磁固相萃取聯(lián)合熒光法測(cè)定生物樣品中的卡維地洛

秦艷芳，趙冰欣，李曉姣，徐風(fēng)云，吳 昊*

（1.長(zhǎng)治幼兒師范高等專科學(xué)校，山西 長(zhǎng)治046000；2.山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾041004）

卡維地洛（Carvedilol，CAR，圖1）屬于α和β受體阻斷劑，可擴(kuò)張血管，保護(hù)心肌和神經(jīng)元，在臨床上廣泛用于高血壓、心絞痛和心力衰竭等疾病的治療，能顯著降低心血管患者的發(fā)病率和死亡率［1－2］。

圖1 卡維地洛的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of carvedilol

磁固相萃?。∕SPE）是21世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型固相萃取技術(shù)，與傳統(tǒng)的固相萃取相比，具有操作簡(jiǎn)便快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)［3－4］。共價(jià)有機(jī)骨架材料（COFs）是一類由輕質(zhì)元素通過(guò)共價(jià)鍵連接的新型多孔有機(jī)材料，具有化學(xué)和熱穩(wěn)定性良好、比表面積大和孔徑可控等優(yōu)點(diǎn)［5］，在樣品預(yù)處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［6］。

本研究采用Fe3O4納米材料、1，3，5-三甲基間苯三酚（Tp）和聯(lián)苯胺（BD），通過(guò)溶劑熱法合成了Fe3O4＠COF（TpBD）復(fù)合材料。相比已有文獻(xiàn)［7］，其合成方法所用試劑少，過(guò)程簡(jiǎn)單易操作，實(shí)驗(yàn)成本低。以Fe3O4＠COF（TpBD）為MSPE吸附劑聯(lián)合熒光分光光度法建立了一種檢測(cè)血漿和尿液中的CAR含量的新方法，通過(guò)優(yōu)化相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)該分析方法進(jìn)行了評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

FeCl3·6H2O、乙二醇、無(wú)水乙酸鈉、1，2-乙二胺、1，3，5-三甲基間苯三酚（Tp）、聯(lián)苯胺（BD）（上海阿拉丁生化科技有限公司）；無(wú)水乙醇、冰醋酸、高效液相色譜級(jí)甲醇、乙醇、乙腈（北京百靈威科技有限公司）；CAR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；尿液及血漿取自長(zhǎng)治幼兒師范高等?？茖W(xué)校校醫(yī)院。

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（Agilent Technologies，美國(guó)）；pHS－3C pH計(jì)（上海強(qiáng)生科技有限公司）；KQ－500DV超聲波洗滌器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；JEM－2100透射電子顯微鏡（TEM）（JEOL，日本）；D8 Advance X射線衍射儀（XRD）（Bruker，德國(guó)）；7407振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（Lake Shore，美國(guó)）；FT－IR360傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）（Nicolet，美國(guó)）；ASAP 2020比表面和孔隙度分析儀（Micromeritics，美國(guó)）。

熒光測(cè)量條件：（25±0.5）℃；λex=240 nm，λem=356 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm；掃描速度為1 000 nm·min-1。

1.2 磁性材料Fe3O4＠COF（TpBD）的制備

Fe3O4納米材料參照文獻(xiàn)［4］制備：將1.0 g FeCl3·6H2O分散于20 mL乙二醇中超聲處理，隨后緩慢加入3.0 g無(wú)水乙酸鈉，磁力攪拌30 min；加入10 mL 1，2-乙二胺攪拌30 min后，將混合溶液移至高壓反應(yīng)釜中加熱至200℃并保持8 h，自然冷卻至室溫。最后將黑色產(chǎn)物用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次，并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

Fe3O4＠COF（TpBD）復(fù)合材料通過(guò)溶劑熱法制備：取60 mg Fe3O4加至30 mL無(wú)水乙醇中超聲分散，然后依次加入63 mg（0.3 mmol）Tp和55.2 mg（0.3 mmol）BD，混合物超聲35 min后，移至高壓反應(yīng)釜中加熱至180℃，保持48 h。最后將產(chǎn)物用去離子水和乙醇洗滌數(shù)次，并在真空烘箱中60℃干燥24 h。

1.3 樣品處理

CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）：精確稱取10 mg CAR，加1 mL的冰醋酸溶解，再加適量超純水定容至100 mL。

血樣處理：在具塞離心管中依次加入10 μL不同質(zhì)量濃度的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液、2.0 mL血漿和8 mL乙腈脫蛋白，以4 000×g離心15 min。收集透明的上清液，待測(cè)。

尿樣處理：在具塞離心管中依次加入10 μL不同質(zhì)量濃度的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 mL新鮮人尿，4 000×g離心10 min。收集透明的上清液，待測(cè)。

1.4 磁固相萃取過(guò)程

準(zhǔn)確稱取5 mg吸附劑Fe3O4＠COF（TpBD）置于50 mL含CAR樣品溶液的比色管中，超聲4 min，將釹鐵硼磁鐵置于比色管底部對(duì)吸附劑進(jìn)行分離，棄去上清液后，將吸附劑在40℃氮?dú)庵写蹈伞Ｈ缓鬁?zhǔn)確量取0.5 mL乙醇置于比色管底部進(jìn)行解吸，超聲5 min后使用釹鐵硼磁鐵分離解吸劑和吸附劑，重復(fù)解吸步驟2次，合并兩次解吸劑。最后將解吸劑用0.22 μm的針式過(guò)濾器過(guò)濾，濾液用于熒光分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4＠COF（TpBD）表征

利用TEM分別對(duì)Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的形貌進(jìn)行了表征。如圖2A與圖2B所示，F(xiàn)e3O4呈球形，且大小均勻，表面被COF（TpBD）均勻包裹。元素分布圖像（圖2C）也表明Fe3O4＠COF（TpBD）中Fe3O4（元素Fe、O）和COF（TpBD）（元素C、N、O）均勻緊密地結(jié)合。

由Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的N2吸附－解吸等溫線（圖2D）可知，F(xiàn)e3O4的BET比表面積和孔體積分別為11.00 cm2/g和0.14 cm2/g，F(xiàn)e3O4＠COF（TpBD）的分別為32.26 cm2/g和0.18 cm3/g，相比Fe3O4均明顯增加。

Fe3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的磁化曲線（圖2E）表明，兩者均具有良好的磁性能，F(xiàn)e3O4＠COF（TpBD）的飽和磁化強(qiáng)度為27.7 emu/g，在外磁場(chǎng)作用下容易分離。

從Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的XRD譜圖（圖2F）可以看到，F(xiàn)e3O4有6個(gè)特征峰（2θ＝30.1、35.3、43.1、53.2、57.0、62.4）分別對(duì)應(yīng)于（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面，COF（TpBD）在2θ＝25.5處的特征峰對(duì)應(yīng)其（001）晶面。Fe3O4＠COF（TpBD）圖譜中這兩種材料的峰都有體現(xiàn)，說(shuō)明二者形成了復(fù)合材料，同時(shí)結(jié)晶度未發(fā)生變化。

如Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的FT－IR譜圖（圖2G）所示，F(xiàn)e3O4＠COF（TpBD）在584 cm-1處的吸收帶為Fe—O振動(dòng)，3 432 cm-1和1 442 cm-1處的吸收帶分別是O—H基團(tuán)和芳香C====C單元的特征拉伸帶，1 292 cm-1和1 605 cm-1處吸收帶分別與C—N拉伸和C====N鍵有關(guān)。表明Fe3O4已成功被COF（TpBD）包裹。

圖2 Fe3O4（A）和Fe3O4＠COF（TpBD）（B）的TEM圖，F(xiàn)e3O4＠COF（TpBD）的元素分布圖（C），F(xiàn)e3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的N2吸附－解吸等溫線（D），F(xiàn)e3O4和Fe3O4＠COF（TpBD）的磁化曲線（E），F(xiàn)e3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的XRD圖譜（F）以及Fe3O4、COF（TpBD）和Fe3O4＠COF（TpBD）的FT－IR圖譜（G）Fig.2 TEM images of Fe3O4 nanocrystal clusters（A）and Fe3O4＠COF（TpBD）（B），element mapping images of Fe3O4＠COF（TpBD）（C），N2 adsorption－desorption isotherms of Fe3O4 and Fe3O4＠COF（TpBD）（D），magnetic curves of Fe3O4 and Fe3O4＠COF（TpBD）（E），XRD spectra of Fe3O4，COF（TpBD）and Fe3O4＠COF（TpBD）（F），and FT－IR spectra of Fe3O4，COF（TpBD）and Fe3O4＠COF（TpBD）（G）

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 pH值溶液的pH值會(huì)對(duì)藥物與吸附劑間的吸附平衡產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)中溶液的pH值用B-R緩沖溶液調(diào)節(jié)。在溶液pH 2.0～12.0范圍內(nèi)進(jìn)行MSPE和熒光檢測(cè)。結(jié)果如圖3A所示，隨pH值的升高，CAR的熒光強(qiáng)度變化不大。為了方便操作，實(shí)驗(yàn)選擇萃取溶液的pH值為6.0。

2.2.2 吸附劑用量考察了吸附劑用量在1～8 mg范圍內(nèi)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響（圖3B）。結(jié)果表明，當(dāng)吸附劑用量為5 mg時(shí)，CAR的熒光強(qiáng)度最大。因此，實(shí)驗(yàn)選用5 mg吸附劑。

2.2.3 萃取時(shí)間考察了萃取時(shí)間為1～10 min時(shí)對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響（圖3C）。結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，當(dāng)萃取時(shí)間為4 min時(shí)，CAR的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，吸附過(guò)程達(dá)到平衡。因此，萃取時(shí)間確定為4 min。

2.2.4 解吸條件分別考察了乙酸、甲醇、乙醇和乙腈4種有機(jī)溶劑對(duì)CAR的解吸效果（圖3D）。當(dāng)選用乙醇為解吸劑時(shí)CAR的熒光強(qiáng)度最大。并考察了乙醇用量（0.2～0.8 mL）對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響（圖3E）。結(jié)果表明，改變乙醇用量，CAR的熒光強(qiáng)度變化不明顯，為了方便操作，選用乙醇的體積為0.5 mL。另外，采用0.5 mL乙醇為解吸劑，考察了解吸時(shí)間在1～10 min范圍內(nèi)時(shí)對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響（圖3F）。結(jié)果表明，解吸時(shí)間為5 min時(shí)，CAR熒光強(qiáng)度最大。故選擇最佳解吸時(shí)間為5 min。

圖3 溶液pH值（A）、吸附劑的用量（B）、萃取時(shí)間（C）、解吸劑（D）、解吸劑的體積（E）和解吸時(shí)間（F）對(duì)CAR熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of sample solution pH value（A），adsorbent amoun（tB），adsorption time（C），desorption solvent types（D），desorption solution volume（E）and desorption time（F）

2.3 方法選擇性

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了某些共存物質(zhì)以及常見離子對(duì)CAR（10 ng/mL）測(cè)定的影響?？刂茰y(cè)量誤差在±5%以內(nèi)，1 000倍的尿素，800倍的Mg2+，700倍的K+、HPO42-，600倍的Na+、SO42-，400倍的Cl-，160倍的Ac-，120倍的Ca2+，56倍的Al3+，8倍的Cu2+等不會(huì)對(duì)測(cè)定造成干擾?？梢娫摲椒ň哂泻芎玫倪x擇性。

2.4 方法分析

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，制備了一系列CAR溶液，以熒光強(qiáng)度（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為y＝8.138x+4.555，R＝0.999 2。結(jié)果表明方法在1～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性。CAR的檢出限（S/N＝3）為0.19 ng/mL，定量下限（S/N＝10）為0.63 ng/mL，對(duì)溶液中CAR的富集倍數(shù)為113倍。可見該方法的靈敏度高，線性范圍寬。

為考察方法的重現(xiàn)性，按照磁固相萃取步驟對(duì)1 ng/mL CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液于日內(nèi)和日間進(jìn)行6次平行測(cè)定。計(jì)算結(jié)果表明，其日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.4%，日間RSD為3.6%。

2.5 樣品分析

為了驗(yàn)證本方法的可行性及有效性，在尿樣和血樣中分別加入高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的CAR標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)“1.3”方法處理后，按照磁固相萃取過(guò)程進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果如表1 所示，其范圍為95.9%～98.7%。說(shuō)明方法的準(zhǔn)確性較好，可有效測(cè)定尿樣和血樣中CAR的含量。

表1 加標(biāo)尿樣和加標(biāo)血樣中CAR的熒光測(cè)定（n＝3）Table 1 Fluorimetric determination of CAR in spiked urine and spiked plasma（n＝3）

2.6 方法比較

相比其他文獻(xiàn)方法（表2），本文所建立的方法線性范圍寬，在加標(biāo)樣品中回收率高。

表2 生物樣品中CAR檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison of determination for CAR in biological samples

3 結(jié)論

本研究合成了Fe3O4＠COF（TpBD）復(fù)合材料，并以Fe3O4＠COF（TpBD）作為MSPE吸附劑，聯(lián)合熒光分光光度法建立了一種檢測(cè)CAR含量的新方法。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)范圍寬、靈敏度高且回收率好，適用于尿樣和血樣中CAR含量的測(cè)定。