基于多元統(tǒng)計(jì)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的炒酸棗仁飲片質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

李 澤，杜 鶴，解玉軍，衡依然，段慧竹，裴香萍，閆 艷，杜晨暉*

基于多元統(tǒng)計(jì)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的炒酸棗仁飲片質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

李 澤1，杜 鶴1，解玉軍1，衡依然1，段慧竹1，裴香萍1，閆 艷2*，杜晨暉1*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030619 2. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

基于多元統(tǒng)計(jì)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)炒酸棗仁飲片潛在的質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）。利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbital trap mass spectrometry，UHPLC-Q-Orbitrap-MS）解析生、炒酸棗仁飲片的主要成分，運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合VIP＞1和＜0.05篩選出炮制前后潛在的差異化學(xué)成分。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選核心靶點(diǎn)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測(cè)炒酸棗仁潛在的Q-Marker，以潛在Q-Marker為指標(biāo)對(duì)市售樣品進(jìn)行含量測(cè)定，驗(yàn)證Q-Marker的科學(xué)性。生、炒酸棗仁共鑒定54個(gè)化學(xué)成分，包括斯皮諾素、當(dāng)藥黃素等黃酮類成分，酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B等皂苷類成分，以及木蘭花堿、烏藥堿等生物堿類成分；結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析共找到木蘭花堿、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸等28個(gè)差異性成分；經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選出包括17個(gè)差異成分的Q-Marker庫(kù)，分別為酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、美洲茶酸、白樺脂酸、木蘭花堿、烏藥堿、去甲荷葉堿、巴婆堿、斯皮諾素、當(dāng)藥黃素、維采寧II、6???-對(duì)-香豆酰斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、芹菜素、樺木酮酸、牡荊素、異牡荊素；結(jié)合課題組前期研究及市售樣品測(cè)定結(jié)果，最終確定木蘭花堿、烏藥堿、斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B作為炒酸棗仁的Q-Marker。分析預(yù)測(cè)的Q-Marker為炒酸棗仁的整體質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為其功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)的研究及作用機(jī)制的闡釋奠定基礎(chǔ)。

多元統(tǒng)計(jì)分析；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；酸棗仁；炒酸棗仁；質(zhì)量標(biāo)志物；UHPLC-Q-Orbitrap-MS；成分-靶點(diǎn)-通路；木蘭花堿；烏藥堿；斯皮諾素；6???-阿魏酰斯皮諾素；酸棗仁皂苷；整體質(zhì)量控制

酸棗仁（ZSS）來(lái)源于鼠李科植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，其味甘酸、性平，歸心、肝、膽經(jīng)，具有養(yǎng)心益肝、安神、斂汗之功[1]?，F(xiàn)代研究表明，酸棗仁主要藥理作用有鎮(zhèn)靜催眠[2-3]、抗驚厥[4]、抗焦慮[5]、改善心肌缺血[6]、改善學(xué)習(xí)記憶能力[7]等。在傳統(tǒng)中醫(yī)的臨床用藥中，《本草圖經(jīng)》：“今醫(yī)家兩用，睡多生使，不得睡炒熟，生熟便爾頓異”，即酸棗仁生品與炮制品用來(lái)治療不同的疾病?，F(xiàn)代研究表明酸棗仁生品和炮制品均具有鎮(zhèn)靜安神作用，以炒酸棗仁fried（FZSS）的作用更強(qiáng)，且目前臨床使用最多的亦是炒酸棗仁。《中國(guó)藥典》2020年版中生、炒酸棗仁的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相同，但現(xiàn)代文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁在炒制后斯皮諾素[8]、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B[9]等有效化學(xué)成分的含量及溶出率[10]存在差異，化學(xué)成分的改變是否會(huì)在一定程度上造成生、炒酸棗仁的臨床應(yīng)用有所不同？基于此，通過研究生、炒酸棗仁中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)差異，從而預(yù)測(cè)炒酸棗仁飲片的質(zhì)量標(biāo)志物是非常有必要的。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）是近年來(lái)由劉昌孝院士團(tuán)隊(duì)提出的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制的核心概念[11-12]。中藥Q-Marker是代表某種中藥特征的標(biāo)志物，其來(lái)源明確，與功效用途相關(guān)聯(lián)，是反映一味中藥質(zhì)量特征的化合物組合，也是近年來(lái)開展中藥質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要方向。因此，進(jìn)一步明確炒酸棗仁飲片的Q-Marker，對(duì)于炒酸棗仁飲片的質(zhì)量控制是十分必要的。本課題組前期對(duì)酸棗仁的化學(xué)成分[13]、體內(nèi)代謝[14]、物質(zhì)基礎(chǔ)[15]、作用機(jī)制[16]進(jìn)行深入研究，并在研究其質(zhì)量標(biāo)志物方面取得一定進(jìn)展[17-18]。本研究結(jié)合課題組已有成果，利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbital trap mass spectrometry，UHPLC-Q-Orbitrap-MS）與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法，篩選出生、炒酸棗仁潛在的差異化學(xué)成分，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)這些潛在的化學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行驗(yàn)證，預(yù)測(cè)炒酸棗仁潛在的Q-Marker，闡明“成分-靶點(diǎn)-通路”之間的關(guān)系，為炒酸棗仁飲片的整體質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Thermo ScientificTMQ ExactiveTMOrbitrap質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Waters e 2695高效液相色譜儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度泵、柱溫箱、UV檢測(cè)器以及Empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司；ELSD 6000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)奧泰公司；油浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；Neofuge 13R高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；渦旋儀，Thermo Scientifc公司；FA3204B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；DNA120離心濃縮儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 藥材和試劑

收集市售不同產(chǎn)地生酸棗仁、炒酸棗仁各10批，詳細(xì)信息見表1。由山西中醫(yī)藥大學(xué)杜晨暉教授鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子。樣品保存于山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定實(shí)驗(yàn)室。

對(duì)照品：烏藥堿（批號(hào)HC225036198）、木蘭花堿（批號(hào)20160710）、維采寧II（批號(hào)HV187847198）、斯皮諾素（批號(hào)20160314）、6???-阿魏酰斯皮諾素（批號(hào)20160303）、酸棗仁皂苷A（批號(hào)20160315）均購(gòu)于寶雞市辰光生物科技有限公司；酸棗仁皂苷B（批號(hào)20170210）購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司；所有對(duì)照品經(jīng)HPLC測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；色譜級(jí)、質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈和甲酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純。

表1 市售生、炒酸棗仁樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 炒酸棗仁飲片制備方法

生酸棗仁（ZSS6）經(jīng)檢驗(yàn)質(zhì)量符合《中國(guó)藥典》2020年版一部酸棗仁項(xiàng)下規(guī)定。稱取50 g，鍋溫設(shè)置為170 ℃，穩(wěn)定10 min后將酸棗仁平鋪于鍋底，不斷翻炒，炒制5 min后取出，放涼，即得炒酸棗仁，平行制備6份。酸棗仁粉碎過篩（60目）。

2.2 生、炒酸棗仁化學(xué)成分分析

2.2.1 樣品制備 精密稱定生、炒酸棗仁粉末2 g，置于索氏提取器中，加石油醚50 mL浸泡過夜，再加入40 mL，90 ℃加熱回流4 h，藥渣揮去溶劑轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加50 mL 70%乙醇回流提取2 h，過濾，藥渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并濾液揮干，甲醇復(fù)溶并定容至10 mL，過0.22微孔濾膜即得UPLC-MS供試品溶液。分別從各樣品溶液中取等量溶液，混勻作為質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC?HSS T3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，洗脫梯度：0～8 min，5%～17%乙腈；8～10 min，17%乙腈；10～11 min，17%～18%乙腈；11～12 min，18%～20%乙腈；12～17 min，20%～23%乙腈；17～22 min，23%～33%乙腈；22～30 min，33%～60%乙腈；30～32 min，60%～100%乙腈；32～34 min，100%乙腈；34～36 min，100%～5%乙腈；36～40 min，5%乙腈；體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源；正、負(fù)離子切換掃描；工作模式Full MS/dd MS2；質(zhì)譜參數(shù)為鞘氣流速40 arb（ESI+）、38 arb（ESI?）；輔助氣流速5 arb（ESI+）、10 arb（ESI?）；噴霧電壓3.2 kV（ESI+）、2.5 kV（ESI?）；毛細(xì)管溫度320 ℃；離子源溫度350 ℃（ESI+）、300 ℃（ESI?）；一級(jí)全掃描分辨率70 000 FWHM，二級(jí)掃描分辨率為17 500 FWHM，質(zhì)荷比窗口寬度為/2.0；掃描范圍/100～1500；動(dòng)態(tài)排除持續(xù)時(shí)間8 s。

2.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 UPLC-MS數(shù)據(jù)采用Thermo自帶的Compound Discoverer 2.0軟件對(duì)LC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行峰的解卷積、峰對(duì)齊、峰校準(zhǔn)和歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理，生成包含保留時(shí)間（retention time）和峰面積（peak area）的兩維數(shù)據(jù)矩陣。此外，利用Thermo Xcalibur 3.0工作站同時(shí)匹配mzCloud、ChemSpider、PlantCyc在線數(shù)據(jù)庫(kù)和自建化合物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。整理數(shù)據(jù)格式后，導(dǎo)入SIMCA-P（Umetrics公司）軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析（PCA、OPLS-DA、S-plot）。采用SPSS 16.0軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism（version 8.0，GraphPad Software，Inc.）軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行半定量分析。

2.2.5 化學(xué)成分鑒定 結(jié)合文獻(xiàn)檢索及課題組前期研究成果[19-20]，在本次生、炒酸棗仁中共鑒定出54個(gè)成分，見表2，其中正離子模式下鑒定出35個(gè)，負(fù)離子模式下鑒定出42個(gè)。54個(gè)成分包括12個(gè)生物堿、15個(gè)皂苷和27個(gè)黃酮類化合物。對(duì)比生、炒酸棗仁的圖譜（圖1）可直觀發(fā)現(xiàn)兩者的化學(xué)成分基本相同，其中原酸棗仁皂苷A（S-33）、芹菜素（F-40）、樺木酮酸（S-54）僅在生酸棗仁中可被鑒定，而牡荊素（F-7）、異牡荊素（F-15）、異當(dāng)藥黃素（F-17）、6???-(β--glucopyranosyl)-2????,3????- dihydro-2????-oxo-3????-yl-acetatespinosin（F-23）、6??-阿魏酰-6???-香豆酰斯皮諾素（F-39）只在炒酸棗仁中檢測(cè)到。由此可知，酸棗仁在炒制過程中部分化學(xué)成分發(fā)生變化。

2.2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析 擬采用多元統(tǒng)計(jì)分析的方法對(duì)生、炒酸棗仁中差異性成分進(jìn)行分析。主成分分析（principal component analysis，PCA）的得分散點(diǎn)圖能直觀地顯示不同樣品之間的整體差異，由圖2-A和圖3-A所示，正、負(fù)離子模式下，QC樣本均緊密的聚集在一起，表明實(shí)驗(yàn)過程儀器精密度良好。正離子模式下，由主成分1（58.7%）和主成分2（20.4%）為坐標(biāo)構(gòu)建PCA得分散點(diǎn)圖，生、炒酸棗仁可沿t1軸分開；負(fù)離子模式下，由主成分1（54.8%）和主成分2（27.4%）為坐標(biāo)構(gòu)建PCA得分散點(diǎn)圖，生、炒酸棗仁可沿t2軸分開，直觀表明出生、炒酸棗仁之間具有良好的分離趨勢(shì)，說(shuō)明生、炒酸棗仁中化學(xué)成分存在一定差異。

表2 UPLC-MS技術(shù)鑒定生、炒酸棗仁化學(xué)成分

續(xù)表2

序號(hào)化合物tR/min分子式[M＋H]+m/z偏差/(×10?6)碎片離子[M－H]?/[M－COOH]?m/z偏差/(×10?6)碎片離子ZSSFZSS F-21異牡荊素-2??-O-(6-對(duì)香豆酰)-吡喃葡萄糖苷16.70C36H36O17741.203 5741.202 50.001 0147.044 27, 313.070 80, 283.060 18, 337.070 71, 433.112 88739.188 5739.188 00.000 5293.045 78, 413.088 71, 161.059 43, 593.155 82, 205.050 00++ F-22異牡荊素-2″-O-(6-阿魏酰)-吡喃葡萄糖苷16.85C37H38O18771.213 3771.213 10.000 2177.054 75, 313.070 62, 145.028 59, 283.060 06, 337.070 86769.199 2769.198 50.000 7293.045 81, 413.088 50, 235.060 62, 193.050 02, 134.036 07++ F-236???-(N-β-D-glucopyranosyl)-2????,3????-dihydro-2????-oxo-3????-yl-acetate spinosin17.60C44H49NO22????958.262 3958.263 1?0.000 8649.178 59, 469.114 59, 292.039 25, 146.023 77, 307.062 44?+ A-24巴婆堿17.84C17H17NO2268.104 3268.103 30.001 0251.106 86, 219.080 78, 191.085 83, 252.110 20, 286.083 36????++ F-256′′′-芥子酰斯皮諾素17.94C39H42O19815.240 5815.239 30.001 2207.065 48, 327.086 55, 175.039 23, 351.083 80, 297.075 90813.225 3813.224 80.000 5427.104 00, 292.038 21, 190.026 23, 311.079 50, 265.071 96++ F-266′′′-二羥苯基酰斯皮諾素17.95C43H52O19873.317 6873.318 4?0.000 8327.086 40, 351.086 36, 297.075 93, 323.091 55, 331.122 04871.303 0871.304 1?0.001 1427.103 24, 307.061 28, 607.161 68, 292.038 09, 309.041 78++ F-276′′′-對(duì)香豆酰斯皮諾素18.29C37H38O17755.218 9755.218 20.000 7147.044 28, 327.086 43, 351.068 62, 297.075 78, 429.116 94753.203 7753.203 60.000 1145.028 15, 753.204 10, 163.038 88, 292.038 02, 119.048 65++ F-286′′′-阿魏酰斯皮諾素18.48C38H40O18785.228 6785.228 7?0.000 1177.054 52, 327.085 97, 145.028 43, 351.086 00, 297.075 56783.215 1783.214 20.000 9783.216 67, 134.035 98, 292.037 96, 427.103 94, 193.049 73++ A-29mucronine J20.39C27H40N4O4485.312 4485.312 20.000 2114.128 14, 72.081 64, 485.312 41, 58.066 10, 115.131 45????++ A-30去甲荷葉堿20.61C18H19NO2282.112 7282.148 8?0.036 1265.122 28, 250.098 83, 234.103 39, 266.125 85, 282.149 08????++ F-316???-(?)-phaseoylspinosin21.18C43H50O19871.301 9871.303 0?0.001 1327.086 43, 351.086 73, 297.075 81, 393.097 44, 429.118 29869.287 4869.288 1?0.000 7427.104 74, 292.037 72, 307.061 49, 607.162 60, 325.073 94++ F-326′′-阿魏酰異斯皮諾素21.87C38H40O18785.228 6785.228 7?0.000 1117.054 76, 447.128 94, 327.086 40, 145.028 63, 285.075 87783.215 1783.214 20.000 9161.023 50, 783.213 38, 175.038 97, 325.070 74, 607.166 99++ S-33原酸棗仁皂苷A22.90C64H106O32????1 385.659 21 385.659 4?0.000 2949.466 86, 1 081.508 54, 1 385.660 52, 625.360 84, 787.414 86+? F-34槲皮素23.19C15H10O7????301.035 4301.035 30.000 1310.035 49, 151.002 47, 178.997 50, 107.012 11, 65.001 66++ A-35sanjoinine A23.38C31H42N4O4535.292 1535.327 9?0.035 8148.112 27, 149.115 72, 133.088 84, 105.070 53, 72.607 95????++ S-36酸棗仁皂苷H23.54C58H96O27????1 223.607 11 223.606 60.000 5787.413 45, 625.360 35, 1 223.607 67, 919.456 12, 131.033 63++ S-37酸棗仁皂苷G24.86C52H86O22????1 107.558 21 107.558 10.000 11 061.560 55, 929.511 90, 911.490 54, 749.445 98, 625.358 46++ A-38lotusanine A25.02C31H42N4O4535.292 1535.327 9?0.035 8148.112 21, 149.115 83, 133.088 84, 287.175 66, 86.097 08????++ F-396??-阿魏酰-6???-香草酰斯皮諾素25.41C46H46O21????933.245 9933.249 0?0.003 1577.134 64, 292.038 54, 235.061 55, 175.039 25, 134.035 90?+ F-40芹菜素25.71C15H10O5????269.045 5269.045 7?0.000 2225.054 78, 151.002 53, 117.032 50, 133.813 17, 107.012 12+?

續(xù)表2

序號(hào)化合物tR/min分子式[M＋H]+m/z偏差/(×10?6)碎片離子[M－H]?/[M－COOH]?m/z偏差/(×10?6)碎片離子ZSSFZSS A-41amphibine D25.83C36H49N5O5632.381 4632.380 60.000 8148.112 24, 289.191 13, 261.196 26, 344.196 96, 149.115 75630.366 6630.366 10.000 5342.182 46, 630.367 68, 273.124 60, 134.059 60, 247.144 60++ F-426??,6???-對(duì)阿魏酰斯皮諾素26.28C48H48O21961.276 1961.277 2?0.001 1177.054 79, 327.086 52, 145.028 66, 393.097 11, 351.086 15959.261 5959.262 3?0.000 8160.015 41, 175.038 88, 134.035 81, 603.150 51, 235.060 68++ S-43酸棗仁皂苷A27.06C58H94O26????1 205.597 81 205.596 10.001 7107 3.554 44, 749.448 73, 101.022 76, 113.022 87, 911.501 16++ S-44酸棗仁皂苷C27.12C59H96O27????1 281.612 41 281.611 00.001 4123 5.606 81, 107 3.554 57, 749.449 16, 105 5.543 70, 108 9.544 31++ S-45酸棗仁皂苷A127.53C58H94O26????1 251.601 01 251.600 40.000 6120 5.595 95, 107 3.554 20, 749.449 28, 101.022 77, 125.022 93++ S-46酸棗仁皂苷B28.17C52H84O21????1 043.544 61 043.542 10.002 5911.502 44, 749.449 16, 101.022 82, 603.391 24, 893.491 76++ S-47酸棗仁皂苷I28.24C53H86O22????1 119.558 21 119.558 10.000 1107 3.554 44, 911.503 30, 749.448 85, 603.393 49, 101.022 79++ S-48乙酰酸棗仁皂苷B29.49C54H86O22????1 131.558 21 131.558 10.000 1749.449 46, 102 5.532 96, 911.500 49, 893.489 44, 104 3.547 73++ S-4924-羥基美洲茶酸31.25C30H46O6????501.322 4501.322 10.000 3501.323 03, 471.312 71, 427.323 97, 91.979 80, 472.315 37++ S-50表美洲茶酸33.11C30H46O5????485.327 2485.327 20.000 0485.327 36, 423.327 55, 486.330 93, 609.911 46, 265.754 12++ S-5127-羥基美洲茶酸33.25C30H46O6????501.322 4501.322 10.000 3501.322 72, 471.312 13, 427.321 93, 409.311 49, 60.991 46++ S-52美洲茶酸34.25C30H46O5????485.327 2485.327 20.000 0485.327 70, 423.327 88, 60.991 55, 486.331 15, 424.329 38++ S-53白樺脂酸35.26C30H48O3????455.353 1455.353 10.000 0455.353 42, 61.986 80, 456.356 96, 97.654 97, 115.919 27++ S-54樺木酮酸35.76C30H46O3????455.353 1455.353 10.000 0455.353 33, 116.927 06, 100.931 76, 180.889 25, 254.850 33+?

A-生物堿類成分，F(xiàn)-黃酮類成分，S-皂苷類成分；“+”表示檢測(cè)到，“?”表示未檢測(cè)到

A-alkaloids components, F-flavonoid components, S-saponin components; “+” detected, “?” undetected

圖1 生、炒酸棗仁正 (A)、負(fù)(B) 離子模式下基峰圖

A-PCA圖 B-模型驗(yàn)證 C-OPLS-DA圖 D-S-plot圖，圖3同

圖3 UHPLC-MS負(fù)離子多元統(tǒng)計(jì)分析 (n = 6)

PCA為無(wú)監(jiān)督的分析方法，在確定差異成分時(shí)不能忽略組內(nèi)誤差，也不能消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差[21]。因此，需要采用有監(jiān)督的OPLS-DA，以確定生、炒酸棗仁之間的化學(xué)差異成分。首先采用排列模型驗(yàn)證PLS-DA模型的擬合程度，正離子模式下200個(gè)排列模型（圖2-B）的參數(shù)為2＝0.998、2＝0.993；負(fù)離子模式下200個(gè)排列模型（圖3-B）的參數(shù)為2＝0.990、2＝0.946，且2回歸線與左邊縱軸均相交于零點(diǎn)以下，說(shuō)明模型有效，可以繼續(xù)鑒定差異性化學(xué)成分。進(jìn)一步采用OPLS-DA分析，尋找二者之間的差異成分，圖2-C和圖3-C中，在正、負(fù)離子模式下，生、炒酸棗仁之間均能明顯分開。

將VIP＞1和＜0.05作為篩選差異化合物的判定標(biāo)準(zhǔn)，尋找生、炒酸棗仁分別在正、負(fù)離子模式下的潛在差異化合物。由圖2-D和圖3-D可知，在正離子模式下共找出10個(gè)差異化合物，在負(fù)離子模式下共找出10個(gè)差異化合物，包括7個(gè)黃酮類、5個(gè)皂苷類和8個(gè)生物堿類成分。

對(duì)20個(gè)差異性化合物進(jìn)行相對(duì)含量分析，結(jié)果見圖4，其中烏藥堿（2）、木蘭花堿（9）、山礬堿（13）等9個(gè)生物堿類成分在炒制之后相對(duì)含量顯著上升（＜0.05）；斯皮諾素（14）、6′′′-阿魏酰斯皮諾素（28）、維采寧II（4）等6個(gè)黃酮類成分在炒酸棗仁中的相對(duì)含量顯著高于酸棗仁（＜0.05）；除酸棗仁皂苷B（46）和表美洲茶酸（50）在炒制之后含量下降外，其余酸棗仁皂苷A（43）、白樺脂酸（53）等3個(gè)皂苷類化合物在炒制之后相對(duì)含量顯著上升（＜0.05）。生物堿、黃酮和皂苷類成分相對(duì)含量升高可能是由于炒制后酸棗仁質(zhì)地酥脆，利于有效成分的溶出[8-9]，且高溫會(huì)造成黃酮類物質(zhì)的糖苷鍵斷裂而使結(jié)合態(tài)的黃酮游離出來(lái)[22]，從而導(dǎo)致黃酮類成分的含量增加。

與酸棗仁生品比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

2.3 潛在質(zhì)量標(biāo)志物的作用靶標(biāo)及網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（https:// tcmspw.com/tcmsp.php）和ETCM（http://www.tcmip. cn/ETCM/index.php/Home/）查詢差異化合物的作用靶點(diǎn)，將獲得的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入在線STRING 11.0（https://string-db.org/cgi/input.pl）獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。然后將Uniprot ID導(dǎo)入David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david. ncifcrf.gov/）對(duì)潛在的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。最后，通過Cytoscape 3.8.2軟件（美國(guó)Bethesda Softworks公司）分別建立化學(xué)成分及入血成分的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。

2.3.1 靶點(diǎn)蛋白與蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 通過檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）和（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/ Home/）查詢UHPLC-Q-Orbitrap-MS直觀分析和多元統(tǒng)計(jì)所得28個(gè)差異物的作用靶點(diǎn)，最終找到20個(gè)差異化合物的389個(gè)靶點(diǎn)蛋白（表3）。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名。將獲得的基因名導(dǎo)入STRING 11.0網(wǎng)站（https://string-db.org/cgi/ input.pl），物種選擇為人（homo sapiens），最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值＞0.90，其他參數(shù)設(shè)置不變，去掉網(wǎng)絡(luò)中的單一節(jié)點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2進(jìn)行作圖，見圖5。

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，選取在度中心性（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）3個(gè)參數(shù)均大于中位數(shù)且degree≥10的點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，經(jīng)篩選后共得到52個(gè)核心靶點(diǎn)，見表4，其主要與酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、美洲茶酸、白樺脂酸、木蘭花堿、烏藥堿、去甲荷葉堿、巴婆堿、斯皮諾素、當(dāng)藥黃素、維采寧II、6???-對(duì)香豆酰斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、芹菜素、樺木酮酸、牡荊素、異牡荊素17個(gè)成分相關(guān)。

表3 化合物與靶點(diǎn)數(shù)

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3.2 功能富集分析與通路分析 GO功能分析主要用于描述基因靶點(diǎn)的功能，包括細(xì)胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到潛在靶點(diǎn)所富集的信號(hào)通路。GO富集分析根據(jù)＜0.001、富集倍數(shù)值（FDR）＜0.001的條件篩選出63個(gè)GO條目，其中生物過程（biological process，BP）占39個(gè)，主要富集于對(duì)藥物的反應(yīng)（response to drug）、細(xì)胞增殖調(diào)控（regulation of cell proliferation）、凋亡過程調(diào)控（regulation of apoptotic process）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）等過程；分子功能（molecular function，MF）占18個(gè)，明顯富集于多巴胺、腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)受體（dopamine neurotransmitter receptor activity、alpha2-adrenergic receptor activity）和蛋白質(zhì)（protein binding）；細(xì)胞組成（cellular component，CC）占6個(gè)，可以看出主要富集在細(xì)胞質(zhì)膜（integral component of plasma membrane）、突觸（axon terminus）等區(qū)域。

表4 核心靶點(diǎn)

KEGG富集分析得到89條通路，以＜0.001、FDR＜0.001的條件篩選58條通路。選擇前20條，以通路為縱坐標(biāo)，F(xiàn)DR為橫坐標(biāo)構(gòu)建氣泡圖（圖6）。圓圈的大小代表核心靶點(diǎn)中參與此途徑的基因個(gè)數(shù)，圖中顯示癌癥途徑（pathways in cancer）中參與的基因最多，為22個(gè)。此外，還包括乙型肝炎（hepatitis B）等疾病通路和環(huán)磷酸腺苷（cyclic AMP，cAMP）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）等作用通路，表明炒酸棗仁可能通過調(diào)控這些通路達(dá)到干預(yù)疾病的作用。

圖6 KEGG富集分析

2.3.3 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將52個(gè)核心靶點(diǎn)相關(guān)的17個(gè)成分、58條通路運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖7。由圖可發(fā)現(xiàn)化合物、靶點(diǎn)、通路間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，符合中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)。利用Network Aalyzer插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯@得節(jié)點(diǎn)度（degree）值，根據(jù)度值判斷節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，推測(cè)炒酸棗仁干預(yù)疾病的機(jī)制可能是17個(gè)主要活性成分通過癌癥途徑（度值22）、PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑（PI3K-Akt signaling pathway）（度值21）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（度值15）、cAMP信號(hào)通路（度值13）、TNF信號(hào)通路（度值11）等多條途徑，作用在RELA、NFKB1（度值42）、AKT1（度值40）、TNF、TP53（度值28）、JUN（度值22）等關(guān)鍵靶標(biāo)。上述結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)篩選出的化學(xué)成分可作為炒酸棗仁的活性成分進(jìn)行深層次研究。

2.3.4 Q-Marker的確定 基于多元統(tǒng)計(jì)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，篩選出酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、美洲茶酸、白樺脂酸、木蘭花堿、烏藥堿、去甲荷葉堿、巴婆堿、斯皮諾素、當(dāng)藥黃素、維采寧II、6???-對(duì)香豆酰斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、芹菜素、樺木酮酸、牡荊素、異牡荊素等17個(gè)有效活性成分作為炒酸棗仁的潛在Q-Marker庫(kù)。

課題組前期利用血清化學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合發(fā)現(xiàn)烏藥堿、酸李堿、芹菜素、斯皮諾素和酸棗仁皂苷A可作為酸棗仁治療失眠的體內(nèi)潛在效應(yīng)物質(zhì)[16]；通過腸道菌群代謝研究發(fā)現(xiàn)烏藥堿、酸李堿、斯皮諾素、山柰酚-3--蕓香糖苷、維采寧II、酸棗仁皂苷A和B可作為酸棗仁Q-Marker[17]；且從生物合成途徑角度發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷A和B、白樺脂酸、斯皮諾素、6′′′-阿魏酰斯皮諾素、烏藥堿、木蘭花堿可考慮作為酸棗仁的Q-Marker[18]；并開展了口服酸棗仁后大鼠血漿內(nèi)的烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B等Q-Marker的藥代動(dòng)力學(xué)研究[23]。綜合前期研究基礎(chǔ)結(jié)合Q-Marker研究的“五原則”，初步認(rèn)為木蘭花堿、烏藥堿、斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B等6個(gè)成分可作為炒酸棗仁的潛在Q-Marker。

圖7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.4 Q-Marker可測(cè)性驗(yàn)證

為明確本研究確定的潛在Q-Marker科學(xué)性，以烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B為指標(biāo)，參考課題組前期研究，進(jìn)行含量測(cè)定。

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對(duì)照品適量，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為80、320、200、180、200、100 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 同“2.2.1”項(xiàng)。

2.4.3 液相色譜條件 色譜柱為Apollo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-和乙腈，梯度洗脫：0～26 min，10%～20%乙腈；26～30 min，20%～23%乙腈；30～43 min，23%～26%乙腈；43～45 min，26%～37%乙腈；45～47 min，37%乙腈；47～54 min，37%～39%乙腈；54～63 min，39%～100%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227、335 nm；ELSD參數(shù)：漂移管溫度105 ℃，空氣體積流量為2.5 L/min。采用227、335 nm和ELSD檢測(cè)器同時(shí)進(jìn)行測(cè)定[24]。

2.4.4 樣品測(cè)定 精密量取“2.4.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，稀釋成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（2）值均大于0.99。方法學(xué)考察見前期研究[24]，該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確，具備定性和定量雙重作用，可用于炒酸棗仁飲片Q-Marker的定量測(cè)定研究。將生、炒酸棗仁各10批樣品按“2.4.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，6個(gè)潛在Q-Marker含量測(cè)定結(jié)果見表5。結(jié)果顯示生、炒酸棗仁中6種化合物含量從高到低依次為木蘭花堿＞斯皮諾素＞酸棗仁皂苷A＞6???-阿魏酰斯皮諾素＞酸棗仁皂苷B＞烏藥堿，除酸棗仁皂苷A外，其余5種化合物的含量在生、炒酸棗仁中均無(wú)顯著差異。結(jié)果表明6種化學(xué)成分含量在生、炒酸棗仁中均較高，可將烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B作為炒酸棗仁飲片的Q-Marker。

3 討論

據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)記載酸棗仁的化學(xué)成分主要含皂苷類、黃酮類、生物堿類等化學(xué)成分[18]，其中酸棗仁中黃酮類成分種類豐富且含量較高，具有改善睡眠[25]、抗抑郁[26]、抗焦慮[27]和改善記憶功能[28]等 重要功能；皂苷類成分與黃酮類成分發(fā)揮同樣的作用[13]，并對(duì)阿爾茨海默癥有一定療效[29]；生物堿類成分也具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁等藥理作用[30]。故本實(shí)驗(yàn)利用UHPLC-MS技術(shù)對(duì)生、炒酸棗仁的化學(xué)成分進(jìn)行全面表征，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析篩選生、炒酸棗仁中20個(gè)潛在的化學(xué)標(biāo)記物，19個(gè)化合物的相對(duì)含量在炒制之后上升。之后進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)建模分析，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，進(jìn)一步結(jié)合課題組前期研究初步選擇6種成分為酸棗仁的主要藥效基礎(chǔ)物質(zhì)。并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，明確其可測(cè)性，最終確定木蘭花堿、烏藥堿、斯皮諾素、6???-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B等6種成分可作為炒酸棗仁的Q-Marker。

表5 生、炒酸棗仁樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n = 4)

與ZSS均值比較：*＜0.05

*< 0.05ZSS mean value

本研究中市售樣品測(cè)定結(jié)果表明生、炒酸棗仁中5種化合物含量無(wú)顯著差異，首先可能由于生、炒酸棗仁收集于不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)時(shí)間，導(dǎo)致樣本本身不均一；也可能由于目前酸棗仁炒制標(biāo)準(zhǔn)沒有統(tǒng)一而明確的參數(shù)，導(dǎo)致不同飲片公司炒制酸棗仁所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。后期可將本研究確定的6種Q-Marker作為指標(biāo)，結(jié)合藥效評(píng)價(jià)研究，對(duì)酸棗仁的炒制方法進(jìn)行優(yōu)化，明確炒制過程中鍋溫、時(shí)間、投料量等具體參數(shù)，進(jìn)一步規(guī)范酸棗仁的炮制標(biāo)準(zhǔn)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)生、炒酸棗仁化學(xué)成分的差異主要為化學(xué)成分含量的差異，未發(fā)現(xiàn)顯著的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)變化。為了更加準(zhǔn)確地將6種Q-Marker應(yīng)用于酸棗仁飲片質(zhì)量控制與指導(dǎo)臨床，應(yīng)通過大樣本、多批次比較研究，明確6種Q-Marker分別在生、炒酸棗仁中的含量限度范圍，為酸棗仁飲片的質(zhì)量控制研究提供科學(xué)參考。綜上，本實(shí)驗(yàn)為生、炒酸棗仁質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及全程質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)也為含有生、炒酸棗仁的復(fù)方Q-Marker的篩選提供參考，但還需對(duì)Q-Marker的藥效活性及作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證和闡釋，從而為炒酸棗仁飲片的質(zhì)量追溯和評(píng)價(jià)體系提供更為全面的科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Prediction and analysis of Q-Markers of friedpieces based on multivariate statistical analysis and network pharmacology

LI Ze1, DU He1, XIE Yu-jun1, HENG Yi-ran1, DUAN Hui-zhu1, PEI Xiang-ping1, YAN Yan2, DU Chen-hui1

1. College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Taiyuan 030619, China 2. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

To explore the potential Q-Markers of fried Suanzaoren (, ZSS) (FZSS) based on multivariate statistical analysis and network pharmacology.Ultra performance liquid chromatography-quadrupole- electrostatic field orbital trap mass spectrometry (UHPLC-Q-Orbitrap-MS) was used to analyze the main components in ZSS and FZSS, and the potential differential components between ZSS and FZSS were screened out by using multivariate statistical analysis combined with VIP > 1 and< 0.05. Further, the main action targets were analyzed to construct the “component-target-pathway” network relationship through network pharmacology, and predict the potential Q-Markers of FZSS. The scientificity of potential Q-Markers was verified by the content determination of the potential Q-Markers in commercial samples.A total of 54 chemical components, including flavonoid (such as spinosin and swertisin),saponin(jujuboside A and jujuboside B, etc.) and alkaloidcomponents (magnoflorine, coclaurine, etc.), were identified from ZSS and FZSS, and 28 differential components, such as magnoflorine, 6???-feruloylspinosin, jujuboside A, and betulinic acid, were found through multivariate statistical analysis. A potential Q-Marker component library contained 17 potential bioactive components (including jujuboside A, jujuboside B, ceanothic acid, betulinic acid, magnoflorine, coclaurine, nornuciferine, asimilobine, spinosin, swertisin, vicenin II, 6???--coumaroylspinosin, 6???-feruloylspinosin, apigenin, betulonic acid, vitexin, isovitexin) was screened by network pharmacology. Magnoflorine, coclaurine, spinosin, 6???-feruloylspinosin, jujuboside A, and jujuboside B were finally identified as the Q-Markers of FZSS combined with the preliminary research of our research group and the results of the commercial samples.The Q-Marker predicted in this study can provide a reference for the whole quality control and clinical application of FZSS. Meanwhile, it can also provide the basis for the further research on the efficacy-substance relation and mechanism of FZSS.

multivariate statistical analysis; network pharmacology;; fried; Q-Markers; UHPLC-Q-Orbitrap-MS; component-target-pathway; magnoflorine; coclaurine; spinosin; 6???-feruloylspinosin; jujuboside; whole quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2021)16 - 4811 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.006

2021-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81603251）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81603289）；山西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201803D31087）；山西省教育廳高等學(xué)校青年科研人員培育計(jì)劃（20）；山西省教育廳高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2020L0422）；2019年山西省教育廳優(yōu)秀研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2019SY515）；山西中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2018-TD-009）；山西中醫(yī)藥大學(xué)2021年科技創(chuàng)新能力培育計(jì)劃（2021PY-QN-07）

李 澤（1996—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與開發(fā)。Tel: 18434376763 E-mail: leze163@163.com

閆 艷，女，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制及中藥體內(nèi)過程研究。Tel: (0351)7018379 E-mail: yanyan520@sxu.edu.cn

杜晨暉，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (0351)3179982 E-mail: dch@sxtcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]