Gga-miR-29b-3p抑制MDV轉(zhuǎn)化細(xì)胞侵襲和原癌基因Meq表達(dá)

趙春芳， 連 玲， 楊 寧， 任 曼， 靳二輝，胡倩倩， 鄭美麗， 李升和*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 安徽省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽 233100；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；3.北京市畜牧總站，北京 100107)

馬立克氏病(Marek's Disease, MD)是一種由馬立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV)引起的細(xì)胞接觸性、高度原癌性和淋巴增生性的禽類疾病，患病家禽通常表現(xiàn)出免疫抑制、神經(jīng)炎和T細(xì)胞淋巴瘤形成的癥狀。雛雞感染MDV后會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞發(fā)育成熟受阻。日糧中添加聚蘋果酸鈣和大蒜素可以促進(jìn)肉雞免疫器官的生長發(fā)育，或許可提高雞群對(duì)MDV等病菌感染的抵抗力。體內(nèi)的干擾素IFNα和IFNγ能夠延緩MD的發(fā)生和蔓延，阻斷內(nèi)源性IFNα能夠加速M(fèi)D的病程。在MDV中已發(fā)現(xiàn)一些病毒基因與其致病性密切相關(guān)，其中

Meq

基因決定MDV的原癌性。MDV可以感染自然殺傷細(xì)胞，而Meq基因的存在有助于自然殺傷細(xì)胞的激活。Meq基因可以與轉(zhuǎn)錄共遏因子C-末端結(jié)合蛋白CtBP發(fā)生功能性結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、增殖和凋亡過程。如果CtBP結(jié)合域發(fā)生突變能夠完全破環(huán)MDV的致癌性，說明Meq與CtBP的結(jié)合域?qū)τ诰S持病毒的原癌性至關(guān)重要。盡管MD可以用疫苗預(yù)防，但是隨著病毒毒力的增強(qiáng)，我們需要從不同的視角研究MD的致病機(jī)理，從而為該病的防治提供更多的思路。

目前已有一些研究利用MD模型分析宿主和病毒miRNA的表達(dá)變化。Tian等利用miRNA芯片篩選對(duì)MDV感染較敏感的miRNA，結(jié)果在72易感系中發(fā)現(xiàn)有64個(gè)候選miRNAs感染MDV后出現(xiàn)表達(dá)差異。Teng等發(fā)現(xiàn)原癌病毒GaHV2中的miR-M31-3p和miR-M11-5p在MD腫瘤發(fā)生中分別扮演潛在原癌基因和腫瘤抑制因子的角色。Zhang等發(fā)現(xiàn)MDV編碼的miR-M4雖然在MDV引發(fā)的淋巴瘤和淋巴細(xì)胞系中高表達(dá)，但是對(duì)于維持腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化狀態(tài)并不是必需的。

先前利用Solexa深度測序分析了MD致瘤組和MDV未感染組的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)gga-miR-29b-3p在MDV引發(fā)的腫瘤組織中表達(dá)異常。本研究分析該miRNA潛在靶基因的功能，檢測其對(duì)MD腫瘤細(xì)胞MSB1中與侵襲密切相關(guān)的

MMP2

、

MMP9

基因，以及MDV原癌基因

Meq

表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供試驗(yàn)雞群和馬立克氏病病毒毒株(MDV-GA)。選擇1日齡無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)的白來航雞攻毒組100只和對(duì)照組50只。攻毒組個(gè)體腹腔注射MDV-GA(2 000 PFU)國際標(biāo)準(zhǔn)毒株0.2 mL，對(duì)照組注射同等劑量的無病毒稀釋液。兩組雞分別飼養(yǎng)在不同的負(fù)壓隔離器中，其他試驗(yàn)條件一致，試驗(yàn)持續(xù)56 d。在感染MDV的30～56 d，一共有47只雞體內(nèi)發(fā)生腫瘤。在感染后31～55 d，連續(xù)觀察雞群狀態(tài)，對(duì)表現(xiàn)為嚴(yán)重病癥的個(gè)體進(jìn)行屠宰，同時(shí)屠宰未感染對(duì)照組個(gè)體。個(gè)體屠宰后收集脾臟、肝臟和各組織來源的MD淋巴瘤。所有組織均保存在RNA保存液中，置于-80 °C用于RNA的提取。

1.2 miRNA靶基因的生物學(xué)功能分析

利用在線軟件miRDB(Http://www.mirbase.org)和TargetScan(Http://www.targetscan.org/)對(duì)gga-miR-29b-3p的潛在靶基因進(jìn)行生物學(xué)預(yù)測，得到兩者預(yù)測的共同靶基因，作為候選靶基因。然后，在DAVID平臺(tái)(Https://david.ncifcrf.gov)對(duì)預(yù)測出的候選靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和miRNA轉(zhuǎn)染

MDV轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞系MDCC-MSB1培養(yǎng)條件是利用含有10%胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于溫度37 ℃，濕度95%,含有5% CO的培養(yǎng)箱中。FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑(Promega公司)用于miRNA轉(zhuǎn)染，用于轉(zhuǎn)染的miRNA激動(dòng)劑(Agomir)和陰性對(duì)照(Negative control, NC)劑量分別為100 nmol/L。Gga-miR-29b-3p agomir和NC試劑均購于上海吉瑪公司。

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

利用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取冰凍組織或細(xì)胞總RNA。利用cDNA synthesis kit(miRACLE公司)反轉(zhuǎn)錄miRNA，qPCR miRNA kit(miRACLE公司)用于miRNA的定量檢測, 每組8個(gè)樣本。用于檢測內(nèi)對(duì)照5S的上游引物序列為5'-ACCGGGTGCTGTAGGCTTAA-3'；檢測gga-miR-29b-3p的上游引物序列為5'-CGTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTA-3'。反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性10 min，95 °C變性10 s，57 °C退火20 s，72 °C延伸1 min，在ABI 7500儀器(Invitrogen公司)上進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于基因表達(dá)水平的檢測。使用Power SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen公司)進(jìn)行qRT-PCR檢測，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

β

-

actin

、

MMP2

、

MMP9

和

Meq

基因的引物信息參照之前發(fā)表的文章。以5S和β-actin為內(nèi)參基因，通過2方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)的表達(dá)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。利用SAS(9.0版本)軟件按照t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)

P

<0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)之間差異顯著；當(dāng)

P

<0.01時(shí)表示數(shù)據(jù)之間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gga-miR-29b-3p在MD腫瘤化組織和未感染組織中的表達(dá)

Gga-miR-29b-3p在馬立克氏病腫瘤化組織和未感染組織中的表達(dá)量見圖1。與未感染組脾臟相比較，Gga-miR-29b-3p的表達(dá)量在腫瘤化脾臟中顯著下調(diào)(

P

<0.05)；與未感染組肝臟相比，Gga-miR-29b-3p在肝臟淋巴瘤中的表達(dá)也呈現(xiàn)顯著性下調(diào)(

P

<0.05)(圖1)。結(jié)果提示該miRNA在馬立克氏病腫瘤化組織中表達(dá)下調(diào)。

注：NS為未感染脾臟；TS為腫瘤化脾臟；NL為未感染肝臟；LL為肝臟淋巴瘤。n=8,P<0.05。圖1 腫瘤化組織和未感染組織中g(shù)ga-miR-29b-3p的表達(dá)水平Fig.1 Differential expression of gga-miR-29b-3p in tumourous and non-infected tissues

2.2 Gga-miR-29b-3p的潛在靶基因功能分析

2.2.1 Gga-miR-29b-3p的潛在靶基因GO注釋 GO(Gene Ontology, http://www.geneontology.org/)數(shù)據(jù)庫可以將基因按照其參與的生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分和實(shí)現(xiàn)的分子功能等進(jìn)行分類。分別利用miRDB和TargetScan對(duì)gga-miR-29b-3p的靶基因進(jìn)行生物學(xué)預(yù)測，對(duì)預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行GO注釋(圖2)。結(jié)果顯示gga-miR-29b-3p的預(yù)測靶基因可以參與生物過程(Biological process, BP)中的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽類絲氨酸磷酸化和染色質(zhì)重組過程，細(xì)胞成分(Cellular component, CC)中的細(xì)胞外基質(zhì)、SNARE復(fù)合體和NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，分子功能(Molecular function, MF)中的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、SNAP受體活性和SNARE結(jié)合。

圖2 Gga-miR-29b-3p預(yù)測靶基因的GO和KEGG分析

2.2.2 Gga-miR-29b-3p的潛在靶基因KEGG信號(hào)通路注釋 KEGG庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes 數(shù)據(jù)庫)是系統(tǒng)分析基因功能、聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識(shí)庫。對(duì)gga-miR-29b-3p的預(yù)測靶基因進(jìn)行KEGG通路分析(圖3)。結(jié)果顯示gga-miR-29b-3p的潛在靶基因聚集在FoxO信號(hào)通路、胰島素抵抗、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、ErbB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、甲型流感、VEGF信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路。

圖3 Gga-miR-29b-3p對(duì)MMP2和MMP9表達(dá)的影響

2.3 Gga-miR-29b-3p對(duì)侵襲相關(guān)基因MMP2和MMP9表達(dá)的影響

腫瘤細(xì)胞具有侵襲的特點(diǎn)，進(jìn)一步分析了gga-miR-29b-3p對(duì)MSB1細(xì)胞侵襲的影響。在MSB1中過表達(dá)gga-miR-29b-3p，侵襲相關(guān)基因

MMP2

和

MMP9

的表達(dá)量都發(fā)生顯著性下調(diào)(

P

<0.05)。結(jié)果提示gga-miR-29b-3p可以抑制侵襲相關(guān)基因的表達(dá)(圖4)。

圖4 Gga-miR-29b-3p對(duì)Meq表達(dá)的影響

2.4 Gga-miR-29b-3p對(duì)MDV原癌基因Meq表達(dá)的影響

Meq

基因是MDV中重要的原癌基因，對(duì)于病毒的潛伏存在和維持病毒的致癌性具有重要作用。本項(xiàng)目分析了gga-miR-29b-3p對(duì)于

Meq

基因的表達(dá)水平是否有影響。結(jié)果顯示在MSB1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染該miRNA，過表達(dá)后的48 h，

Meq

基因表達(dá)量顯著下調(diào)(

P

<0.05)，過表達(dá)后的24和72 h，

Meq

表達(dá)量沒有顯著變化。結(jié)果提示gga-miR-29b-3p在一定程度上可以抑制病毒原癌基因的表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

通過高通量測序，研究發(fā)現(xiàn)gga-miR-29b-3p在MD腫瘤化脾臟和肝臟淋巴瘤中的表達(dá)量很低，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的結(jié)果也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。為了進(jìn)一步分析gga-miR-29b-3p在MD腫瘤組織中異常表達(dá)的原因，我們利用在線軟件預(yù)測該miRNA的靶基因，并分析其靶基因參與的生物功能過程和相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)果顯示gga-miR-29b-3p的潛在靶基因涉及的信號(hào)通路大多與細(xì)胞增殖有關(guān)，其中FoxO、mTOR、ErbB和Jak-STAT信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、周期、凋亡和自噬等過程。gga-miR-29b-3p的靶基因或許能通過參與細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)等過程影響MD的腫瘤轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)錄因子FoxO亞族在許多腫瘤疾病中扮演腫瘤抑制因子的角色。FoxO在患有橫紋肌肉瘤、白血病和淋巴瘤等病例中表達(dá)異常，PI3K和MAPK信號(hào)通路能夠使其失活，并且多種腫瘤相關(guān)miRNAs能夠抑制FoxO的表達(dá)。在細(xì)胞凋亡過程中，F(xiàn)oxO激活Fas、TNF、Bcl-XL、bNIP3和Bim等死亡受體配體基因的表達(dá)。在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)能與FoxO結(jié)合的至關(guān)重要的信號(hào)通路是PI3K/AKT/mTOR，F(xiàn)oxO還能與Ras-MEK-ERK、IKK和AMPK信號(hào)通路結(jié)合參與腫瘤發(fā)生。自嗜參與腫瘤與其所處微環(huán)境平衡之間的調(diào)節(jié)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是自嗜的一個(gè)調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，參與間質(zhì)與腫瘤之間的互作，與多種腫瘤發(fā)生和病理發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，腫瘤的基因病變能夠引起mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。mTOR的過度激活會(huì)引發(fā)細(xì)胞增殖和代謝加速，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。ErbB在嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤和腺癌中表達(dá)異常升高，可以作為腫瘤發(fā)生的指示物。Jak-STAT信號(hào)通路通常在腫瘤發(fā)生和遷移進(jìn)程中發(fā)生異常，該通路能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞識(shí)別和腫瘤引發(fā)的免疫逃逸，該通路激活后靶向下游原癌基因、miRNAs和其他共調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮抗腫瘤作用。其中STAT1和STAT2誘導(dǎo)I型、II型干擾素以及下游干擾素的釋放，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，STAT3卻與腫瘤微環(huán)境中的癌細(xì)胞存活、免疫抑制和持續(xù)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。所以該通路是腫瘤發(fā)生的一把“雙刃劍”。在感染MDV的細(xì)胞中，病毒通過激活STAT3蛋白阻斷ATR-Chk1信號(hào)通路，從而利于自身的病毒復(fù)制，引發(fā)DNA損傷。目前，F(xiàn)oxO、mTOR和Jak-STAT信號(hào)通路是許多腫瘤疾病治療方案中比較有效的靶點(diǎn)。原癌基因、生長因子和缺氧能夠引起血管內(nèi)皮生長因子VEGF異常高表達(dá)，而VEGF在腫瘤血管形成中起到關(guān)鍵作用。Toll樣受體已被認(rèn)為是參與腫瘤發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵因素，可以在腫瘤微環(huán)境中重編程細(xì)胞代謝，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞以及腫瘤浸潤的先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞。Toll樣受體配體是制備許多傳統(tǒng)疫苗的佐劑，而且也有研究證明該基因可以提高腫瘤免疫療法的效率。

Fang等針對(duì)Meq附近編碼的miRNA設(shè)計(jì)miRNA sponge，分析其對(duì)MD腫瘤發(fā)生的影響，結(jié)果顯示miRNA sponge能顯著性抑制MSB1細(xì)胞的增殖和侵襲能力。同時(shí)利用SPF雞進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，注射含有MSB1細(xì)胞懸液的雞能夠引發(fā)腫瘤，而注射miRNA sponge不會(huì)誘發(fā)腫瘤，還能緩解MSB1引發(fā)的生長抑制，說明miRNA sponge可作為抑制MD腫瘤發(fā)生的一種小分子，在疾病治療方面具有很大潛力。通過體內(nèi)系統(tǒng)給予miR-29b能顯著抑制腫瘤血管化和腫瘤細(xì)胞活性，從而抑制腫瘤生長并不產(chǎn)生毒性。Perepelyuk等將miR-29b加載到MUC1配體功能化的納米粒子中，能夠提高miR-29b對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。在胃癌細(xì)胞中，miR-29b/c靶向DNMT3a，反之DNMT3a以DNA甲基化依賴性的方式抑制miR-29b/c表達(dá)。而miR-29b/c和DNMT3a下調(diào)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移，這表明miR-29b/c也許能作為胃癌治療的靶點(diǎn)。Gga-miR-29b-3p在感染MDV的腫瘤組織中低表達(dá)，MSB1細(xì)胞是由感染MDV BC-1毒株引發(fā)的脾臟淋巴瘤制備的細(xì)胞系，在該細(xì)胞中過表達(dá)gga-miR-29b-3p顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力，提示這個(gè)miRNA或許在MD發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，可以抑制MD腫瘤轉(zhuǎn)化。侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要特征，

MMP2

和

MMP9

能夠降解IV型膠原蛋白，影響細(xì)胞的侵襲。通過檢測發(fā)現(xiàn)，在MSB1細(xì)胞中，高表達(dá)的gga-miR-29b-3p能夠顯著抑制

MMP2

和

MMP9

的表達(dá)。原癌基因

Meq

在MD腫瘤組織和淋巴瘤來源的T淋巴母細(xì)胞中持續(xù)高表達(dá)。在感染MDV過程中，

Meq

基因在溶細(xì)胞感染和潛伏感染階段表達(dá)。在MSB1細(xì)胞中過表達(dá)gga-miR-29b-3p能夠抑制

Meq

基因的表達(dá)，提示MD腫瘤組織中該miRNA的異常低表達(dá)或許能夠增強(qiáng)病毒的原癌性。綜上所述，作為在MD腫瘤組織中異常低表達(dá)的miRNA，gga-miR-29b-3p或許能通過調(diào)節(jié)潛在靶基因的表達(dá)影響細(xì)胞增殖、周期、凋亡和自嗜，并且該miRNA可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和病毒原癌基因

Meq

的表達(dá)，表明該miRNA的異常表達(dá)可以反映MD的腫瘤轉(zhuǎn)化進(jìn)程。