蒲公英花提取物對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的抑制作用

李 波，信 瑞，柳承鑫，曲丹華

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 放射線科,吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春130041)

細(xì)胞通過(guò)有氧代謝使生命活動(dòng)得以進(jìn)行和維持,有氧代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)等多種自由基[1]。自由基對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一把雙刃劍，一方面,自由基是有氧代謝所必備的；另一方面,對(duì)機(jī)體存在毒性。許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明,自由基反應(yīng)能導(dǎo)致細(xì)胞退化、老化、裂解[2]。H2O2是一種 ROS，在誘導(dǎo)細(xì)胞的損傷、死亡中起關(guān)鍵作用。它能損傷DNA、使酶失活、氧化激素、破壞細(xì)胞膜的完整性,甚至殺死細(xì)胞等，是多種疾病的起點(diǎn)[3]。紅細(xì)胞富含脂類及鐵,其中Fe2+是自由基反應(yīng)的催化劑，循環(huán)中的紅細(xì)胞經(jīng)常接觸高分壓的氧,因此,紅細(xì)胞易受到自由基的損傷[4]。正常情況下，紅細(xì)胞能維持氧化與抗氧化狀態(tài)的平衡。如果紅細(xì)胞過(guò)氧化時(shí)，就會(huì)受到損傷,使正常紅細(xì)胞的衰老，破壞[5]。

經(jīng)科學(xué)證實(shí)，蒲公英具有抗氧化活性、延緩衰老、消炎止痛等作用，其消炎機(jī)理之一是具有抗氧化活性，蒲公英中含有很多抗氧化成分，蒲公英和玉米須、茵陳蒿水煎液都有抗自由基的作用。此外，其所含的綠原酸也有抗氧化作用。許多資料顯示，蒲公英總黃酮提取液也可以增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗衰老物質(zhì)活性，對(duì)于延緩機(jī)體衰老具有重要意義。

蒲公英始載于《唐本草》，《圖經(jīng)本草》作仆公罌，《本草綱目》作地丁。為菊科植物蒲公英，或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味苦、甘，性寒[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英花主要化學(xué)成分有黃酮、酚酸、多糖、萜類、半倍萜內(nèi)酯、香豆素等多種功能成分。具清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋之功效。用于疔瘡腫毒、乳癰、瘰疬、目赤、咽痛、肺癰、腸癰、濕熱黃疸、熱淋澀痛[7]。因此，本課題以藥食兩用性植物蒲公英花乙醇提取物(Alcohol Extract of Dandelion Flowers,AEDF)作為受試藥物，以紅細(xì)胞自氧化溶血和自由基(H2O2)誘導(dǎo)所致氧化溶血為研究模型，通過(guò)對(duì)受試藥物在不同濃度下的吸光度的測(cè)定，并計(jì)算其溶血度，探討蒲公英花的抗氧化作用，并對(duì)其抗氧化活性成分進(jìn)行定性分析，以期開(kāi)發(fā)新的天然植物氧化防護(hù)劑。

1 材料與方法

1.1藥物置備野生蒲公英花，自然蔭干后粉碎，水煮醇沉、大孔樹(shù)脂吸附等處理后得到蒲公英花乙醇提取物(AEDF)。

1.2 主要儀器、試劑XSS250(FZ)型深部X線治療機(jī)，溫州大華儀器儀表有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LD5-100型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；循環(huán)水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；722型光柵分光光度計(jì)，北京中翰儀器有限公司；肝素鈉，長(zhǎng)春市化學(xué)試劑廠；苯胺-鄰苯二甲酸，長(zhǎng)春市化學(xué)試劑廠。

1.3 AEDF提取物溶液的配制用PBS 配置不同濃度的AEDF溶液，濃度分別為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL各20 ml，4℃冰箱保存，備用。

1.4 AEDF定性分析實(shí)驗(yàn)按照植物化學(xué)預(yù)試方法，分別用2% AlCl3、苯胺-鄰苯二甲酸等與提取物中成分反應(yīng)，檢視顏色的變化。泡沫試驗(yàn)，觀察泡沫消退的時(shí)間。同時(shí)對(duì)提取物進(jìn)行硅膠薄層層析(TLC)，依據(jù)TLC斑點(diǎn)所呈顏色推斷化合物類別：黃酮類化合物(硅膠G，展開(kāi)劑為正丁醇∶乙酸乙酯∶水=4∶1∶5，2 % AlCl3顯色)；多糖(硅膠G，展開(kāi)劑為乙酸乙酯∶吡啶∶無(wú)水乙醇∶水=82∶1∶2，苯胺-鄰苯二甲酸顯色)。

1.5 1%人紅細(xì)胞懸液的制備健康成人靜脈血4 ml，肝素抗凝。用pH=7.4的PBS沖洗，1 500 r/min，離心10 min。用PBS配制1%紅細(xì)胞懸液，4℃冰箱保存，備用。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1人紅細(xì)胞溶血度的測(cè)定 取1%人紅細(xì)胞懸液，加入預(yù)先配置好的5種濃度的AEDF溶液中，恒溫水浴箱孵育24 h，分別以H2O2誘導(dǎo)作為損傷因素，用722型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定紅細(xì)胞氧化損傷的溶血度。探討AEDF對(duì)體外紅細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。

1.6.2人紅細(xì)胞自氧化溶血度的測(cè)定 自氧化對(duì)照組：分別加入PBS 200 μl、3 ml濃度為1%的紅細(xì)胞懸液；實(shí)驗(yàn)組：200 μl PBS配制的含有不同濃度的AEDF再向其加入3 ml濃度為1 % 的人紅細(xì)胞懸液。充分混勻，將對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組同時(shí)置于37℃恒溫水浴孵育24 h，1 500 r/min，離心10 min。722型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，于470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，將對(duì)照組規(guī)定為100%溶血，計(jì)算溶血度。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行試管且重復(fù)3次。

溶血度=實(shí)驗(yàn)組吸光度/自氧化對(duì)照組吸光度× 100%

1.6.3自由基(H2O2)誘導(dǎo)所致紅細(xì)胞溶血度的測(cè)定 空白組：分別加入230 μl PBS、3 ml濃度為1%的紅細(xì)胞懸液；對(duì)照組：分別加入200 μl PBS、30 μl濃度為 30%的H2O2溶液、3 ml濃度為1%的紅細(xì)胞懸液；實(shí)驗(yàn)組：取200 μl PBS配制的含有不同濃度的AEDF，再向其加入30 μl濃度為30%的H2O2、3 ml濃度為1%的人紅細(xì)胞懸液。充分混勻，將空白組、對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組試管同時(shí)置于37℃恒溫水浴1 h，1 500 r/min，離心10 min。722型光柵分光光度計(jì)，470 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，視對(duì)照組為100%溶血，計(jì)算各組溶血度。實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行試管且重復(fù)3次。

溶血度=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)×100%

2 結(jié)果

2.1 AEDF化學(xué)成分定性分析結(jié)果

采用化學(xué)預(yù)示法和薄層層析法測(cè)定AEDF的主要化學(xué)成分。結(jié)果顯示，AlCl3顯黃色斑點(diǎn)，置紫外燈下，出現(xiàn)明顯黃綠色熒光，TLC出現(xiàn)明顯黃綠色斑點(diǎn)，說(shuō)明含黃酮類化合物；將苯胺-鄰苯二甲酸加入提取液中反應(yīng)生成藍(lán)色，TLC顯藍(lán)色斑點(diǎn)，說(shuō)明多糖物質(zhì)的存在。

2.2 人紅細(xì)胞溶血度測(cè)定的結(jié)果

2.2.1人紅細(xì)胞自氧化溶血度測(cè)定的結(jié)果 經(jīng)37℃恒溫水浴孵育24 h后，自氧化對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了不同程度的溶血現(xiàn)象，AEDF各劑量組紅細(xì)胞溶血度顯著低于氧化對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尚可認(rèn)為AEDF對(duì)紅細(xì)胞自氧化溶血有明顯的抑制作用，且隨著劑量的增加，紅細(xì)胞溶血度逐漸降低，提示AEDF與紅細(xì)胞自氧化溶血度可能存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表1，圖1。

表1 AEDF對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血的影響

圖1 AEDF對(duì)紅細(xì)胞的氧化溶血的影響

2.2.2自由基(H2O2)所致人紅細(xì)胞溶血度的測(cè)定結(jié)果 經(jīng)自由基(H2O2)誘導(dǎo)、37 ℃恒溫水浴1 h后，空白組、對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞有不同程度的溶血現(xiàn)象且顯著，與對(duì)照組進(jìn)行比較，AEDF各劑量組紅細(xì)胞溶血度顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可以認(rèn)為ADEF對(duì)H2O2所致紅細(xì)胞溶血有明顯的抑制作用,且隨著劑量的增加，紅細(xì)胞溶血度逐漸降低，提示AEDF與自由基(H2O2)所致紅細(xì)胞的溶血度可能存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表2、圖2。

表2 AEDF對(duì)氫過(guò)氧化引起的紅細(xì)胞溶血的影響

3 討論

紅細(xì)胞在血液循環(huán)中至關(guān)重要，維持紅細(xì)胞正常生物功能須依賴紅細(xì)胞膜的完整和彈性。一旦膜發(fā)生缺失或脆性增加，紅細(xì)胞就可能破裂，形成溶血。而紅細(xì)胞膜在自由基介導(dǎo)下的氧化被認(rèn)為是造成紅細(xì)胞損傷的重要原因[8]。紅細(xì)胞由于富含不飽和脂肪酸和Fe2+而極易受到氧化性損傷，細(xì)胞中的氧自由基會(huì)攻擊膜磷脂層會(huì)誘發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng),發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，膜脆性增，細(xì)胞腫脹、破裂，發(fā)生溶血[9]。H2O2可與血紅素輔基中的Fe2+發(fā)生Fenton型反應(yīng),產(chǎn)生極強(qiáng)的氧化劑羥自由基，從而加速細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致紅細(xì)胞氧化溶血[10]。

圖2 AEDF對(duì)氫過(guò)氧化引起的紅細(xì)胞溶血的的影響

氧化應(yīng)激[11]，ROS 十分活潑，如超氧陰離子能夠發(fā)生歧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、氧化反應(yīng)和質(zhì)子化反應(yīng)；H2O2則能夠生成羥自由基和參與氧化反應(yīng)等。通過(guò)這些反應(yīng)，再生成一些更活潑、壽命更長(zhǎng)、危害更大的過(guò)氧化物如脂質(zhì)過(guò)氧化物等，進(jìn)一步造成對(duì)細(xì)胞的損傷[12]。H2O2是體內(nèi)代謝產(chǎn)生的一種活性氧，在誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷乃至死亡中起了關(guān)鍵作用[13-14]。H2O2易穿透細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的還原型鐵離子通過(guò) Fenton 反應(yīng)，生成高度毒性的羥自由基，可以對(duì)多種細(xì)胞造成毒性，特別是紅細(xì)胞，因其H2O2酶活性低，故比其他部位更易受到氧化損傷[15]。本研究選用紅細(xì)胞自氧化溶血和自由基(H2O2)所致氧化溶血為研究模型，用于研究AEDF的氧化作用效果。有實(shí)驗(yàn)表明：自由基可使細(xì)胞膜、線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化及 DNA 損傷[16]。

抗氧化劑是一類能夠清除機(jī)體所產(chǎn)生的過(guò)量活性氧并能夠防止機(jī)體遭受氧化損傷，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用的物質(zhì)。目前全世界己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)氧化應(yīng)激具有防治作用的化學(xué)物質(zhì)和生物制劑，黃酮類、含氮化合物、植酸、類等[17]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)蒲公英花中多糖類平均含量為4.09%，黃酮類平均含量為3.65%[18]，且對(duì)許多細(xì)胞有抗氧化作用。