烏珠穆沁羊不同組織基因組DNA甲基化狀態(tài)的MSAP分析

何小龍，付紹印，李 蓓，祁云霞，王 標，特日格勒，郝晨芳，達 賴，劉永斌*，榮威恒

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

烏珠穆沁羊不同組織基因組DNA甲基化狀態(tài)的MSAP分析

何小龍1，付紹印1，李 蓓2，祁云霞1，王 標1，特日格勒1，郝晨芳1，達 賴1，劉永斌1*，榮威恒1

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

本研究應用甲基敏感擴增片段多態(tài)性方法（MSAP），選用10對選擇性引物分別對5只烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌組織樣品混池DNA中CCGG位點進行了甲基化檢測。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測共獲得條帶1 249條，其中TypeⅡ型條帶154條，TypeⅢ型條帶231條；通過計算不同組織的甲基化率，烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌平均甲基化率為37.58%、39.88%、50.63%、25.82%、20.53%、28.19%、19.21%；在所檢測組織中，脾臟組織的甲基化程度最高，肌肉組織的甲基化程度最低。本研究為進一步了解甲基化在綿羊組織分化過程中所起到的作用奠定了基礎。

烏珠穆沁羊；組織；甲基化；MSAP

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，其原理是哺乳動物基因組在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下，把S-腺苷甲硫氨酸（SSAM）作為甲基供體，將胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpG）的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC）的一種共價修飾反應。這種共價修飾具有表觀遺傳效應和突變效應，進而可導致基因的特異表達、細胞分化和染色質(zhì)失活[1]等，因此DNA甲基化在動物的細胞及組織分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。隨著研究的不斷深入，有學者發(fā)現(xiàn)，家畜不同的發(fā)育階段以及不同的組織中，DNA序列并不發(fā)生改變，而基因的表達具有特定模式，DNA甲基化不僅與基因表達模式有關[2]，而且動物的生長階段和組織特異性與DNA甲基化水平動態(tài)變化也密切相關[3]。

蒙古高原是世界家畜起源地之一，也是現(xiàn)代放牧家畜——牛馬羊駝的馴養(yǎng)中心之一。在蒙古高原上，歷史悠久的蒙古羊系統(tǒng)很少受到外來羊系統(tǒng)的影響而混雜，較好地保持了原有的種質(zhì)特性。烏珠穆沁羊就是在這種特定的自然條件和生態(tài)環(huán)境中經(jīng)歷長期的自然選擇和人工培育而形成的地方優(yōu)良品種，來源于喀爾喀蒙古羊血統(tǒng)，在生產(chǎn)性能方面優(yōu)于一般蒙古羊。本研究選擇烏珠穆沁羊作為研究模式動物，首次應用MSAP方法檢測烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌7個組織基因組DNA甲基化的程度，通過對烏珠穆沁羊不同組織全基因組DNA甲基化的分析，獲得烏珠穆沁羊不同組織全基因組DNA甲基化水平，為進一步了解甲基化在綿羊組織分化過程中所起到的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取相同飼養(yǎng)環(huán)境、體況良好3周歲左右烏珠穆沁羊5只，屠宰后迅速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌組織樣品1 g左右，液氮速凍帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器 TIAN amp Genomic DNA kit 血液/細胞/組織/基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN公司），TMEMD（Coolaber），蛋白酶K、EcoR I、Hpa II、Msp I酶、Mix購自TaKaRa公司，瓊脂糖（Invitrogen），無水碳酸鈉、硝酸銀、甲醛、硫代硫酸鈉、冰乙酸均購自天津市科盟化工工貿(mào)有限公司和國藥集團化學試劑有限公司；分析天平、超凈工作臺、離心機、微型離心機、電泳儀、恒溫培養(yǎng)振蕩器、電熱鼓風干燥器、凝膠成像系統(tǒng)、微量紫外分光光度計等。

1.3 各組織DNA提取及混樣 使用TIAN amp Genomic DNA kit 血液/細胞/組織/基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取5只羊的不同組織DNA，對提取的DNA樣品進行1%瓊脂糖電泳檢測。所有組織DNA提取完成后，分別吸取3 μL每個體的同一組織DNA進行混樣，分別組成心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌7個DNA混樣，置于-20℃冰箱中備用。

1.4 MSAP分析

1.4.1 酶切反應 分別用HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ2種限制性內(nèi)切酶組合進行酶切反應，反應體系為：不同組織混樣基因組DNA 5 μL，10×Tango TM buffer 2 μL，HpaⅡ/MspⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 0.5 μL，ddH2O 12 μL，合計20 μL。每種組織樣品混樣DNA樣品酶切反應做2管，在PCR儀中37℃恒溫1 h。

1.4.2 接頭連接反應 本實驗中所用接頭為：接頭EcoRⅠ：5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'；接頭HpaⅡ/ MspⅠ：5'-GACGATGAGTCTAGAA-3'，3'-CTACTCAGATCTTGC-5'，接頭由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將上下游接頭稀釋100倍之后等體積混勻，再將酶切產(chǎn)物與接頭連接，16℃連接過夜，-20℃保存。連接體系為：酶切產(chǎn)物10 μL，ddH2O 6.5 μL，10×Tango TM buffer 2 μL，HpaⅡ/MspⅠ 0.5 μL，EcoRⅠ 接頭0.5 μL，T4 DNA 連接酶 0.5 μL，合計20 μL。

1.4.3 預擴增反應 將連接產(chǎn)物稀釋10倍，進行預擴增，預擴增引物序列如下：EcoRⅠ 預擴增引物：5'-GACTGCGTACCAATTCA-3'，HpaⅡ/MspⅠ預擴增引物：5'-GATGAGTCTAGAACGGT-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。預擴增體系為：Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，連接產(chǎn)物2 μL，預擴增引物各1 μL，合計20 μL。預擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃ 7 min，30個循環(huán)，4℃保存。

1.4.4 選擇性擴增反應 將預擴增產(chǎn)物10倍稀釋，進行選擇性擴增，選擇性擴增引物見表1。選擇性擴增體系為：Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，預擴增產(chǎn)物2 μL，選擇性擴增上下游引物各1 μL，合計20 μL。選擇性擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s（每個循環(huán)降低0.7℃），72℃ 1 min，13個循環(huán)；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個循環(huán)，72℃ 7 min，4℃保存。反應結束后，取5 μL進行1%瓊脂糖電泳檢測。

1.4.5 PCR產(chǎn)物電泳及銀染 將選擇性擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，檢測條件為：先在200 V條件下預電泳 10 min，再在100V條件下電泳6 h左右。電泳結束后，小心將膠板放入托盤中進行銀染，銀染最后用蒸餾水漂洗膠板兩遍，室溫下自然干燥，拍照保存，統(tǒng)計凝膠上各種模式的片段，用保鮮膜將膠板包裹完整，寫上日期和引物名稱以及點樣順序，放在4℃冰箱中備用。

表1 選擇性擴增引物序列

2 結果與分析

2.1 選擇性擴增結果 分別利用HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ2種限制性內(nèi)切酶組合對每種組織混池DNA基因組進行酶切后，再與接頭進行連接，將連接產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，進行預擴增。以預擴增產(chǎn)物為模板，利用篩選好的10對引物組合，分別對7個組織的混池DNA進行選擇性擴增，并對擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示，由圖1可見，選擇性擴增結果大多集中在100～1 000 bp之間，呈比較均勻的彌散狀，分辨不出明顯的主帶，這也側面反映了接頭連接的效率較高，達到預期的實驗結果。

圖1 DNA選擇性擴增檢測結果

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析 選用10 對引物組合通過MSAP方法對烏珠穆沁羊不同組織的基因組甲基化狀態(tài)進行檢測，不同組織都獲得了清晰的擴增譜帶，每對引物組合擴增片段10～20條，長度在100～1 000 bp之間，大于1 000 bp 的片段比較少，結合聚丙烯酰胺凝膠的分辨率，小于100 bp的條帶一般認為不可取，所以本次實驗主要選取100～500 bp之間的擴增片段進行分析。在同1對引物擴增結果中當1個樣品在甲基化模式上不同于其他樣品時，DNA甲基化就被認為有1個多態(tài)性。部分檢測結果如圖2所示（以E2H2檢測結果為例）。

圖2 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

2.3 烏珠穆沁羊不同組織基因組DNA 甲基化狀態(tài)分析 在MSAP技術中，應用同裂酶HpaⅡ/ EcoRⅠ和MspⅠ/ EcoRⅠ分別對基因組進行雙酶切，同裂酶HpaⅡ和MspⅠ能夠識別并切割CCGG位點，但是對位點中胞嘧啶的甲基化程度的敏感性不同。HpaⅡ可識別內(nèi)部胞嘧啶的甲基化（CmGG），MspⅠ可識別外部胞嘧啶的甲基化（mCCGG），因此通過比較分析MSAP電泳圖譜，可以分析樣品DNA的甲基化狀況。

根據(jù)不同組織DNA在MSAP 電泳圖譜上擴增條帶出現(xiàn)的情況，每個組織基因組甲基化可分為3種模式：TypeⅠ（非甲基化），擴增條帶在H和M 2個泳道同時出現(xiàn)，這種情況CCGG 位點一般沒有發(fā)生甲基化；Type Ⅱ（半甲基化），擴增條帶在H 泳道出現(xiàn)而在M 泳道缺失，這種情況CCGG 位點發(fā)生半甲基化；Type Ⅲ（全甲基化），擴增條帶在M 泳道出現(xiàn)而在H 泳道缺失，這種情況CCGG位點發(fā)生全甲基化，具體分型依據(jù)可見圖3。一個組織基因組的甲基化程度計算公式為Type Ⅱ+TypeⅢ與TypeⅠ+TypeⅡ+TypeⅢ的比值。

圖3 3種甲基化模式

表2 不同組織基因組DNA 甲基化程度比較

本實驗通過10對選擇性引物對5只烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌組織樣品混池DNA中CCGG位點進行了甲基化檢測，通過聚丙烯酰胺電泳檢測共獲得條帶1 249條，其中TypeⅡ型條帶154條，TypeⅢ型條帶231條。通過對不同組織基因組DNA甲基化程度比較，計算其甲基化率。通過計算，心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌的半甲基化水平分別為16.36%、13.50%、18.35%、9.34%、7.89%、12.77%、9.85%；全甲基化水平分別為21.21%、26.38%、32.28%、16.48%、12.63%、15.43%、9.36%；總體的甲基化水平為37.58%、39.88%、50.63%、25.82%、20.53%、28.19%、19.21%（表2）。從各組織DNA甲基化水平來看，在所檢測組織中，脾臟組織的甲基化程度最高，肌肉組織的甲基化程度最低。

3 討 論

由于MSAP方法具有較好的通用性、易操作性和多態(tài)性高、信息豐富的特點，可在全基因組范圍檢測CCGG位點的胞嘧啶甲基化變化情況[4]，因此已廣泛應用于基因的甲基化研究中。Ma等[5]應用MSAP方法對豬的脂肪和肌肉組織的甲基化水平進行檢測，結果表明不同組織的甲基化水平在性別間差異不顯著，而脂肪與肌肉組織的甲基化水平差異顯著。唐紹青等[6]應用MSAP方法檢測了4種哺乳動物（豬、牛、羊、小鼠）和2種家禽（雞和鴨）不同組織基因組的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)不同動物相同組織基因組的甲基化程度不同，相同動物不同組織基因組的甲基化模式具有特異性；同一種動物，組織基因組的甲基化程度一般都高于血液基因組，哺乳動物與禽類基因組甲基化程度差別不大。蔣曹德[7]用MSAP的方法檢測了2個純種和2個雜交F1代豬群體的血液和肌肉組織DNA甲基化水平，檢測結果表明4個群體的甲基化水平在10.2%～10.5%之間，整體上甲基化差異不顯著，3種甲基化差異類型均與雜種一代表現(xiàn)顯著相關。李金龍等[8]應用MSAP的方法檢測北京油雞肌肉和卵巢組織的基因組DNA甲基化模式和程度，通過檢測肌肉組織的甲基化水平為35.86%，卵巢組織為31.50%，2種組織的甲基化水平差異顯著。與體重相關性進行分析表明，肌肉組織的甲基化狀態(tài)對北京油雞的體重具有重要作用。徐青等[9]應用MSAP的方法檢測了白洛克肉雞和白來航蛋雞及其雜交F1 代的肌肉、心臟、肝臟和腎臟4個不同組織基因組在CCGG位點的甲基化狀態(tài)，通過檢測發(fā)現(xiàn)，其肌肉、心臟、肝臟和腎臟組織的甲基化水平約為29.7%、27.5%、27.5%和26.1%，研究結果表明雞不同組織基因組的甲基化狀態(tài)是不同的，同一組織的甲基化水平在不同的群體是不同的，而不同組織甲基化水平的排序在不同的群體也不一致。肖正中等[10]應用MSAP技術對6頭長白公豬、50頭藍塘母豬及長×藍51頭雜交F1代3個群體共107個個體耳組織基因組DNA胞嘧啶甲基化模式和程度進行評估，父母代及其雜交F1代3個群體基因組DNA甲基化總體水平分別是27.7%、27.8%和25.1%，結果提示豬基因組甲基化多態(tài)性豐富，雜種F1代與其父母代之間的基因組甲基化水平存在差異。

本研究通過10對選擇性引物對烏珠穆沁羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃和背最長肌組織樣品混池DNA中CCGG位點進行了甲基化檢測，得出上述各組織的甲基化水平分別為37.58%、39.88%、50.63%、25.82%、20.53%、28.19%、19.21%，脾臟組織的甲基化程度最高，肌肉組織的甲基化程度最低；在檢測的所有組織中，各組織間的半甲基化率和全甲基化率差異較大，進而導致不同組織間的甲基化率及甲基化模式不同。另外本研究中所獲得的總條帶數(shù)較少，推測與本研究的樣本量少及DNA混池法有關。雖然MSAP技術具有一定的局限性，只能檢測全基因組范圍內(nèi)的CCGG位點的甲基化變化，對其他位點的甲基化不能檢出，但是在真核生物中，90%甲基化存在于CG序列中，所以多數(shù)研究人員認為CCGG位點的胞嘧啶甲基化比例能夠客觀反映基因組DNA甲基化修飾水平。因此，本研究也客觀地反映出烏珠穆沁羊不同組織的甲基化狀況，下一步將選擇甲基化程度最高的脾臟組織進行差異甲基化片段的回收與鑒定，通過生物信息學的分析找出差異甲基化基因，分析這些基因在組織分化過程中的調(diào)控作用。

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Analysis of DNA Methylation in Dif f erent Ujumqin Sheep Tissues with MSAP

HE Xiao-long1, FU Shao-yin1, LI Bei2, QI Yun-xia1, WANG Biao1, TE Ri-Ge-Le1, HAO Chen-fang1, DA Lai1, LIU Yong-Bin1*, RONG Wei-heng1
(1. Inner Mongolia Academy oAgricultural & Animal Husbandry Sciences, Inner Mongolia Hohhot 010031, China; 2. College oAnimal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Hohhot 010018, China)

The CCGG sites in genomes were detected among heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach and longissimus muscle o5 Ujumqin sheepor 10 pairs oselective primers by methylation sensitive amplied polymorphism (MSAP) method. A total o1249 DNAragments were detected by the polyacrylamide gel electrophoresis, including 154 type Ⅱand 231 type Ⅲragments. Through calculation the methylation rates odierent tissuesor Ujumqin sheep, the average methylation rate oheart, liver, spleen, lung, kidney, stomach and longissimus muscle was 37.58%, 39.88%, 50.63%, 25.82%, 20.53%, 28.19%, 19.21% respectively. For the all detected tissues, the spleen tissue methylation degree was The highest and the muscle tissue was the lowest. This study laid theoundationorurther understanding othe role oDNA methylation regulatory eector the sheep tissue dierentiation.

Ujumqin Sheep; Tissue; Methylation; MSAP

S826.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-035

2016-11-01；

2016-12-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院青年創(chuàng)新基金(2013QNJJ M01)；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-39）；內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院創(chuàng)新基金（2015CXJJM02）；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才建設項目

何小龍（1983-），男，陜西眉縣人，博士，副研究員，主要從事生物技術與草食家畜育種研究，E-mail: hexiaolong1983@163.com

* 通訊作者：劉永斌，博士，研究員，研究方向為家畜育種與生產(chǎn)，E-mail:ybliu117@126.com