全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 測定蜂蜜中4種吡咯里西啶類生物堿

朱秀煥，郝勝玉，玄紅專，常晨陽，趙成新，李愛峰

（1.聊城海關(guān)，山東聊城 252000；2.聊城大學(xué)物理科學(xué)與信息工程學(xué)院，山東聊城 252000；3.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252000；4.泰安海關(guān)，山東泰安 271000；5.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東聊城 252000）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然物質(zhì)[1]，是營養(yǎng)豐富的天然滋養(yǎng)食品。隨著蜂蜜市場需求量的不斷提高，蜂蜜的安全問題也日益嚴(yán)重，農(nóng)藥、獸藥殘留、摻雜、摻假等問題不斷出現(xiàn)[2]，嚴(yán)重影響了我國蜂蜜產(chǎn)品的市場秩序和出口貿(mào)易。

吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine Alkaloids，PAs）是一種在開花植物中廣泛存在的毒性生物堿，其毒性表現(xiàn)在肝臟毒性、腎臟毒性、肺臟毒性、致癌作用等許多方面[3-5]。蜜蜂采集了這類植物的花蜜釀造出的蜂蜜含有PAs，給人類的健康帶來潛在的威脅。近年來，GRIFFIN等[6]對(duì)59份澳大利亞蜂蜜樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中41份樣品中含有PAs，這一研究報(bào)告使蜂蜜的質(zhì)量問題再一次引起人們的關(guān)注。中國是全球最大的蜜蜂養(yǎng)殖國，蜂蜜的生產(chǎn)量和出口量穩(wěn)居世界第一。蜂蜜是人體攝入PAs的重要途徑之一，并且存在長期食用的可能性，其低水平、長期暴露的風(fēng)險(xiǎn)值得關(guān)注。鑒于PAs的廣泛來源及強(qiáng)烈的毒性，建立蜂蜜及植物源性食品中PAs的檢測方法及加強(qiáng)PAs的監(jiān)測具有十分重要的意義。

現(xiàn)有的PAs的檢測方法包括液相色譜法[7]、酶聯(lián)免疫吸附分析[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]及液相色譜-質(zhì)譜法[10-12]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了液相色譜高效的在線分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度，具有同時(shí)檢測多種不同性質(zhì)目標(biāo)物的能力，在藥物多殘留分析中顯示出越來越廣闊的應(yīng)用前景，但該方法對(duì)樣品的前處理要求比較高。有文獻(xiàn)報(bào)道采用強(qiáng)陽離子型固相萃取柱凈化蜂蜜樣品[13]，另外杜鳳君等人采用了QuEChERS方法優(yōu)化了蜂蜜中33種生物堿的凈化方法[14]。但上述兩種方法存在操作步驟煩瑣耗時(shí)、測定成本高、凈化效果不好等問題。近年來，由固相萃取發(fā)展而來的全自動(dòng)萃取，采用全自動(dòng)固相萃取裝置的程序設(shè)置實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)化的樣品前處理過程，不僅可以解決傳統(tǒng)固相萃取操作耗時(shí)的缺點(diǎn)，還可以減少人為誤差[15-19]。

本文以蜂蜜基質(zhì)中4種吡咯里西啶類生物堿（野百合堿、倒千里光堿、千里光寧、千里光菲啉）為研究對(duì)象，通過全自動(dòng)固相萃取技術(shù)凈化樣品，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）同時(shí)測定，有效縮短了測定時(shí)間，為蜂蜜等植物源性產(chǎn)品中PAs的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀-6460三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；全自動(dòng)固相萃取儀，美國萊伯泰科公司；渦旋混勻器，德國IKA公司；十萬分之一分析天平，德國塞多利斯公司；高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司。

野百合堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）；倒千里光堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）；千里光寧標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）；千里光菲啉標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），均為美國Stanford公司；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨，色譜純，美國Fisher公司；去離子水，自制；強(qiáng)陽離子固相萃取柱（SCX，60 mg/3 mL）天津Agela公司；混合型陽離子交換固相萃取柱（CX，60 mg/3 mL），美國Ameritech公司；高聚物固相萃取柱（HLB，60 mg/3 mL），日本島津公司；蜂蜜樣品分別由貴州省農(nóng)科院提供和購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理

（1）渦旋提取。準(zhǔn)確稱取蜂蜜樣品2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 50%甲醇水（V/V）溶液，3 000 r/min渦旋提取10 min，10 000 r/min離心5 min后取上清液，待凈化。

（2）樣品凈化。采用全自動(dòng)固相萃取儀設(shè)定洗脫程序，按設(shè)定程序凈化樣品。洗脫液用氮吹儀在45 ℃下吹干，加入1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解殘?jiān)?，過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測。

1.2.2 分離及檢測條件

（1）色譜分離條件。Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm× 2.1 mm，3.5 μm）；流 動(dòng) 相：A（0.1%甲 酸，10 mmol/L乙酸銨水溶液）∶B（乙腈）=86∶14（V/V）；流速： 0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

（2）質(zhì)譜檢測條件。掃描方式：電噴霧正離子掃描模式（ESI+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓： 4 000 V；干燥氣流速：11 L/min；霧化器溫度：350 ℃；霧化器壓力：310.26 kPa；4種PAs的質(zhì)譜檢測條件見表1。

表1 質(zhì)譜檢測條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

向空白蜂蜜基質(zhì)中加入4種PAs，使其濃度為10 μg/kg，以50%甲醇水溶液（V/V）為提取溶劑，確定渦旋提取時(shí)間為10 min。

2.2 固相萃取凈化

采用全自動(dòng)固相萃取儀設(shè)定洗脫程序，分別比較了3種固相萃取柱（SCX、CX、HLB）的凈化效果，結(jié)果如圖1所示，使用SCX固相萃取柱凈化，PAs的回收率最高。另外利用全自動(dòng)萃取技術(shù)可以真正做到不用人工動(dòng)手的情況下完成相關(guān)工作，節(jié)約了人工時(shí)間，同時(shí)將實(shí)驗(yàn)中的誤差降到了最低，比傳統(tǒng)的人工操作方便且穩(wěn)定性強(qiáng)，還更加環(huán)保。

圖1 不同SPE固相萃取柱凈化效果的比較

2.3 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜分離條件的優(yōu)化

4種PAs的同時(shí)測定依賴于色譜柱的選擇，不同類型的色譜柱對(duì)4種PAs的分離效果存在一定的差異。實(shí)驗(yàn)考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）和Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），部分PAs在Agilent Poroshell 120 EC-C18柱上拖尾嚴(yán)重，峰形不對(duì)稱，分離效果不好。4種PAs 在Agilent Eclipse Plus C18柱上峰形對(duì)稱尖銳，可以實(shí)現(xiàn)良好的分離。

2.3.2 質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化

分別用0.1%甲酸溶液稀釋4種PAs儲(chǔ)備液，在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定待測物的母離子，再分別進(jìn)行子離子全掃描。選擇兩個(gè)特征子離子，分別取信噪比高、峰形好看、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。以多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式優(yōu)化各個(gè)質(zhì)譜參數(shù)，4種PAs混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子圖見圖2。

圖2 4種PAs混合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

以0.1%甲酸溶液為定溶液，配制PAs的質(zhì)量濃度為分別為0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、 5.0 μg/L、10.0 μg/和20.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比（S/N）大于3確定為本方法的檢出限，以信噪比（S/N）大于10， 回收率大于60%的濃度點(diǎn)確定為本方法的定量限，方法的線性、檢出限和定量限如表2所示。

表2 方法的線性及定量限

2.5 準(zhǔn)確度

向空白蜂蜜基質(zhì)中按1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg這3個(gè)不同加標(biāo)水平加入相應(yīng)量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化的方法測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，如表3所示4種PAs的加標(biāo)回收率在83.98%～94.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）均低于5%，表明方法的準(zhǔn)確度較高。

表3 方法的準(zhǔn)確度及回收率（n=6）

分別對(duì)20個(gè)不同產(chǎn)地、不同種類的蜂蜜樣品中PAs的含量進(jìn)行了測定，其中3個(gè)樣品檢出了倒千里光堿，含量分別為0.53 μg/kg、0.49 μg/kg、0.23 μg/kg，1個(gè)樣品檢出了千里光菲啉，含量為0.27 μg/kg，野百合堿和千里光寧均未 檢出。

3 結(jié)論

本文建立了全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中4種PAs，并用于實(shí)際樣品的檢測。結(jié)果表明該方法靈敏度高、回收率高、操作簡便、定量準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)環(huán)保且高效穩(wěn)定，適用于蜂蜜中PAs的測定，為蜂蜜中PAs的檢測提供了一種高效簡便的方法，可以為蜂蜜等植物源性產(chǎn)品中PAs的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。