核磁共振波譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)判別油菜蜜的成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜

陳輝 張佳琳 鞠晶 高帥 范春林 張紫娟,?

1. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心, 北京 100176; 2. 北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院, 北京 100871;? 通信作者, E-mail: zhang_zijuan@163.com

蜂蜜的主要成分是以果糖和葡萄糖為主的糖類,占比為 70%～80%, 此外為水(18%～20%)、氨基酸、有機(jī)酸、無機(jī)酸、芳香類物質(zhì)、維生素、醇類、黃酮類、酶類、膽堿和礦物質(zhì)等[1]。天然成熟蜜是蜜蜂采集的植物花蜜、分泌物或蜜露與自身分泌物混合后, 經(jīng)過釀造, 從全封蓋巢脾中分離出來的含水量在 18%以下的蜂蜜[2], 亦稱封蓋蜜, 營養(yǎng)價(jià)值高,有消炎抑菌的作用[3-4], 可用于治療外傷[5]。非成熟蜜是蜜蜂采集的花蜜經(jīng)蜜囊分泌的轉(zhuǎn)化酶類物質(zhì)加工, 返巢后, 將蜜汁置于蜂巢中形成的蜂蜜, 在蜂巢中停留時(shí)間較短, 未經(jīng)蜜蜂充分釀制、脫水和轉(zhuǎn)化, 含水和蔗糖量較大, 也稱為水蜜, 營養(yǎng)價(jià)值低,容易發(fā)酵變質(zhì)。加工蜜是非成熟蜜經(jīng)人工脫水后的產(chǎn)品, 也稱濃縮蜜, 加工過程中活性酶會(huì)被破壞,風(fēng)味物質(zhì)減少, 生成有害物質(zhì)(如 5-羥甲基糠醛),增大引入其他有害物質(zhì)(如重金屬)的風(fēng)險(xiǎn)。雖然成熟蜜生產(chǎn)用時(shí)較長(zhǎng), 但營養(yǎng)價(jià)值高, 易于保存, 因此應(yīng)提倡和鼓勵(lì)生產(chǎn)成熟蜜。

關(guān)于蜂蜜的定義, 雖然中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《蜂蜜 GB 14963—2011》[6]以及國際食品法典蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)《CXS 12-1981》2019 年修訂版[7]中都說明蜂蜜是蜜蜂采集的植物花蜜、分泌物或蜜露與自身分泌物混合后, 經(jīng)充分釀造而成, 但后者還強(qiáng)調(diào)經(jīng)收集后的花蜜需與蜂蜜自身的物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、沉淀和脫水后, 貯藏并留存于蜂巢中, 直至成熟。

在蜂蜜收獲時(shí), 成熟蜜與非成熟蜜較易區(qū)分,無蜂蠟密封蜂巢中的蜂蜜為非成熟蜜, 而成熟蜜需要將蜂蠟割除后進(jìn)行采收。但是, 成熟蜜與加工蜜的物理性狀不易區(qū)分, 需開發(fā)鑒別方法。徐賢[8]將電子鼻技術(shù)與數(shù)學(xué)建模相結(jié)合, 可以較好地對(duì) 3 種蜂蜜進(jìn)行區(qū)分。張然等[9]使用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)山東洋槐蜜中的多酚物質(zhì), 用于區(qū)分成熟蜜與非成熟蜜。

核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)是利用被檢測(cè)原子核在外界磁場(chǎng)中經(jīng)施加射頻電磁波產(chǎn)生共振后, 在其弛豫過程中釋放的能量產(chǎn)生自由感應(yīng)衰減信號(hào), 經(jīng)傅立葉變換后得到的波譜。利用 NMR 技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),具有可動(dòng)態(tài)檢測(cè)、重現(xiàn)性好、信號(hào)強(qiáng)度與含量成正比、信號(hào)采集時(shí)間短以及樣品無損等優(yōu)點(diǎn)[10], 目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)藥、生物以及食品等領(lǐng)域[11-12]。本文采用 NMR 技術(shù)對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè),基于 NMR 譜圖中較明顯的不重疊的特征峰, 比較成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜中特征組分的含量, 然后通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法(O2PLS-DA 法)對(duì)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用蜂蜜樣品為來自安徽、江蘇和內(nèi)蒙古的油菜蜜, 各地區(qū)采集的蜂蜜樣品均包括非成熟蜜、加工蜜(濃縮蜜)和成熟蜜(表 1), 其中加工蜜由對(duì)應(yīng)的非成熟蜜濃縮而成。樣品保存于-20°C 冰箱中。

表1 蜂蜜樣品信息Table 1 Information of honey samples

重水(D2O, 99.9%)以及2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉(TSP, 98%)采購自美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室(Cambridge Isotope Laboratories, CIL), 磷酸二氫鉀(KH2PO4, 分析純)購自福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司, 疊氮鈉(NaN3, 分析純)采購自 MYM Biological Technology Company Limited, 磷酸(H3PO4, 分析純)購自美國 Sigma-Aldrich 公司, 氫氧化鉀(KOH,分析純)購自西隴化工股份有限公司。

主要儀器設(shè)備: 美國安捷倫科技 Agilent Technologies 600 MHz DD2 核磁共振波譜儀, 配有One-NMR 5 mm 寬帶二合一液體探頭, 7510 自動(dòng)進(jìn)樣器;梅特勒-托利多 XS104 天平以及 FiveEasy Plus pH計(jì); 默克密理博 Milli-Q Integral 超純水系統(tǒng); THZ-82A 水浴恒溫振蕩器; 昆山市超聲儀器有限公司KQ-500E 型超聲波清洗器; 日本 AS ONE TRIO TM-1N 渦旋混合器; 德國艾本德 Eppendorf 20～100 μL和 100～1000 μL 可調(diào)節(jié)移液器; 美國 NORELL 公司 5 mm 核磁管。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

分別稱取 50, 100 和 150 mg 蜂蜜樣品, 對(duì)樣品用量進(jìn)行考察。在數(shù)據(jù)采集過程中, 50 mg 樣品的波譜信號(hào)較弱, 150 mg 樣品的波譜信號(hào)溢出, 因此選取信號(hào)強(qiáng)度較大且未溢出的 100 mg 為樣品用量。

樣品核磁波譜的化學(xué)位移與測(cè)定時(shí)的 pH 值及溫度等條件相關(guān)。將測(cè)定溫度設(shè)為常用的室內(nèi)溫度25°C, 參考本研究組之前的實(shí)驗(yàn)條件, 選擇 pH 值為 4.50 的緩沖溶液。

水為蜂蜜固有的成分, 并且實(shí)驗(yàn)中使用的溶劑為 10%的重水, 因此在數(shù)據(jù)采集過程中, 通過普通Proton 和 NOESY 1D 預(yù)飽和壓制法對(duì)水的信號(hào)峰進(jìn)行壓制。普通 Proton 脈沖序列-預(yù)飽和法壓制水信號(hào)峰用時(shí)較短, 水的信號(hào)峰仍然過大, 無法滿足數(shù)據(jù)分析的需求; NOESY 1D 脈沖序列-預(yù)飽和法用時(shí)較長(zhǎng), 壓制水信號(hào)峰的效果明顯好于普通 Proton脈沖序列-預(yù)飽和法。因此, 采用 NOESY 1D 脈沖序列進(jìn)行樣品測(cè)試。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1) 0.15 mol/L 磷酸緩沖液的制備。稱取磷酸二氫鉀 8.17 g, 加入 Millipore 超純水 360 mL, 超聲波充分溶解后, 依次加入重水 40 mL, 疊氮鈉 80 mg,2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉 40 mg, 使用磷酸或氫氧化鉀調(diào)節(jié)濃度為 0.15 mol/L, pH 分別為 3.00,4.00, 4.50 和 7.40 的磷酸緩沖溶液, 精度為±0.02。

2) 樣品制備。從冰箱中取出蜂蜜樣品, 未結(jié)晶的樣品直接放置至室溫備用, 結(jié)晶的樣品需 50°C水浴加熱溶解, 再放置至室溫。稱取 100±5 mg 蜂蜜樣品, 置于 2 mL 離心管中, 加入 1000 μL 上述磷酸鹽緩沖液, 在渦旋混合器上充分混勻, 用移液器轉(zhuǎn)移 600 μL 樣品溶液至 5 mm 核磁管中待測(cè)。

3) 數(shù)據(jù)采集。使用 Agilent 核磁共振波譜儀自帶軟件 VnmrJ 4.2 采集數(shù)據(jù)。采用 NOESY 1D 脈沖序列進(jìn)行測(cè)試, 測(cè)試溫度為 25°C。使用重水鎖場(chǎng),90 度脈沖寬度為 10.7 μs, 混合時(shí)間為 100 ms, 延遲等待時(shí)間為 4 s。采用預(yù)飽和方法進(jìn)行水峰壓制, 施加功率約為 50 Hz, 持續(xù)時(shí)間為 2 s (包含在延遲等待時(shí)間中), 譜寬為 20 ppm (1 ppm=10-6), 采集點(diǎn)數(shù)為32k, 累計(jì)次數(shù)為 64。

4) 數(shù)據(jù)處理。用 MestReNova 11 軟件處理采集的核磁共振波信號(hào), 手動(dòng)調(diào)節(jié)相位, 自動(dòng)基線校正,以內(nèi)標(biāo)物 TSP 信號(hào)峰為化學(xué)位移的零點(diǎn), 對(duì)采集的化學(xué)位移(δ)在 0.53～9.53 ppm 范圍內(nèi)的峰面積進(jìn)行等間隔的分段積分。盡管樣品測(cè)試過程中使用預(yù)飽和法抑制水分, 但在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)仍然需要?jiǎng)h除4.78～4.98 ppm 范圍的數(shù)據(jù), 盡可能消除水峰對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。δ值積分間隔分別為 0.01, 0.02 和 0.05 ppm, 進(jìn)行面積歸一化處理后, 導(dǎo)入 SIMCA 13.0 軟件中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 油菜蜜核磁信號(hào)譜圖分析

通常將蜂蜜核磁信號(hào)譜圖的δ值分為 3 個(gè)區(qū)間:0～3 ppm 為脂肪區(qū), 主要為無共軛鍵氨基酸、有機(jī)酸和醇類物質(zhì)的信號(hào)譜區(qū)間; 3～6 ppm 為糖區(qū), 是各種糖類組分(主要為果糖和葡萄糖, 還有蔗糖和麥芽糖等低含量的糖分)的信號(hào)譜區(qū)間; 6～10 ppm 為芳香區(qū), 主要是羥甲基糠醛、苯丙氨酸和酪氨酸等含共軛雙鍵組分以及甲酸的信號(hào)譜區(qū)間。圖 1 為典型的油菜蜜核磁信號(hào)波譜圖, 其波譜數(shù)據(jù)符合蜂蜜的組成, 果葡糖為主要成分, 其他氨基酸、有機(jī)酸和醇類物質(zhì)均為低含量組分, 從中可分辨出無重疊的較明顯的信號(hào)峰。例如, 脂肪區(qū) 1.18 ppm (t,JH-H=7.1 Hz)為乙醇的甲基(CH3CH2OH)信號(hào)峰, 2.03 ppm(s)為來自乙酸的甲基信號(hào)峰; 糖區(qū) 5.23 ppm (d,JH-H=3.7 Hz)為與葡萄糖 1 位碳相連的氫(C1-H)信號(hào)峰;芳香區(qū) 8.42 ppm (s)為來自甲酸的次甲基(HCOOH)信號(hào)峰。以上這些特征信號(hào)峰的化學(xué)位移以及信號(hào)強(qiáng)度均符合蜂蜜成分的組成比例, 與文獻(xiàn)[13]基本上一致。由于糖類化合物的信號(hào)峰較多, 且多數(shù)重疊在一起, 本文不一一列出。表 2 中歸納了油菜蜜中可觀測(cè)的典型非糖組分核磁信號(hào)。

表2 油菜蜜中可觀測(cè)的典型非糖成分核磁氫信號(hào)譜數(shù)據(jù)Table 2 Data of the observable typical non-saccharide components in rape honey

圖1 典型油菜蜜的核磁信號(hào)波譜Fig. 1 NOESY 1D spectrum of a typical rape honey

2.2 成熟、非成熟與加工的油菜蜜核磁信號(hào)譜圖對(duì)比

比較加工蜜與對(duì)應(yīng)的非成熟蜜的核磁信號(hào)譜圖(圖 2)可知, 其主要成分果葡糖無顯著差異。在成熟蜜形成過程中, 蜜蜂將蜜汁置于蜂巢后, 會(huì)將蜜汁反復(fù)吞吐進(jìn)行加工, 蜜蜂分泌的多種轉(zhuǎn)化酶和蛋白質(zhì)會(huì)混入蜜汁中[14], 其中的蔗糖會(huì)轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖; 同時(shí), 蜜蜂翅膀的扇動(dòng)會(huì)促進(jìn)蜜汁中的水分揮發(fā), 使蜂蜜濃縮; 當(dāng)蜂蜜貯滿蜂巢后, 蜜蜂會(huì)生產(chǎn)蜂蠟來覆蓋蜂巢, 使其與空氣隔絕, 利于長(zhǎng)期保存。對(duì)于非成熟蜜, 蜜蜂在蜂巢中對(duì)其加工的時(shí)間較短, 水分揮發(fā)量較小, 導(dǎo)致其水分含量較高, 長(zhǎng)時(shí)間保存的非成熟蜜容易發(fā)酵而產(chǎn)生乙醇, 乙醇繼續(xù)發(fā)酵會(huì)生成乙酸; 即便在低溫條件下保存, 也只能減緩發(fā)酵速度, 不能完全杜絕發(fā)酵現(xiàn)象。從圖 2可以明顯地看到, 非成熟蜜中乙醇的甲基 CH3信號(hào)峰(1.18 ppm, t)明顯高于其對(duì)應(yīng)的加工蜜和成熟蜜,而加工蜜中的乙醇含量也比成熟蜜多, 可能是由在加工之前部分非成熟蜜發(fā)酵造成的。

圖2 3 個(gè)地區(qū)成熟、非成熟和加工油菜蜜核磁信號(hào)譜的特征峰Fig. 2 Characteristic NMR peaks’ of ripe, unripe and the cor-responding processed rape honey from three regions

非成熟蜂蜜加熱脫水時(shí), 如果溫度控制不好,可能會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard reaction), 導(dǎo)致少量糖的降解, 甚至可能生成其他有害物質(zhì), 如 5-羥甲基糠醛[15]。由于成熟蜜中含蔗糖轉(zhuǎn)化酶較多, 會(huì)將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖, 所以從圖 2 也可以看出葡萄糖的特征峰:β-吡喃葡萄糖 C2 (H)(3.24 ppm,dd);β-吡喃葡萄糖 C1 (H) (4.64 ppm, d);α-吡喃葡萄糖 C1 (H)(5.23 ppm, d)。蔗糖轉(zhuǎn)化酶可以將蔗糖分子酶解成葡萄糖和果糖, 即使在蜂蜜貯存過程中,該酶解過程仍在繼續(xù)。實(shí)驗(yàn)證明, 蔗糖轉(zhuǎn)化酶對(duì)溫度敏感, 加熱會(huì)導(dǎo)致其失去活性[16], 無法繼續(xù)將蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖, 導(dǎo)致加工蜜中蔗糖含量較高。因成熟蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶含量高于非成熟蜜和加工蜜, 所以成熟蜜中葡萄糖含量比非成熟蜜和加工蜜高。圖 2 中蔗糖特征峰 C1 (H) (5.40 ppm, d)也證實(shí), 油菜蜜中加工蜜的蔗糖含量明顯高于非成熟蜜和成熟蜜。

甲酸常作為除螨劑, 用于蜂螨的防治[17-18]。作為昆蟲, 蜜蜂會(huì)分泌甲酸[19-20]。蜂蜜長(zhǎng)期保存會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng), 生成甲酸[21-22]。從圖 2 中甲酸的特征峰(8.42 ppm, s)可以看到, 成熟蜜中甲酸含量高于非成熟蜜和加工蜜, 原因可能是成熟蜜在蜂巢中停留的時(shí)間較長(zhǎng), 無論是除螨劑帶來的甲酸, 還是蜜蜂自身分泌的甲酸, 都會(huì)增加其含量。加熱過程中的美拉德反應(yīng), 則造成加工蜜中甲酸含量高于非成熟蜜。

2.3 成熟、非成熟與加工的油菜蜜的核磁信號(hào)譜非靶向分析

按照 1.2.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟以及核磁波譜的范圍(0.53～9.53 ppm), 提取 3 個(gè)地區(qū)油菜蜜的成熟蜜、加工蜜和非成熟蜜的核磁信號(hào)檢測(cè)數(shù)據(jù), 將其導(dǎo)入SIMCA-P 軟件, 采用 O2PLS-DA 模型[23]和單位方差縮放(Unit Variance Scaling)方法進(jìn)行判別。

圖 3(a)～(c)為二維得分圖, 其積分間隔分別為0.01, 0.02 和 0.05 ppm, 可以看出積分間隔的選取對(duì)3 個(gè)地區(qū)成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜樣品間分組的影響, 不同區(qū)域的成熟蜜均可以較好地區(qū)分, 但加工蜜與非成熟蜜的區(qū)分效果不佳, 有部分重疊而無明顯的界限。這可能是因?yàn)榧庸っ塾煞浅墒烀奂訜崦撍? 二者主要成分及含量比例基本相同, 而蜂蜜加熱過程中損失的活性酶和芳香物質(zhì)(如酯類)含量較低, 在核磁信號(hào)檢出限以下, 所以無法明顯地區(qū)分非成熟蜜與加工蜜。

表 3 列出選取不同積分間隔時(shí) O2PLS-DA 判別的R2X,R2Y和Q2值, 積分間隔為 0.02 ppm 時(shí)R2Y和Q2值最高, 故之后的數(shù)據(jù)分析采用積分間隔為 0.02 ppm 的數(shù)據(jù)。圖 3(d)為積分間隔為 0.02 ppm 時(shí)的三維得分圖, 增加一個(gè)維度, 可以在三維空間將二維得分圖(圖 3(b))中重疊在一起的加工蜜與非成熟蜜區(qū)分開。

圖3 不同積分間隔時(shí) O2PLS-DA 對(duì) 3 個(gè)地區(qū)成熟、非成熟及加工油菜蜜分組的得分圖Fig. 3 O2PLS-DA grouping score plots of ripe, unripe and processed rape honey from three regions with different segmental bins

表3 不同積分間隔時(shí) O2PLS-DA 對(duì) 3 個(gè)地區(qū)成熟、非成熟及加工油菜蜜分組的 R2X, R2Y 和 Q2 值Table 3 R2X, R2Y and Q2 of ripe, unripe and processed rape honey from three regions by O2PLS-DA with different segmental bins

圖 4 顯示, 同一地區(qū)的成熟蜜、加工蜜與非成熟蜜可以用 O2PLS-DA 方法進(jìn)行清晰的區(qū)分。在相應(yīng)的得分圖中, 3 個(gè)地區(qū)的成熟蜜位于y軸零值線的左側(cè), 加工蜜和非成熟蜜位于y軸零值線的右側(cè);成熟蜜集中在x軸零值線附近, 加工蜜與非成熟蜜則分列x軸零值線的兩側(cè)。表 4 列出 3 個(gè)地區(qū)成熟蜜、加工蜜和非成熟蜜分組的R2X,R2Y和Q2值, 其中R2Y值均大于 0.97,Q2值均大于 0.81, 分組結(jié)果令人滿意。

表4 O2PLS-DA 對(duì)同一地區(qū)成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜分組的R2X, R2Y 和Q2 值Table 4 R2X, R2Y and Q2 of ripe, unripe and processed rape honey from same region by O2PLS-DA grouping

圖4 O2PLS-DA 對(duì)同一地區(qū)成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜分組的得分圖Fig. 4 O2PLS-DA grouping score plots of ripe, unripe and processed rape honey from same region

在積分間隔為 0.02 ppm 時(shí), 分別對(duì) 3 個(gè)地區(qū)的加工蜜與非成熟蜜、非成熟蜜與成熟蜜以及成熟蜜與加工蜜進(jìn)行分組, 結(jié)果如見圖 5(a)～(c)所示, 其R2X,R2Y和Q2值均大于 0.6, 在可接受范圍內(nèi)。與表 3 相比, 表 5 中R2X,R2Y和Q2值都有所提升。二維圖中, 只圖 5(c)中兩個(gè)地區(qū)的加工蜜有部分重疊,其余都可以區(qū)分開, 而重疊的加工蜜在三維圖中(圖 5(d))完全可以區(qū)分開。從圖 5(b)和(c)可以看出,3 個(gè)地區(qū)成熟蜜之間的差別比其非成熟蜜或加工蜜之間的差別大。

表5 O2PLS-DA 對(duì) 3 個(gè)地區(qū)成熟、非成熟和加工油菜蜜兩兩分組的 R2X, R2Y 和 Q2 值Table 5 R2X, R2Y and Q2 of ripe, unripe and processed rape honey by O2PLS-DA grouping in pairs

圖5 O2PLS-DA 對(duì) 3 個(gè)地區(qū)成熟、非成熟和加工油菜蜜兩兩分組的得分圖Fig. 5 O2PLS-DA grouping score plots of ripe, unripe and processed rape honey from three regions in pairs

3 結(jié)論

本文應(yīng)用 NMR 技術(shù), 測(cè)定采集自安徽、內(nèi)蒙古和江蘇 3 個(gè)地區(qū)油菜蜜的 80 個(gè)成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜樣品的氫信號(hào)譜, 結(jié)果表明 3 類蜂蜜的乙醇、蔗糖、葡萄糖和甲酸等未重疊核磁信號(hào)特征峰存在一定的差異。應(yīng)用 O2PLS-DA 方法建立成熟蜜、非成熟蜜和加工蜜的判別模型, 可以基于核磁檢測(cè)的氫信號(hào)譜, 清楚地區(qū)分同一地區(qū)的 3 類蜂蜜。同時(shí), 考慮油菜蜜的產(chǎn)地因素, 基于 80 個(gè)樣本建立判別模型, 可以區(qū)分成熟蜜與非成熟蜜和加工蜜, 但非成熟蜜與加工蜜在二維圖中有部分重疊,增加一個(gè)維度后, 可以在三維圖加以區(qū)分。本文方法可以用來區(qū)分成熟蜂蜜、非成熟蜜和加工蜜, 樣品用量少, 檢測(cè)用時(shí)短, 重復(fù)性好, 結(jié)果可靠, 可作為一種鑒別蜂蜜種類和產(chǎn)地的有效方法。