巴克夏豬、淮豬及其雜交F1代HAL基因多態(tài)性檢測(cè)

凌清露， 李 慧， 陳 苗， 靳二輝， 顧有方

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

氟烷基因(Halothane,

HAL

)又稱(chēng)氟烷敏感基因或蘭尼定受體基因,它是豬產(chǎn)生應(yīng)激綜合癥和PSE(Pale Soft Exudative)肉的主效基因。Davies等在豬第6號(hào)染色體pq上定位氟烷基因,由等位基因

HAL

(正常顯性)和

HAL

(變異隱性)進(jìn)行控制。Fujii等研究了皮特蘭豬和大白豬的蘭尼定受體cDNA序列表明該基因的cDNA中發(fā)生C→T突變,使Arg置換為Cys時(shí),豬易產(chǎn)生應(yīng)激綜合征。Fisher等研究表明

HAL

HAL

型豬日增重顯著高于

HAL

HAL

型和

HAL

HAL

型。帥素容等研究表明

HAL

HAL

型肉質(zhì)最好,

HAL

HAL

型肉質(zhì)最差,

HAL

HAL

型肉質(zhì)在兩者之間。劉顯軍等研究表明

HAL

HAL

豬胴體重、眼肌面積、瘦肉率顯著高于

HAL

HAL

豬。張建軍研究表明攜帶

HAL

HAL

型和

HAL

HAL

型基因的豬對(duì)應(yīng)激敏感,其肌肉收縮強(qiáng)烈,肌肉的生長(zhǎng)和脂肪的消耗速度比正常豬快,從而提高了瘦肉率。在對(duì)繁殖性狀的影響上,攜帶有

HAL

HAL

基因的母豬對(duì)應(yīng)激敏感度高,母豬受到應(yīng)激后難以配種,懷孕母豬極易流產(chǎn)?？傊?隱性純合子

HAL

HAL

型相對(duì)于

HAL

HAL

型和

HAL

HAL

型表現(xiàn)出了一定的劣勢(shì)。

有關(guān)于基因分型技術(shù),目前仍廣泛利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCRRFLP)檢測(cè)氟烷基因，而PCR-RFLP在該領(lǐng)域尚未見(jiàn)報(bào)道。外種豬與中國(guó)地方豬雜交的后代普遍具有能遺傳兩個(gè)親本優(yōu)勢(shì)的能力,具有較好的雜交優(yōu)勢(shì)。巴克夏豬源于英國(guó),盛產(chǎn)雪花瘦肉,是一種肉質(zhì)優(yōu)良的瘦肉型豬種。淮豬具有繁殖力強(qiáng)、耐粗飼、抗病性能好等特點(diǎn)。將引進(jìn)的巴克夏豬選育成優(yōu)質(zhì)瘦肉型專(zhuān)門(mén)化父系,利用淮豬(霍壽黑豬)優(yōu)良肉質(zhì)基因資源,導(dǎo)入巴克夏豬血統(tǒng),雜交而得F代巴淮豬,具有較好的雜交優(yōu)勢(shì),更適合國(guó)人對(duì)肉質(zhì)的需求。

本研究采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)了巴克夏豬、淮豬(霍壽黑豬)、巴淮豬HAL基因型分布,為巴克夏豬、淮豬(霍壽黑豬)的開(kāi)發(fā)利用以及加速育成肉質(zhì)優(yōu)良的巴淮豬提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 來(lái)自安徽浩翔農(nóng)牧有限公司養(yǎng)豬場(chǎng)的巴淮豬105頭、巴克夏豬32頭,來(lái)自鳳臺(tái)縣順民養(yǎng)殖有限公司的淮豬(霍壽黑豬)38頭,采集上述豬耳組織樣本于75%乙醇溶液中,-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 蛋白酶K、2×Taq PCR Master Mix(含染料)、DNA Marker DL2000,購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;限制性?xún)?nèi)切酶(Hha I)購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;Tanon凝膠成像系統(tǒng)、穩(wěn)壓電泳儀、平板電泳槽、PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及檢測(cè) 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》,用苯酚氯仿抽提法提取基因組DNA,取耳組織0.5 g裝在1.5 mL離心管中,加入600 μL組織 DNA提取液。在1.5 mL離心管中加入10 μL Proteinase K(20 mg/mL),搖晃充分均勻后置于56 ℃的恒溫水浴鍋中消化過(guò)夜。水浴結(jié)束后,向各個(gè)1.5 mL離心管中加入約600 μL Tris飽和酚,上下翻轉(zhuǎn)混勻約8 min,12 000 r/min離心8 min。取上步驟的清液,各加入300 mL Tris飽和酚、288 μL氯仿、12 μL異戊醇,上下翻轉(zhuǎn)搖晃混勻8 min,12 000 r/min離心8 min。將離心后的上清液吸入干凈的1.5 mL離心管中,加入576 μL氯仿和24 μL異戊醇,上下翻轉(zhuǎn)混勻8 min,12 000 r/min離心8 min。取離心后上清液,加入1 mL冰乙醇,此時(shí)水平搖動(dòng),可見(jiàn)絮狀、白色凝集物團(tuán)狀DNA出現(xiàn)。12 000 rpm離心5 min,DNA沉于管底,小心倒去冰乙醇。加入600 mL 75%乙醇,搖動(dòng)洗滌DNA,12 000 r/min離心3 min后棄廢液,重復(fù)步驟搖動(dòng)洗滌3次。棄去75%的乙醇,斜放自然干燥,等待酒精揮發(fā)完全后,加入150 μL TE溶解DNA。將樣本分裝3份,50 μL/份。留取一份稀釋,另外兩份于-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)核酸蛋白儀檢測(cè)的DNA濃度,按照比例將DNA樣品稀釋到100～200 ng/μL,于4 ℃保存待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照Fujii等的引物,豬

HAL

基因上游引物序列5′-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA-3′,下游引物序列5′-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2.3

HAL

基因的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系(25 μL)為:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,雙蒸水10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性,5 min;94 ℃變性35 s,61 ℃退火35 s,72 ℃延伸35 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。1.2.4 PCR產(chǎn)物酶切 采用限制性?xún)?nèi)切酶Hha I對(duì)擴(kuò)增的豬

HAL

基因目的片段進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系(10 μL)為:PCR產(chǎn)物5 μL,內(nèi)切酶0.5 μL,內(nèi)切酶緩沖液1.5 μL,雙蒸水3 μL。酶切反應(yīng)溫度為37 ℃,酶切產(chǎn)物于3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),判斷基因型。1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用χ檢驗(yàn)判斷群體中豬

HAL

基因型分布是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。利用Popgene軟件計(jì)算等位基因頻率、基因型頻率和遺傳多態(tài)性指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬組織基因組DNA提取結(jié)果

豬基因組DNA電泳檢測(cè)見(jiàn)圖1,提取的基因組DNA為一條較致密、清晰的條帶,并且拖尾不嚴(yán)重,表明基因組DNA的完整性較好,含量較高。

圖1 組織基因組DNA

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

豬

HAL

基因的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物大小為659 bp,見(jiàn)圖2,與預(yù)計(jì)的片段長(zhǎng)度一致,無(wú)非特異條帶,可用作下一步酶切試驗(yàn)。

圖2 豬HAL基因擴(kuò)增結(jié)果

2.3 HAL基因PCR-RFLP酶切結(jié)果

豬HAL基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳檢測(cè)分型結(jié)果見(jiàn)圖3。

HAL

基因存在3種基因型(

HAL

HAL

,

HAL

HAL

,

HAL

HAL

型),該突變位點(diǎn)cDNA第1 834位點(diǎn)C>T,引起Hha I限制性酶切位點(diǎn)的存在與丟失。

HAL

HAL

型為493、166 bp二條帶型,

HAL

HAL

型為659、493、166 bp三條帶型,

HAL

HAL

型為659 bp單條帶型。本研究的3個(gè)豬群中均沒(méi)有檢測(cè)到

HAL

HAL

基因型。

圖3 豬HAL基因HhaI酶切結(jié)果

2.4 HAL基因的基因型頻率和等位基因頻率

表1 豬HAL基因Hha I酶切位點(diǎn)的PCR-RFLP基因型頻率和基因頻率

2.5 HAL基因的遺傳多態(tài)性分析

豬

HAL

基因Hha I酶切位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析見(jiàn)表2。所檢測(cè)豬種的

HAL

基因,純合度Ho:巴淮豬(0.926 7)介于巴克夏豬(0.969 2)和淮豬(0.900 3)之間;雜合度He:巴淮豬(0.073 3)介于淮豬(0.099 7)和巴克夏豬(0.030 8)之間。巴克夏豬、淮豬和巴淮豬的

HAL

基因Hha I酶切位點(diǎn)均處于低度多態(tài)(

PIC

<0.25),且巴淮豬多態(tài)信息含量 (polymorphism information content, PIC)(0.070 6)處于巴克夏豬(0.030 3)、淮豬(0.094 8)之間。

表2 豬HAL基因的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

3 結(jié)論與討論

HAL

基因是與豬PSE肉相關(guān)的主效基因,盡管

HAL

等位基因可以增加豬的瘦肉水平,但隱性純合基因型造成的豬應(yīng)激綜合征會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,因此不能忽視豬群中等位基因

HAL

的檢測(cè)。研究表明,豬氟烷敏感基因(

HAL

)具有多效性,一方面導(dǎo)致肌肉肥大并可增加胴體瘦肉率,另一方面易可誘導(dǎo)發(fā)生豬應(yīng)激綜合征。肖倩等研究表明,攜帶了

HAL

隱性等位基因的個(gè)體在生長(zhǎng)速度、飼料轉(zhuǎn)化效率等方面表現(xiàn)出優(yōu)異性,比不攜帶

HAL

隱性等位基因的個(gè)體更好。石磊對(duì)我國(guó)引進(jìn)豬種(大白豬、杜洛克豬和長(zhǎng)白豬)的檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)

HAL

HAL

豬的背膘厚度比

HAL

HAL

和

HAL

HAL

型豬薄。本研究對(duì)32頭巴克夏豬、38頭淮豬和105頭巴淮豬的

HAL

基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)豬群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),沒(méi)有檢測(cè)到

HAL

HAL

基因型。其中巴克夏豬

HAL

基因Hha I酶切位點(diǎn)

HAL

HAL

基因型頻率較高、

HAL

HAL

基因型頻率較低;等位基因

HAL

頻率(98.44%)高于

HAL

頻率(1.56%)。與皮特蘭豬相比,巴克夏豬等位基因

HAL

頻率結(jié)果較低,與我國(guó)蒙山黑土豬種相比結(jié)果類(lèi)似?；簇i

HAL

基因Hha I酶切位點(diǎn)

HAL

HAL

基因型頻率較高,

HAL

HAL

基因型頻率較低;等位基因

HAL

頻率(94.74%)高于

HAL

頻率(5.26%)。與報(bào)道的黔北黑豬、寧鄉(xiāng)豬相比,淮豬等位基因

HAL

頻率結(jié)果偏高。由于氟烷基因

HAL

會(huì)對(duì)豬的肉質(zhì)、生產(chǎn)性能造成一定的影響,應(yīng)加快篩除

HAL

等位基因,及時(shí)淘汰

HAL

基因攜帶者以及可能出現(xiàn)在豬群體中的隱性個(gè)體,從而保證豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。本研究中,3個(gè)豬群

HAL

基因Hha I酶切位點(diǎn)均檢測(cè)到了

HAL

HAL

基因型,但為了防止由

HAL

HAL

基因型個(gè)體交配出現(xiàn)隱性純合子而導(dǎo)致豬肉品質(zhì)下降,在豬群體中剔除

HAL

等位基因是必要的。所檢測(cè)豬種的

HAL

基因純合度

Ho

和雜合度

He

,巴淮豬(0

.

073 3)均介于淮豬(0

.

099 7)和巴克夏豬(0

.

030 8)之間。巴克夏豬、淮豬和巴淮豬的

HAL

基因Hha I酶切位點(diǎn)均處于低度多態(tài)(

PIC

<0.25),且多態(tài)信息含量(PIC)巴淮豬(0.070 6)處于巴克夏豬(0.030 3)、淮豬(0.094 8)之間,結(jié)果提示育種過(guò)程應(yīng)加快淘汰

HAL

基因的淮豬群體。綜上所述，本試驗(yàn)在巴克夏豬、淮豬及它們的F代巴淮豬中均檢測(cè)到雜合子

HAL

HAL

,應(yīng)及時(shí)淘汰

HAL

基因攜帶者,為巴克夏豬、淮豬(霍壽黑豬)的開(kāi)發(fā)利用以及加速育成肉質(zhì)優(yōu)良的巴淮豬新品系提供一定的參考依據(jù)。