基于化學(xué)成分相似性的川貝母莖葉藥效研究

戴 靜，劉博文，劉曉鳳，楊 杰，王執(zhí)一，鄧 妍，徐玉玲*，劉 濤

基于化學(xué)成分相似性的川貝母莖葉藥效研究

戴 靜1，劉博文1，劉曉鳳2，楊 杰3，王執(zhí)一1，鄧 妍1，徐玉玲1*，劉 濤4, 5

1. 成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610106 2. 四川天一學(xué)院，四川 德陽 618000 3. 四川康晨生物科技有限公司，四川 成都 611630 4. 四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610106 5. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106

在化學(xué)成分指引下對(duì)川貝母莖葉的藥效作用進(jìn)行研究，為川貝母莖葉的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法檢測川貝母莖葉及鱗莖中的化學(xué)成分，比較兩者的相似性，推測川貝母莖葉的功效。選擇兩者有代表性的30個(gè)共有化學(xué)成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究川貝母莖葉對(duì)肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘的作用靶點(diǎn)及其機(jī)制，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行藥效驗(yàn)證。檢測得到川貝母莖葉與鱗莖共有成分759個(gè)，篩選前30種主要化學(xué)成分，搜索得到藥物潛在靶點(diǎn)共1816個(gè)；檢索得到支氣管哮喘靶點(diǎn)2358個(gè)、肺炎靶點(diǎn)5014個(gè)、支氣管炎靶點(diǎn)1964個(gè)；川貝莖葉對(duì)肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘的共同靶點(diǎn)有333個(gè)，基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析得到GO條目762個(gè)（＜0.05），其中生物過程條目617個(gè)、細(xì)胞組成條目50個(gè)、分子功能條目95個(gè)，分別占81%、7%、12%；涉及的京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路主要有代謝通路和癌癥通路等。氨水引咳實(shí)驗(yàn)及化痰實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，莖葉水提組與可待因組和急支糖漿組比較，咳嗽次數(shù)無顯著差異，均能顯著增加小鼠酚紅排泌量。川貝母莖葉與鱗莖化學(xué)成分基本相同，可能與鱗莖具有相似的功效，川貝莖葉中的異鼠李素-7--葡糖苷（isorhamnetin-7--glucoside）、精胺（spermine）、-乙?；?-色氨酸（-acetyl--tryptophan）、γ-亞麻酸（γ-linolenic acid）等成分可能通過CCND1、EP300、CDK2、INS、EGF、CDC42、DNMT1、PARP1等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)代謝通路和癌癥通路等信號(hào)通路，發(fā)揮其止咳化痰作用，可為川貝母莖葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

川貝母；UPLC-MS/MS；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；止咳化痰；異鼠李素-7--葡糖苷；精胺；-乙酰基--色氨酸；γ-亞麻酸

川貝母為百合科植物川貝母D. Don、暗紫貝母Hsiao et K. C. Hsia、甘肅貝母Maxim、梭砂貝母Franch.、太白貝母P. Y. Li或瓦布貝母Hsiao et K. C. Hsia var.(S. Y. Tang et S. C. Yue) Z. D. Liu, S. Wang et S. C. Chen 的干燥鱗莖，為我國傳統(tǒng)可用于保健食品的名貴中藥材，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰之功效[1-3]。川貝母主產(chǎn)于我國四川甘孜州、阿壩州及青海、甘肅和西藏交界地區(qū)，主要生長在山坡草叢或陰濕的小灌木叢中。川貝母為3～4年生草本植物，由于生長環(huán)境特殊且種子休眠期長、自然萌發(fā)率低、野生資源過度采挖等原因而日趨瀕危[4]。由于川貝母療效顯著，使用安全，市場需求日益增大，隨之栽培技術(shù)發(fā)展及種植基地的擴(kuò)大，川貝母年產(chǎn)量可達(dá)上千噸，其莖葉生物蘊(yùn)藏量較大，每年在產(chǎn)地均自然枯苗未得到開發(fā)利用，造成了資源浪費(fèi)[5-7]。吳啟秀等[8]通過HPLC-ELSD法發(fā)現(xiàn)川貝母地上部分的生物堿成分與鱗莖的大部分相同，但未見系統(tǒng)的化學(xué)成分比較研究。藥物中所含的化合物是其藥效活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前多數(shù)研究基于一種或幾種代表性化合物相似性對(duì)藥物的藥效進(jìn)行預(yù)測，其科學(xué)性有待進(jìn)一步研究。

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量；質(zhì)譜分析是通過制備、分離、檢測氣相離子來檢測化合物的一種專門技術(shù)，是一種同時(shí)具備高特異性和高靈敏度的普適性方法；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)具有分析速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性高和多指標(biāo)同時(shí)分析等特點(diǎn)，已成為小分子物質(zhì)（包括目標(biāo)物及其代謝產(chǎn)物）定量分析的首選方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從整體上探索藥物與疾病的相關(guān)性，其利用計(jì)算機(jī)模擬和各種數(shù)據(jù)庫篩選藥物分子作用靶點(diǎn)，預(yù)測其信號(hào)通路和作用機(jī)制，采用相關(guān)軟件進(jìn)行化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)可視化，經(jīng)過拓?fù)鋮?shù)分析篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[9-11]，可對(duì)中藥的藥效和作用機(jī)制進(jìn)行理論預(yù)測。本研究采用UPLC-MS/MS方法對(duì)川貝母莖葉及鱗莖中的化學(xué)成分進(jìn)行了測定，比較其差異，根據(jù)化學(xué)成分的相似性來推測莖葉的主要功效，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)川貝莖葉對(duì)肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行初步探究，采用動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)對(duì)其藥效進(jìn)行驗(yàn)證，以期為川貝莖葉的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu Nexera X2超高效液相色譜（日本島津公司）；Applied Biosystems 4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Scientz-100F凍干機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Retsch研磨儀[MM 400，弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司]；LabServ移液槍（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）；高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）。

1.2 材料與試劑

川貝母莖葉（批號(hào)20200918B2，四川康晨生物科技有限公司），經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員鑒定為川貝母D. Don的莖葉；川貝母藥材（批號(hào)20200918B1，四川康晨生物科技有限公司），經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員鑒定為川貝母D. Don的鱗莖；甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）。苯酚紅（批號(hào)20190801，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；氨水（批號(hào)2016080501，成都市科龍化工試劑廠）；磷酸可待因（批號(hào)20180433，青海制藥廠有限公司）；急支糖漿（批號(hào)18110256，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司）；鹽酸溴己新（批號(hào)20190322，浙江萬邦藥業(yè)有限公司）；水為怡寶純凈水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠80只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半；均購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循國家或機(jī)構(gòu)的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法

2.1 UPLC-MS/MS檢測

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：水（含0.1%甲酸，A）-乙腈（含0.1%甲酸，B）；洗脫梯度：0～9 min，5%～95% B；9～10 min，95% B；10～11.1 min，95%～5% B；11.1～14 min，5% B；體積流量0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 線性離子阱（LIT）和三重四極桿（QQQ）掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex）控制運(yùn)行正負(fù)兩種離子模式。ESI源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/?4500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為344.7、413.7、172.4 kPa，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10、100 μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。通過進(jìn)一步的碰撞能量（DP）和去簇電壓（CE）優(yōu)化，完成了各個(gè)MRM離子對(duì)的DP和CE。根據(jù)每個(gè)時(shí)期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個(gè)時(shí)期監(jiān)測一組特定的MRM離子對(duì)。

2.1.3 供試品溶液的制備 川貝母及川貝母莖葉樣品用高速粉碎機(jī)粉碎后過3號(hào)篩，過篩后樣品放置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥；利用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg的粉末，溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中；每30分鐘渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，樣本置于4 ℃冰箱過夜；12 000 r/min離心10 min后，吸取上清，用0.22 μm微孔濾膜濾過樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。質(zhì)控樣本（QC）由川貝母鱗莖、川貝母莖葉樣本提取物等量混合制備而成。

2.1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理 定性定量原理：基于嘉興邁維代謝生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database），根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，分析時(shí)去除了同位素信號(hào)，含K+、Na+、NH4+的重復(fù)信號(hào)，以及本身是其他更大相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號(hào)。

代謝物定量是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的MRM模式分析完成（圖1）。MRM模式中，四級(jí)桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子（母離子），排除掉其他相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)對(duì)應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級(jí)桿過濾選擇出所需要的1個(gè)特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對(duì)所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[9-10]。

Q1代表母離子，Q3代表子離子

基于代謝數(shù)據(jù)庫，對(duì)樣本的代謝物進(jìn)行了質(zhì)譜定性定量分析。通過三重四級(jí)桿篩選出每個(gè)物質(zhì)的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號(hào)強(qiáng)度（CPS），用MultiaQuant軟件打開樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個(gè)色譜峰的峰面積代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量，最后導(dǎo)出所有色譜峰峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)保存[11-13]。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.2.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫有PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile. html）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/)；Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；VENNY（https:// bioinfogp.cnb.csic.es）；運(yùn)用的軟件有數(shù)據(jù)分析和做圖軟件Cytoscape 3.6.0.prism 6。

2.2.2 核心靶標(biāo)獲取 根據(jù)色譜峰面積，篩選出30種主要化學(xué)成分，通過PubChem數(shù)據(jù)庫，檢索得到化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)，在PharmMapper數(shù)據(jù)庫中檢索得到化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的UniprotID，運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入U(xiǎn)niprotID，轉(zhuǎn)化為基因名；根據(jù)咳嗽相關(guān)的臨床表型合集，查找臨床表現(xiàn)的英文詞條，以支氣管哮喘（bronchial asthma）、支氣管炎（bronchitis）、肺炎（pneumonia）為檢索詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病靶點(diǎn)預(yù)測分析，建立咳嗽的相關(guān)基因集。利用Venny2.0網(wǎng)站找出成分基因與疾病基因的交集基因。

2.2.3 靶點(diǎn)通路分析 為進(jìn)一步觀察作用靶標(biāo)的生物學(xué)功能，將所有交集基因?qū)氲紻AVID數(shù)據(jù)庫中對(duì)其進(jìn)行通路富集分析。在DAVID的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，Select Identifier選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type設(shè)置為“Gene List”，提交基因列表；為所提交的基因列表選擇對(duì)應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，選擇基因本體論（gene ontology，GO）生物學(xué)過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，點(diǎn)擊“Functional Annotation Chart”獲得通路富集結(jié)果[14-16]。將3種GO分析結(jié)果分別選擇前20個(gè)用GraphPad Prism 6.0軟件繪制柱狀圖。選擇KEGG分析結(jié)果前20條信號(hào)通路使用Omicshare數(shù)據(jù)庫（http://www.omicshare.com）繪制成氣泡圖。

2.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果，選擇前30個(gè)通路，整理出對(duì)應(yīng)基因，上傳到STRING數(shù)據(jù)庫中，選擇“Multiple proteins”，選擇物種人類“Homo sapiens”，點(diǎn)擊“search”，保存分析結(jié)果圖片及文件。

2.2.5 “成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 根據(jù)KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果前30個(gè)通路對(duì)應(yīng)基因，找出對(duì)應(yīng)化學(xué)成分，再根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)文件，構(gòu)建成分、核心靶標(biāo)和關(guān)鍵通路之間相互作用關(guān)系表，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥材-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行可視化分析，進(jìn)一步探討川貝母莖葉止咳作用的分子機(jī)制。

2.3 藥效實(shí)驗(yàn)

2.3.1 川貝母莖葉水提物制備 在5 L圓底燒瓶中加入300.0 g川貝母莖葉，加入3 L水，浸泡1 h，開始加熱，回流提取1 h，將提取液濾過，80 ℃減壓濃縮成浸膏，再80 ℃減壓干燥得到水提取物21.641 3 g。

2.3.2 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。分別為模型組（純化水）、川貝母莖葉水提組（0.50 g/kg）、可待因組（12 mg/kg）和急支糖漿組（0.02 mL/g）。均ig給藥，劑量為0.02 mL/g，連續(xù)7 d，于末次給藥1 h后，將小鼠置于自制密閉玻璃容器內(nèi)，超聲霧化噴入氨水，20 s后立即取出小鼠，記錄小鼠咳嗽潛伏期和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

2.3.3 小鼠酚紅排泌實(shí)驗(yàn) 取昆明種小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。分別為模型組（純化水），川貝母莖葉水提組（0.50 g/kg）、溴己新組（4.8 mg/kg）和急支糖漿組（0.02 mL/g）。各組動(dòng)物ig給予相應(yīng)藥物，對(duì)照組給予等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥3 d，第3天ig給藥30 min后，ip一定質(zhì)量濃度酚紅10 μL（0.5 mg）/g體質(zhì)量，注射后30 min，處死動(dòng)物，剝離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2 mL 0.9%氯化鈉溶液試管中，加0.1 mL氫氧化鈉（1 mol/L），于546 nm波長處測定吸光度（）。以酚紅質(zhì)量濃度（0.1、0.3、0.5、2.5、5.0、12.5 mg/L）為橫坐標(biāo)（），對(duì)應(yīng)值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程＝0.102 68＋0.019 69，＝0.999 9，由標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算酚紅排泌量。

3 結(jié)果

3.1 川貝母莖葉成分檢測

3.1.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)定性定量分析 利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。得到混樣QC樣本的總離子流圖（total ions current，TIC），見圖2。MRM代謝物檢測多峰圖（多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC），見圖3。

圖2 混樣QC樣品質(zhì)譜分析總離子流圖

圖3 MRM代謝物檢測多峰圖

為了比較所有檢測到的代謝物中每個(gè)代謝物在不同樣本中的物質(zhì)含量差異，根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰形的信息，對(duì)每個(gè)代謝物在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，以確保定性定量的準(zhǔn)確。圖4展示了隨機(jī)抽取的代謝物（-threo-3-methyl- aspartate）在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果。

3.1.2 川貝母莖葉成分鑒定 在UPLC-MS/MS檢測條件下，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出，從川貝母鱗莖中檢測了767個(gè)化學(xué)成分，從川貝母莖葉中檢測了833個(gè)化學(xué)成分，交集成分759個(gè)，占總成分90.2%，見圖5，占川貝母鱗莖成分的98.96%，表明莖葉與鱗莖可能有相同的清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰的功效[17-18]，在臨床上可用于肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘的治療。根據(jù)峰面積顯示，交集成分主要有生物堿、有芬酸類、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，包括2-甲基-3-氧代琥珀酸、鄂貝乙素、2-(甲酰氨基)苯甲酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、西貝母堿等。根據(jù)其峰面積大小進(jìn)行排序，再參考《中國藥典》2020版一部“川貝母”項(xiàng)下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中定量測定指標(biāo)，篩選出30種主要成分，如表1所示。

圖中為隨機(jī)抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果，峰面積代表物質(zhì)在樣本中相對(duì)含量，cps為某代謝物離子檢測的離子流強(qiáng)度

圖5 川貝母與川貝母莖葉化合物交集

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.2.1 核心靶標(biāo)獲取 將篩選出的30種主要化學(xué)成分，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫搜索得到藥物潛在靶點(diǎn)共1816個(gè)，主要包括基因組多蛋白、細(xì)胞分裂蛋白ftsZ同源物1、無機(jī)焦磷酸酶、脫氧蘇氨酸合酶、FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物相關(guān)蛋白等；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到支氣管哮喘靶點(diǎn)2358個(gè)、肺炎靶點(diǎn)5014個(gè)、支氣管炎靶點(diǎn)1964個(gè)，通過Venny2.0得出主要成分對(duì)肺炎、支氣管炎、支氣管哮喘的交集基因有333個(gè)（圖6），包括GLRB、ANXA1、VDR、DNMT1、GCDH、MERTK、ECE1、SYP、TPO、NMT1等，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)包括髓過氧化物酶、膜聯(lián)蛋白A5、肌紅蛋白、補(bǔ)體C2、溶菌酶、芳基硫酸酯酶A、乳鐵蛋白、腺苷同型半胱氨酸酶、去鐵素、膜聯(lián)蛋白A4等。

表1 川貝母莖葉與鱗莖主要交集成分

*表示存在同分異構(gòu)體

*indicates the presence of isomers

圖6 成分基因與疾病基因交集

3.2.2 靶點(diǎn)通路分析 DAVID中GO功能富集分析得到GO條目762個(gè)（＜0.05），其中包括代謝過程、有機(jī)物代謝過程、有機(jī)氮化合物代謝過程、氮化合物代謝過程、細(xì)胞代謝過程、初級(jí)代謝過程、對(duì)刺激的反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程的調(diào)控、對(duì)有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、發(fā)展過程等生物過程（biological process，BP）條目617個(gè)，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)受體、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞器腔、細(xì)胞器、膜結(jié)合細(xì)胞器等細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目50個(gè)，包括結(jié)合、催化活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、離子結(jié)合、雜環(huán)化合物結(jié)合、小分子結(jié)合等分子功能（molecular function，MF）條目95個(gè)，分別占81%、7%、12%。分別選擇前20個(gè)用GraphPad Prism 6.0軟件繪制柱狀圖，結(jié)果見圖7。KEGG通路富集篩選得到125條信號(hào)通路（＜0.05），涉及代謝途徑、癌癥的途徑、病毒致癌、前列腺癌、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、百日咳、局灶性粘連、EB病毒感染結(jié)核等。選擇前30條信號(hào)通路，使用Omicshare 數(shù)據(jù)庫繪制氣泡圖，見圖8，前30條通路的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖9，具體信息見表2。

圖7 交集基因GO富集分析前20個(gè)通路

圖8 交集基因KEGG富集分析前30個(gè)通路氣泡圖

圖9 KEGG前30條通路基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 川貝母莖葉與川貝母交集成分基因與咳嗽疾病交集基因KEGG通路

3.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)由Cytoscape 3.7.0構(gòu)建得到121個(gè)節(jié)點(diǎn)，如圖10所示，其中藍(lán)色為對(duì)應(yīng)化學(xué)成分、紫色為對(duì)應(yīng)基因、綠色為對(duì)應(yīng)通路。結(jié)果采用度（degree）、平均最短路徑（average shortest path length，ASPL）、中介中心度（betweenness centrality，BC）和接近中心性（close to centrality，CC）排序確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中度值≥中位數(shù)（成分度值中位數(shù)＝6.6，靶標(biāo)度值中位數(shù)＝14.9，通路度值中位數(shù)＝15.7）的成分分別是精胺（spermine）、異鼠李素-7--葡糖苷（isorhamnetin-7--glucoside）、組蛋白醇（histidinol）、-乙酰基--色氨酸（-acetyl--tryptophan）、γ-亞麻酸（γ-linolenic acid）、2,3-二羥基苯甲酸（2,3-dihydroxybenzoic acid）、琥珀酰腺苷（succinyladenosine）、2-甲基-3-氧代琥珀酸（2-methyl-3-oxosuccinic acid）。靶標(biāo)有INS、EGF、CCND1、ERBB2、EP300、IL10、CAT、MDM2、CREBBP、PTGS2、CDC42、MMP9、IGF1R、KDR、CDK2等。通路主要有代謝途徑（metabolic pathways）、癌癥的通路（pathways in cancer）、病毒致癌通路（viral carcinogenesis）、Ras信號(hào)通路（Ras signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Rap1信號(hào)通路（Rap1 signaling pathway）、人乳頭瘤病毒感染通路（human papillomavirus infection）、花生四烯酸代謝通路（arachidonic acid metabolism）、結(jié)核（tuberculosis）、百日咳（pertussis）等，見表3。

藍(lán)色代表川貝母莖葉與川貝母交集成分，紫色代表對(duì)應(yīng)靶標(biāo)，綠色代表相關(guān)通路

以上研究表明，川貝母莖葉中含有對(duì)咳嗽有效的化學(xué)成分，對(duì)肺炎、支氣管炎和支氣管哮喘可能具有一定藥效，并通過多靶點(diǎn)多通路相結(jié)合的治療機(jī)制發(fā)揮其治療作用。

3.3 藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 止咳實(shí)驗(yàn) 采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，氨水引咳小鼠的影響見表4。與模型組比較，莖葉水提組、可待因組和急支糖漿組均能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期并減少小鼠咳嗽次數(shù)（＜0.05、0.01）；莖葉水提組與可待因組和急支糖漿組比較，咳嗽潛伏期無顯著差異，咳嗽次數(shù)莖葉水提組與可待因比無顯著差異。

表3 網(wǎng)絡(luò)中通路的拓?fù)鋮?shù)分析

表4 對(duì)氨水引咳小鼠的影響()

與模型組比較：*＜0.05，**＜0.01；與莖葉水提物組比較：△△＜0.01，下同

*< 0.05**< 0.01model group;△△<0.01stem and leaf water extract group,same as below

3.3.2 化痰實(shí)驗(yàn) 采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，小鼠酚紅排泌量比較見表5。與模型組比較，莖葉水提組、溴己新組和急支糖漿組均能顯著增加小鼠酚紅排泌量（＜0.05、0.01）；莖葉水提組與溴己新組和急支糖漿組比較，有極顯著差異（＜0.01）。

表5 對(duì)小鼠酚紅排泌量比較()

4 討論

我國“十三五”中醫(yī)藥科技創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃中要求對(duì)藥用資源最大化進(jìn)行綜合利用，川貝母作為我國傳統(tǒng)中藥材，對(duì)肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、痰中帶血、療痂、乳癰、肺癰等臨床病癥具有極好的療效[17-20]，其非藥用部分莖葉藥用價(jià)值的開發(fā)利用具有極其重要的意義。

藥物的藥效與其物質(zhì)基礎(chǔ)有相關(guān)性，藥物中所含的化合物是其藥效活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用UPLC-MS/MS方法，對(duì)川貝母莖葉及鱗莖的化學(xué)成分進(jìn)行定性定量研究，測定出了近千種化合物，解決了目前僅基于一種或幾種代表性化合物相似性對(duì)藥物的藥物的藥效進(jìn)行預(yù)測的問題。在本研究條件下，川貝母莖葉與其鱗莖的化合物種類重合率達(dá)到90.2%，表明兩者可能具有相似的藥效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性和注重藥物與靶點(diǎn)間相互作用的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點(diǎn)相吻合，可在一定程度上解決傳統(tǒng)中藥研究中“單一成分-單一靶點(diǎn)-單一途徑”的局限性。本研究采用UPLC-MS/MS及高通量篩選的方法代替數(shù)據(jù)庫篩選，定性定量地檢測出川貝母莖葉及鱗莖所含成分，解決了一般網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多采用數(shù)據(jù)庫直接篩選藥材化學(xué)成分進(jìn)行分析，忽略了所篩選成分含量的高低[21]的問題。由于工作量和論文篇幅的限制，不能對(duì)共有的759個(gè)成分都進(jìn)行分析。由于所用樣本檢測采用相對(duì)定量，故可以用峰面積代表代謝物成分高低。本研究以檢測成分的峰面積為依據(jù)，選擇了30種化學(xué)成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)川貝母莖葉治療支氣管炎、肺炎和支氣管哮喘3種咳嗽疾病的交集基因網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)推測，篩選出其治療機(jī)制的28種主要化學(xué)成分、178種對(duì)應(yīng)靶標(biāo)和30種治療通路，其中包含結(jié)核、百日咳等與咳嗽相關(guān)的通路，表明其對(duì)支氣管炎、肺炎和支氣管哮喘具有較好療效。在此基礎(chǔ)上，采用動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)表明川貝母莖葉水提物具有止咳化痰的作用，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證?；趯?shí)驗(yàn)分析的需要，在UPLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)中，2種供試品使用70%甲醇作為提取溶媒，比較兩者在同一提取條件下成分的異同，結(jié)果表明兩者成分基本一致，在此信息提示下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)川貝母莖葉的止咳化痰藥效作用進(jìn)行了研究探討，在藥效實(shí)驗(yàn)中，基于藥材傳統(tǒng)的臨床用法，以水為溶媒對(duì)其提取，確認(rèn)其藥效。

本研究方法即通過UPLC-MS/MS及高通量篩選對(duì)非藥用部位及藥材主要成分進(jìn)行定性定量分析，通過主要成分的對(duì)比，根據(jù)兩者主要成分的相似性，推測該非藥用部位是否具有與對(duì)應(yīng)藥材相同的藥效，再根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否具有相應(yīng)藥理作用，可為中藥材非藥用部位以及對(duì)應(yīng)藥渣的開發(fā)研究提供新的路線。

本研究基于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫的分析方式對(duì)植物的化學(xué)組成進(jìn)行分析存在一定局限性，如數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)據(jù)不完全，植物的次生代謝產(chǎn)物多樣，但分析結(jié)果能為下一步研究提供參考。目前采用的小鼠氨水引咳藥理模型和氣管段酚紅排泌量對(duì)莖葉的藥效進(jìn)行了驗(yàn)證，模型較為簡單，仍有待進(jìn)一步研究。

志謝：嘉興邁維代謝生物科技有限公司對(duì)川貝母莖葉及鱗莖進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測及分析數(shù)據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Efficacy research of stems and leaves ofbased on similarity of chemical components

DAI Jing1, LIU Bo-wen1, LIU Xiao-feng2, YANG Jie3, WANG Zhi-yi1, DENG Yan1, XU Yu-ling1, LIU Tao4, 5

1. Sichuan Institute of Antibiotic Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China 2. Sichuan Tianyi College, Deyang 618000, China 3. Sichuan Kangchen Biotechnology Co., Ltd., Chengdu 611630, China 4. Sichuan Engineering Research Center for Antiviral Traditional Chinese Medicine Industrialization, Chengdu 610106, China 5. College of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China

Under the exploration of the chemical composition, the pharmacodynamic reaction of the stems and leaves of Chuanbeimu () was studied, which provides a basis for the comprehensive development and utilization of the stems and leaves of.The UPLC-MS/MS method was used to detect the chemical components of the stems, leaves and bulbs of, then the similarity of the chemical components was compared and its efficacy was speculated. Under the basis of the 30 representative common chemical components of the stems, leaves and bulbs ofand the guidance of network pharmacology, the targets and mechanisms of the stems and leaves ofagainst pneumonia, bronchitis, and bronchial asthma were studied, and its efficacy was verified by animal experiments.A total of 759 constituents in stems, leaves and bulbs ofwere identified by UPLC-MS/MS method, and a total of 1816 potential drug targets were obtained by screening the top 30 main chemical components; The number of targets for bronchial asthma was 2358, the number of targets for pneumonia was 5014, and the number of targets for bronchitis was 1964; The stems and leaves ofhad 333 common targets for pneumonia, bronchitis and bronchial asthma. GO functional enrichment analysis obtained 762 GO entries (＜0.05), which included 617 biological process (BP) entries, 50 cell composition (CC) entries and 95 molecular function (MF) entries, accounting for 81%, 7% and 12% respectively; KEGG signaling pathways involved mainly included metabolic pathways and pathways in cancer, etc. The results of the ammonia water cough and the phlegm-resolving experiment showed that there was no significant difference in the number of coughs between the stem and leaf water extraction group and the codeine group and the emergency syrup group, and both of them significantly increased the mice phenol red excretion.The stems and leaves ofhave basically the same chemical composition as the bulbs, and may have similar effects with the bulbs. The isorhamnetin-7--glucoside, spermine,-acetyl--tryptophan, γ-linolenic acid and other ingredients may regulate metabolic pathways and pathways in cancer and other signaling pathways through CCND1, EP300, CDK2, INS, EGF, CDC42, DNMT1, PARP1 and other targets, exerting their cough-reducing and phlegm-reducing effects, which can provide the references for the further development and utilization of the stems and leaves of.

D. Don; UPLC-MS/MS; network pharmacology; cough-reducing and phlegm-reducing; isorhamnetin- 7--glucoside; spermine;-acetyl--tryptophan; γ-linolenic acid

R285；R284.1

A

0253 - 2670(2021)16 - 4942 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.019

2021-02-21

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1701900）；四川省科技成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化示范項(xiàng)目2020ZHCG0073）；四川省科學(xué)技術(shù)廳2020年省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（20YYJC1839）；2020廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（GXZYKF2020-04）

戴 靜（1997—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)研究。Tel: 15102879297 E-mail: 3091619772@qq.com

徐玉玲（1975—），碩士，副教授，主要從事中成藥新藥開發(fā)及再評(píng)價(jià)工作。Tel: (028)61302236 E-mail: xuyuling@cdu.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]