)癥[14]。因此，本研究以目前國(guó)際公認(rèn)的接近人類原發(fā)性高血壓的疾病動(dòng)物模型SHR為基礎(chǔ)進(jìn)行研究。

基因與環(huán)境相互作用在人類疾病的病因?qū)W研究中越來(lái)越受到重視[15-17]，大鼠的自發(fā)突變和選擇性繁殖為肥胖、高血壓、高脂血癥等疾病提供了互補(bǔ)模型[18-19]。在嚙齒類動(dòng)物中，熱量攝入增加導(dǎo)致肥胖及代謝并發(fā)癥的發(fā)生與人類肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展類似[15]。針對(duì)肥胖高血壓動(dòng)物模型，有研究者利用高脂飼料喂養(yǎng)Sprague-Dawley大鼠品系，但后期僅部分大鼠出現(xiàn)血壓升高、血脂異常及肥胖，亦有研究者從Sprague-Dawley品系與SHR品系雜交出的后代中分離出一種新的突變鼠系，雖表現(xiàn)出血壓升高及高度肥胖，但不能較好地模擬肥胖作為血壓升高的后天因素[20-21]。肥胖Zucker大鼠（OZRs）是一種具有瘦素受體基因自發(fā)突變的大鼠品系，雖然會(huì)表現(xiàn)出遺傳性肥胖及高血壓，并伴有胰島素抵抗等代謝紊亂，但瘦素受體基因突變?cè)谌祟愔袠O為罕見[22]，人類肥胖及相關(guān)性疾病涉及多基因，Zucker 大鼠的研究結(jié)果就不能簡(jiǎn)單應(yīng)用于人類肥胖高血壓的研究。研究[23-24]表明，SHR高脂飲食喂養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)體質(zhì)量增加、血清膽固醇升高、血壓升高并伴隨心血管功能障礙，亦有報(bào)道其出現(xiàn)體質(zhì)量增加、收縮壓升高但不伴隨血脂、胰島素抵抗異常者，這是因?yàn)楦鞔x參數(shù)的變化與實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間、開始喂養(yǎng)的年齡及膳食成分的不同有關(guān)。總之，利用高脂飲食喂養(yǎng)SHR誘導(dǎo)建立肥胖高血壓疾病模型是可行且有依據(jù)的。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)改進(jìn)高脂飼料配方喂養(yǎng)SHR，干預(yù)10周結(jié)束后，篩選體質(zhì)量位于上游前1/3大鼠為肥胖高血壓模型大鼠。除體質(zhì)量外，本研究選取Lee指數(shù)及腹圍衡量大鼠的肥胖程度。Lee指數(shù)被稱為“營(yíng)養(yǎng)比”或“李指數(shù)”，可以綜合反映體質(zhì)量與體長(zhǎng)的比例關(guān)系，能更好地反映大鼠肥胖程度，腹圍大小可更好衡量腹型肥胖與否。本研究還發(fā)現(xiàn)肥胖高血壓大鼠伴隨血壓升高，易激惹程度較普通飼料喂養(yǎng)的SHR更為明顯，曾出現(xiàn)打斗致傷（后頸部、耳部等）。以上從大鼠行為學(xué)（易激惹程度）及各生理指標(biāo)包括體質(zhì)量、Lee指數(shù)、腹圍、收縮壓等方面支持模型成功建立。肥胖高血壓常伴隨多種心血管危險(xiǎn)因素如代謝綜合征、血脂異常、血糖異常等[25]。本研究生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果提示：10周后，肥胖高血壓大鼠較普通飼料高血壓大鼠TC、LDL-C升高，HDL-C降低，出現(xiàn)了脂代謝紊亂，可佐證模型成功建立，TG及FBG雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，且本研究后續(xù)觀察到高脂飼料喂養(yǎng)20周后，肥胖高血壓大鼠較普通飼料高血壓大鼠FBG明顯升高并表現(xiàn)出了胰島素抵抗。WKY普通飼料大鼠TC、LDL-C、HDL-C與其余2組的差異，在綜合考慮大鼠品系、膳食成分、干預(yù)周期等不同的前提下，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[26-27]。此外，本研究雖充分考慮到人類肥胖高血壓中遺傳因素的主導(dǎo)地位及后天環(huán)境因素影響，但還存在不足之處，針對(duì)后天飲食因素對(duì)肥胖高血壓影響，補(bǔ)充WKY高脂飼料組，會(huì)使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更加完善。

綜上所述，本研究以高脂飼料喂養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠成功誘導(dǎo)建立肥胖高血壓疾病動(dòng)物模型，并在行為學(xué)、理化指標(biāo)等方面與臨床肥胖高血壓病理特點(diǎn)基本相符，對(duì)研究肥胖高血壓及相關(guān)并發(fā)癥，值得借鑒利用。