慢性乙型肝炎中醫(yī)證型與HLA-A24、CW1基因及ALT、AST相關(guān)性研究

楊小蓉，蔡祥勝，盧漢威，黃演婷，陳小明

1 廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣東廣州 510080

2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 廣東深圳 518000

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種含有部分DNA雙鏈的嗜肝包膜病毒，其大包膜蛋白的N-末端與肝細(xì)胞基地外側(cè)區(qū)的受體-牛黃膽酸鈉多肽（NTCP）相互作用實(shí)行細(xì)胞粘附和病毒進(jìn)入[1]，宿主被感染后其免疫系統(tǒng)與HBV經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)過(guò)程后，一般會(huì)出現(xiàn)三種情況：①HBV病毒DNA整合到宿主細(xì)胞中，引發(fā)長(zhǎng)期慢性持續(xù)性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可發(fā)展為慢性乙型肝炎、肝硬化，甚至肝癌；②宿主直接清除病毒；③宿主與病毒長(zhǎng)期平衡狀態(tài)，即攜帶者。亦即中醫(yī)診療中的“邪正相爭(zhēng)”。宿主基因HLA-A24及CW1與慢性乙型肝炎不同中醫(yī)證型的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，本研究擬通過(guò)檢測(cè)宿主基因HLA-A24，CW1、乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）及生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的變化，并分析各因素與慢性乙型肝炎中醫(yī)證型的相關(guān)性，為臨床診療提供一個(gè)方向。

資料與方法

1 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2005年第6次全國(guó)傳染病與寄生蟲病會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.1.2 中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1991年中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì)制定的辨證標(biāo)準(zhǔn)（試行）中慢性乙型肝炎的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)[3]，分為肝膽濕熱證，肝郁脾虛證，肝腎陰虛證，瘀血阻絡(luò)證及脾腎陽(yáng)虛證5個(gè)證型。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①HBsAg陽(yáng)性時(shí)間持續(xù)超過(guò)6個(gè)月，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平升高達(dá)正常值2倍以上；②年齡19～77歲，性別不限；③簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①甲、丙、丁、戊型肝炎的重疊感染；②EB（EPstein-Barr）病毒、巨細(xì)胞病毒（CMV）感染；③藥物性肝損傷、中毒性肝損傷、自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝，無(wú)干擾素治療史；④有心腦血管、肺、腎、內(nèi)分泌及造血系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾病；⑤相關(guān)指標(biāo)不完整者。

2 一般資料

該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，98例病例為2011年4月-2012年4月在廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科就診的慢性乙型肝炎患者，其中男88例，女10例，年齡27～78歲，平均年齡（50.06±11.0）歲；肝膽濕熱證型24例（24%），肝郁脾虛證型15例（15%），肝腎陰虛證型18例（18%），瘀血阻絡(luò)證型31例（31%），脾腎陽(yáng)虛證型10例（10%）。40例健康對(duì)照來(lái)自于接種過(guò)乙肝疫苗并產(chǎn)生表面抗體的健康人群，男16例，女24例，年齡19～81歲，平均（44.3±21.2）歲，各組在性別及年齡上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

3.1 標(biāo)本收集 抽取患者靜脈血4ml，用于檢測(cè)HBV DNA及ALT及AST，再抽取EDTA-Na抗凝全血2ml，采用酚-氯仿-異戊醇方法提取白細(xì)胞中DNA，為后續(xù)檢測(cè)基因HLA-A24，CW1備用。

3.2 HBV DNA定量檢測(cè) 分離血清后按照使用說(shuō)明書，實(shí)時(shí)熒光定量-PCR法檢測(cè)血清中HBV DNA的含量，儀器為DA-7600，試劑購(gòu)買于中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司，檢測(cè)下限為500U/ml。

3.3 肝功能指標(biāo)ALT及門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測(cè) 標(biāo)本按照標(biāo)準(zhǔn)操作采集空腹血清或肝素鈉抗凝血漿，運(yùn)用底物法檢測(cè)各證型病例及對(duì)照組血清中的ALT及AST，儀器為全自動(dòng)生化分析儀日歷-7180，試劑購(gòu)買于四川邁克生物股份有限公司。

3.4 HLA-A24，HLA-CW1基因定量檢測(cè) 引物合成及測(cè)序均在上海生物工程公司完成，電泳儀為北京六一儀器廠，熒光定量PCR儀應(yīng)用美國(guó)ABI公司的ABI-7500，pMD載體為日本TAKARA公司產(chǎn)品，在HLA-A24第一外顯子序列（Genbank登錄號(hào)：AH004915.2）CDS區(qū)域設(shè)計(jì)上下游兩個(gè)引物及Taqman 探 針：5’-TTCTCA CACCGTCCAGAGGAT-3’，5’-GAGCGCAGGTCCTCTTTCAG-3’，F(xiàn)AM-5’-TCGGACTGGCGCTTCCTCCG-3’-TAMRA；HLA-CW1基因（GenBank登錄號(hào)：AH0117 49.2）CDS區(qū)設(shè)計(jì)上下游兩個(gè)引物及Taqman探針：5’-GCTCCCACTCCATGAAGTATTTCT-3’，5’-CTGTCGAACCGCACGAACT-3’；通過(guò)普通PCR擴(kuò)增出184bp和171bp的片段后，連接，轉(zhuǎn)化，測(cè)序，酶切鑒定后，運(yùn)用載體pMD20/HLA-A24/CW1，按 照 104～ 107copies/ml稀釋倍數(shù)稀釋，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各稀釋倍數(shù)質(zhì)粒（反應(yīng)條件：95℃變性 30s，95℃ 5sec，60℃退火 30sec，30個(gè)循環(huán)）。最后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)各證型HLAA24、CW1基因含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD進(jìn)行各組均數(shù)多重比較，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢性乙型肝炎中醫(yī)證型分布情況

慢性乙型肝炎患者的常見證型為瘀血阻絡(luò)型和肝膽濕熱型，分別各占32%和25%，性別比例中以男性占比較多，為90%，女性占比為10%，中醫(yī)證型分布于性別的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 98例慢性乙型肝炎患者不同性別中醫(yī)證型 分布情況

2 各證型HBV-DNA、ALT及AST定量結(jié)果比較

HBV-DNA定量結(jié)果以肝膽濕熱及肝郁脾虛證型較高，肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)及脾腎陽(yáng)虛證型較低，各組相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.918）；ALT結(jié)果各組間比較，脾腎陽(yáng)虛證型高于與其他各證型（P<0.05），即脾腎陽(yáng)虛證>肝膽濕熱證> 肝郁脾虛證>瘀血阻絡(luò)證>肝腎陰虛型；AST結(jié)果各組間相比較，尤以脾腎陽(yáng)虛為最高，且高于其它證型（P<0.05），其次為肝郁脾虛、瘀血阻絡(luò)、肝膽濕熱及肝腎陰虛證，見表2。

表2 各證型HBV-DNA、ALT及AST值比較 （±s）

表2 各證型HBV-DNA、ALT及AST值比較 （±s）

注： 與其它組比較，* P<0.05

證型分類 例數(shù) HBV-DNA/U·ml-1 ALT/U·L-1 AST/U·L-1肝膽濕熱型 24 2.13±0.70 44±16.92 42±10.62肝郁脾虛型 15 2.03±0.66 41±10.56 63±16.99*肝腎陰虛型 18 1.64±0.68 34±9.85 31±8.04瘀血阻絡(luò)型 31 1.72±0.46 35±8.46 44±10.09脾腎陽(yáng)虛型 10 1.70±0.95 62±11.25* 115±40.24*

3 各證型HLA-A24，HLA-CW1基因檢測(cè)結(jié)果比較

各證型HLA-A24基因表達(dá)以正常對(duì)照組表達(dá)最高，脾腎陽(yáng)虛證型表達(dá)最低，肝膽濕熱證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡(luò)證及脾腎陽(yáng)虛證型與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肝郁脾虛證與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HLA-CW1基因表達(dá)以對(duì)照組表達(dá)結(jié)果最高，肝膽濕熱證型表達(dá)最低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而其它各組結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 各證型HLA-A24及CW1結(jié)果 （±s）

表3 各證型HLA-A24及CW1結(jié)果 （±s）

注：與正常對(duì)照比較，*P<0.05

證型分類 例數(shù) HLA-A24 HLA-CW1肝膽濕熱型 15 2.32±1.62* 1.81±1.21*肝郁脾虛型 18 3.23±1.95 2.71±1.86肝腎陰虛型 31 2.46±1.63** 2.28±1.20瘀血阻絡(luò)型 10 2.48±1.73* 2.05±1.55脾腎陽(yáng)虛型 24 1.19±0.91* 2.66±1.75對(duì)照組 40 4.10±1.69* 2.89±1.68*

4 各客觀指標(biāo)相關(guān)性分析

應(yīng)用SPSS17.0將各相關(guān)因素進(jìn)行分析，ALT和AST與HBV-DNA呈顯著正相關(guān)（P<0.05），HLA-CW1與HLA-A24基因成顯著正相關(guān)（P<0.05），見表4。

表4 各組HBV-DNA、ALT、AST、HLA-A24及CW1相關(guān)性分析

討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為乙型病毒性肝炎屬于“黃疸”“脅痛”“積聚”“鼓脹”“郁證”等疾病范疇，歸因于疫毒浸淫肝膽，而肝疏泄失常，無(wú)法鼓邪外出，導(dǎo)致濕熱疫毒留滯體內(nèi)而發(fā)病[4]。ALT和ASTS是反映肝功能最常見的兩個(gè)指標(biāo)，ALT主要存在于肝細(xì)胞漿中，當(dāng)宿主被感染乙肝病毒后，肝細(xì)胞在病毒的侵蝕下表現(xiàn)為通透性增加，ALT從肝細(xì)胞逸出，從而引起肝細(xì)胞變性損傷，引起一系列臨床癥狀；AST主要分布于肝細(xì)胞線粒體中，少數(shù)分布于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)肝細(xì)胞病變嚴(yán)重甚至壞死時(shí)，AST即會(huì)從肝細(xì)胞線粒體中釋放出來(lái)到血液中被檢測(cè)出來(lái)；在臨床上，HBV-DNA是檢測(cè)HBV感染最直接而特異性又很高的指標(biāo)，通常載量越高，表示病毒復(fù)制越厲害，傳染性越強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎中醫(yī)證型主要以肝膽濕熱和淤血阻絡(luò)證型較為多見，分別為24%和32%，這與陳瑞年的研究[5]中以濕熱內(nèi)結(jié)和肝郁脾虛證型占比最多的結(jié)果有差異，可能與本研究收集的樣本數(shù)過(guò)少有關(guān)；ALT在脾腎陽(yáng)虛及肝膽濕熱證型中值大于正常參考范圍，與其它證型之間相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），AST則是在脾腎陽(yáng)虛及肝郁脾虛證型中表現(xiàn)為大于正常參考范圍，與另外三種證型相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明脾腎陽(yáng)虛證型肝細(xì)胞損傷比較嚴(yán)重，其次為肝郁脾虛，肝膽濕熱，肝腎陰虛和淤血阻絡(luò)證型，這與劉二麗的研究[6]ALT和AST在濕熱內(nèi)結(jié)和脾腎陽(yáng)虛證型明顯升高的結(jié)果一致，與吳禮鋒的研究[7]有一些差異；本研究中各證型HBV-DNA的結(jié)果以肝膽濕熱和肝郁脾虛證型較高，各證型之間相比較結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果與黃繼琴[8]、姜楠[9]的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ALT和AST與HBV-DNA呈顯著正相關(guān)（P<0.05），表明肝膽濕熱證型在早期會(huì)出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷，隨著病情進(jìn)展，到了肝郁脾虛、肝腎陰虛、淤血阻絡(luò)和脾腎陽(yáng)性證型后，宿主驅(qū)邪無(wú)力，邪毒聚增，造成肝細(xì)胞損傷從細(xì)胞漿到線粒體，進(jìn)而大量病毒釋放到血漿中，出現(xiàn)了HBV-DNA拷貝數(shù)增加的病況，而HBV-DNA拷貝數(shù)的增減則慢性乙型肝炎治療的一個(gè)指標(biāo)。

人 類 白 細(xì) 胞 抗 原（Human Leukocyte Antigen，HLA）是一組由具有高度多態(tài)性和連鎖不均衡的基因群體而構(gòu)成的人類主要組織相容性復(fù)合體，也是調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答和決定疾病易感性個(gè)體差異的主要基因系統(tǒng)。Ayse Albayrak等將257例土耳其人分為對(duì)HBV疫苗有應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答組的HLA-A24基因頻率顯著高于無(wú)應(yīng)答組[10]，即HLA-A24基因與宿主對(duì)乙肝疫苗的反應(yīng)性有關(guān)。亦有研究表明，HLA-A24與CW1與臨床應(yīng)用利巴韋林治療的轉(zhuǎn)歸息息相關(guān)[11]，宿主自身的HLA-A24與HBV相關(guān)性慢性肝炎呈低風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系[12]。本研究中各證型與自動(dòng)產(chǎn)生乙肝保護(hù)性抗體的對(duì)照組相比較，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），脾腎陽(yáng)虛證型結(jié)果最低，而肝膽濕熱、肝郁脾虛、肝腎陰虛及瘀血阻絡(luò)證型結(jié)果相對(duì)較高，也證實(shí)了HLA-A24基因與疫苗的反應(yīng)性及病程的轉(zhuǎn)歸均有關(guān)聯(lián)性。本研究中的HLA-CW1結(jié)果以肝膽濕熱證型最低，與其它證型相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明慢性乙型病毒性肝炎的病程發(fā)展是肝膽濕熱-肝郁脾虛-肝腎陰虛-瘀血阻絡(luò)-脾腎陽(yáng)虛這樣一個(gè)路徑。

宿主感染HBV后，即濕熱疫毒侵入機(jī)體，是乙型肝炎慢性化的外因與宿主自身的免疫因素相互作用，即邪正交爭(zhēng)，根據(jù)其各自的力量交鋒后，出現(xiàn)彼此消長(zhǎng)盛衰的變化，導(dǎo)致了病毒感染宿主后不同的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。起始階段肝郁脾虛、肝膽濕熱階段為自身免疫

功能與病毒處于正邪相交的階段，可能此時(shí)及時(shí)治療應(yīng)該是比較合適的時(shí)機(jī)，通過(guò)檢測(cè)宿主自身HLA基因亦可為臨床注射HBV疫苗是否出現(xiàn)應(yīng)答，甚至判斷藥物的療效提供一個(gè)方向性指導(dǎo)。