玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉IAA的測(cè)定及其發(fā)酵液對(duì)煙草的影響

張燁 楊雅雯

吲哚乙酸（IAA）是生長(zhǎng)素中最為普遍的一種，是在植物體內(nèi)自然合成、能促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)的微量高效有機(jī)物，屬于農(nóng)藥范疇，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。IAA具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，使細(xì)胞的體積和質(zhì)量增加、促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化、調(diào)節(jié)生根等生理功能。植物體中的IAA主要來(lái)自兩方面：通過(guò)色氨酸和非色氨酸前體的生物合成以及IAA結(jié)合物的水解。而微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的IAA主要來(lái)自于色氨酸合成途徑和非色氨酸合成途徑。利用IAA產(chǎn)生菌作為微生物肥料具有重要的生產(chǎn)意義。鏈霉菌隸屬于原核生物界、放線菌目（Actinobacterales）鏈霉菌科（Streptomycetaceae），是具有非常復(fù)雜生命周期的革蘭氏陽(yáng)性菌。鏈霉菌以菌絲體的形式定殖于多種植物體的根、莖、葉等部位而發(fā)揮功能。鏈霉菌屬也是一類重要的生防菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅能產(chǎn)生各種抗生素，而且能產(chǎn)生植物激素類物質(zhì) 。目前，已知的鏈霉菌產(chǎn)生的9000多種具有生物活性的物質(zhì)中，超過(guò)120多種物質(zhì)得到了應(yīng)用，占微生物來(lái)源的生物活性物質(zhì)應(yīng)用品種數(shù)量的75%。目前已知抗生素種類有16 500種，其中51%是由鏈霉菌產(chǎn)生。鏈霉菌分泌的農(nóng)用抗生素作為低毒、低殘留的生物農(nóng)藥逐步受到關(guān)注。近年，關(guān)于玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）的報(bào)道大多數(shù)也是農(nóng)用抗生素的挖掘及其防病機(jī)制的研究，而對(duì)于微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑開(kāi)發(fā)的報(bào)道較為少見(jiàn)，因此我們期望能夠通過(guò)分離提取玫瑰黃鏈霉菌菌株代謝產(chǎn)生的IAA來(lái)開(kāi)發(fā)微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。木霉菌（Trichodermaspp）隸屬于半知菌（Deuteromycotina）亞門(mén)、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetales）、從梗孢科（Moniliaceae），是世界分布性真菌。近年來(lái)，木霉菌在工業(yè)、制藥業(yè)、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)等方面都有廣泛應(yīng)用，是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生防菌。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多具有重要價(jià)值的木霉菌，主要包括黃綠木霉（T.aureovirde）、綠色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）等。哈茨木霉（T. harzianum）也屬于木霉屬的真菌，普遍存在于自然界中，其能夠有效的防治鐮刀菌（Fusarium）、腐霉菌（Pythium）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等引起的植物白絹病、疫霉病、幼苗枯病等，是多種植物病原菌的拮抗菌和寄生菌，已作為生防制劑廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

我國(guó)是一個(gè)煙草大國(guó)，煙草業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。自20世紀(jì)50年代末期，我國(guó)烤煙品質(zhì)有所下降，主要表現(xiàn)是煙葉薄、油潤(rùn)差、香氣不足、盡頭小等。鏈霉菌和哈茨木霉在煙草上的應(yīng)用有很多，鏈霉菌可抑制煙草上的多種病原菌，如炭疽病原菌、赤星病菌（Alternaria alternata）、花葉病毒等，哈茨木霉生防菌不僅可防治多種煙草上的病害，也對(duì)煙草的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。煙草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)是烤煙優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培的基礎(chǔ)，提高種子萌發(fā)率，增強(qiáng)幼苗生長(zhǎng)能力對(duì)提高煙葉質(zhì)量意義重大。本文研究玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）和哈茨木霉（T. harzianum）菌株發(fā)酵液對(duì)煙草種子萌發(fā)和煙苗生長(zhǎng)的作用，可為煙草生產(chǎn)中利用生防菌劑及生物菌肥提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

供試菌株玫瑰黃鏈霉菌、哈茨木霉由河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。供試煙草品種為L(zhǎng)Y1306，由河南省煙草公司洛陽(yáng)市分公司提供。培養(yǎng)基為大豆酵母培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

（二）方法

1.菌株發(fā)酵液的制備。將保存的玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉菌株分別接種在高氏1號(hào)培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃下分別培養(yǎng)4～5 d、5 d，用打孔器分別在分離純化培養(yǎng)的玫瑰黃鏈霉菌、哈茨木霉菌菌落邊緣打孔，制成菌餅。每100 mL大豆酵母培養(yǎng)基接入5個(gè)玫瑰黃鏈霉菌菌餅，每100 mL真菌液體培養(yǎng)基打入3～4個(gè)哈茨木霉菌餅。均置28℃恒溫培養(yǎng)箱180 r/min下振蕩培養(yǎng)4～5 d，進(jìn)行種子初步擴(kuò)繁，制備搖瓶種子液。分別取4%種子液接種于100 mL大豆酵母液體培養(yǎng)基、真菌液體培養(yǎng)基中，另按1%接種量需要加入500 μL色氨酸標(biāo)準(zhǔn)值，在每100 mL大豆酵母液體培養(yǎng)基、真菌液體培養(yǎng)基中分別加入2 mL色氨酸，28 ℃下220 r/min分別搖培7 d、5～6 d，得到待測(cè)菌株發(fā)酵液。

2.菌株發(fā)酵液中IAA的測(cè)定。

（1）制作IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0.05g的IAA標(biāo)準(zhǔn)品，用50 mL容量瓶定容成1000 mg/L母液。分別取250 mL、500 mL、750 mL、1000 mL、1250 mL母液配成10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L工作液。上述溶液分別取2.5 mL加入等體積Salkowski比色液，用5 mL容量瓶定容。室溫避光靜置30 min后取出立即用分光光度計(jì)測(cè)定其OD535值，以加入了比色液的培養(yǎng)基調(diào)零，重復(fù)3次。以IAA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）IAA定性檢測(cè)。取1mL懸浮菌液8000 r/min離心5 min，取100 μL上清液滴于白色陶瓷板中并與等體積的Salkowski比色劑混合進(jìn)行顯色反應(yīng)。同時(shí)以50 mg/L的IAA標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL為陽(yáng)性對(duì)照，以不加菌的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。室溫避光放置30 min，觀察顏色變化，顏色變?yōu)榉奂t色表示有IAA產(chǎn)生。

（3）IAA定量檢測(cè)。取菌株發(fā)酵液10 mL，8000 r/min離心5 min。取5 mL上清液等體積加入Salkowski比色液，用10 mL容量瓶定容。以未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基與Salkowski比色液等體積混合作對(duì)照。室溫避光靜置30 min，測(cè)定OD535值，根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中IAA的含量。

3.菌株發(fā)酵液促生效果的測(cè)定。

（1）處理液的制備。制備的菌株發(fā)酵液與無(wú)菌水混合，配制成10%、20%、30%、40%、50%和60%不同濃度梯度，分別裝在三角瓶中，在4℃冰箱中保存。

（2）煙草種子的處理。選取大小均一的種子，先用70%酒精和1%次氯酸鈉分別處理5 min、1 min，再用無(wú)菌水沖洗3次。種子干燥后放在不同濃度的菌株發(fā)酵液中浸泡12 h，無(wú)菌水作對(duì)照（CK）。浸泡后的種子晾干后均勻置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（加相應(yīng)處理液5 mL）中，置25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后定時(shí)統(tǒng)一補(bǔ)加處理液。每處理50粒種子。重復(fù)3次。注意保持發(fā)芽試驗(yàn)過(guò)程中的足夠水分，種子四周的相對(duì)濕度應(yīng)在90%～95%。

（3）煙草種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的測(cè)定。種子分別處理7 d、14 d后記錄發(fā)芽數(shù)，以胚根伸出與種子等長(zhǎng)時(shí)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)芽勢(shì)（%）=（7 d內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/受檢種子數(shù)）×100，發(fā)芽率（%）=（14 d內(nèi)全部發(fā)芽種子粒數(shù)/受檢種子數(shù)）×100。

（4）菌株對(duì)煙苗生長(zhǎng)的影響。選取大小均勻一致的種子播種，生長(zhǎng)25 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)和葉片大小相對(duì)一致的煙苗栽在裝有基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)（基質(zhì)填滿缽高的2/3，基質(zhì)成分是土壤與草炭土，比例為1：1），

每缽1株。放在一個(gè)育苗盤(pán)中的12株煙苗分別用玫瑰黃鏈霉菌菌株、哈茨木霉菌株發(fā)酵液澆灌，每缽澆10 mL;9株煙苗用自來(lái)水澆灌作對(duì)照，每缽澆10 mL。育苗盤(pán)在開(kāi)始處理時(shí)澆上水，水的高度為1～2 cm。處理后的煙苗其生長(zhǎng)需在室溫且相對(duì)濕度90%～100%育苗室中進(jìn)行。處理后的煙苗在營(yíng)養(yǎng)缽中培育14d后測(cè)定其新生并展開(kāi)的兩片葉（正一葉、正二葉）的長(zhǎng)度（葉尖到莖基部）和葉寬（葉片最寬處）。在煙苗生長(zhǎng)過(guò)程中要定期在育苗盤(pán)中澆水，控制其外部生長(zhǎng)條件的一致，且要及時(shí)清除一些爛葉和雜葉。在育苗室定期交換煙苗位置，使每一株煙苗所接受的光照是均勻和充分的。

二、結(jié)果與分析

（一）IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)Salkowski比色試驗(yàn)，確定了玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉代謝的過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA），以吸光值OD535為縱坐標(biāo)（y），IAA的濃度為橫坐標(biāo)（x）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），并得到線性回歸方程y=0.043 1x-0.366 6，R2=0.997 7。

（二）菌株發(fā)酵液中IAA的含量

根據(jù)所制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到玫瑰黃鏈霉菌基礎(chǔ)發(fā)酵液中IAA的含量是9.60 mg/L，哈次木霉基礎(chǔ)發(fā)酵液中IAA的含量是12.03 mg/L（表1）。

（三）菌株發(fā)酵液的促生效果

1.玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液對(duì)煙草的促生效果。由表2可看出，玫瑰黃鏈霉菌菌株發(fā)酵液濃度在10%～60%時(shí)的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都高于或等于CK，但濃度大于40%時(shí)其整體煙草種子的發(fā)芽勢(shì)是趨于下降的，而發(fā)芽率和對(duì)照的持平。表明玫瑰黃鏈霉菌菌株發(fā)酵液具有促生能力。菌液對(duì)煙草種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最顯著的濃度是20%和30%，在菌液濃度大于40%時(shí)其促生作用減弱。說(shuō)明較高濃度的菌株發(fā)酵液會(huì)表現(xiàn)出對(duì)煙草種子萌發(fā)的抑制作用。

2.哈茨木霉發(fā)酵液對(duì)煙草的促生效果。從表3可知，菌液濃度10%～40%時(shí)的煙草種子發(fā)芽勢(shì)都高于CK，但濃度在50%和60%時(shí)煙草種子的發(fā)芽勢(shì)低于CK。菌液濃度在10%～60%時(shí)的煙草種子發(fā)芽率都高于CK，但濃度大于30%時(shí)發(fā)芽率是逐漸下降的。表明哈茨木霉菌株發(fā)酵液對(duì)煙草種子的發(fā)芽具有促進(jìn)作用，促進(jìn)作用在菌液濃度為30%時(shí)最為顯著。

3.在一定濃度下的玫瑰黃鏈霉菌、哈茨木霉菌株發(fā)酵液對(duì)煙草種子的發(fā)芽有促進(jìn)作用，而高濃度對(duì)煙草種子的發(fā)芽表現(xiàn)出現(xiàn)抑制作用。

（四）菌株發(fā)酵液對(duì)煙苗生長(zhǎng)的影響

從表4可以看出，對(duì)照組煙苗在14 d內(nèi)的長(zhǎng)勢(shì)均較好，正一葉的平均長(zhǎng)度都在12.8 cm、寬度6.7 cm，正二葉的平均長(zhǎng)度接7.6 cm，寬度接近4 cm。用玫瑰黃鏈霉菌菌株發(fā)酵液處理后的煙苗葉片大于對(duì)照組的正一葉的長(zhǎng)度和寬度，但是這種促進(jìn)作用在煙苗14 d的生長(zhǎng)期內(nèi)表現(xiàn)的不是特別顯著。用哈茨木霉菌株發(fā)酵液處理的煙苗正一葉和正二葉的長(zhǎng)度和寬度均小于對(duì)照組的，表明哈茨木霉菌株發(fā)酵液在此用量下對(duì)煙苗生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)進(jìn)用，甚至?xí)?duì)煙苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制的作用。

三、結(jié)論

玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉發(fā)酵液IAA的產(chǎn)量分別為9.60 mg/L、12.03 mg/L。玫瑰黃鏈霉菌培養(yǎng)液濃度在20%和30%時(shí)對(duì)煙草促生作用較為明顯，大于40%對(duì)煙草種子萌發(fā)有抑制作用;哈茨木霉培養(yǎng)液濃度在30%時(shí)對(duì)煙草促生作用最為明顯，大于30%時(shí)對(duì)種子萌發(fā)有抑制作用。兩種菌的發(fā)酵液處理煙苗14 d后，經(jīng)玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液處理的煙苗正一葉的長(zhǎng)度與寬度大于對(duì)照，在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)煙苗生長(zhǎng)具有一定的促生作用;哈茨木霉菌株發(fā)酵液處理的煙苗正一葉和正二葉的葉片長(zhǎng)度和寬度接近甚至小于對(duì)照，在濃度范圍內(nèi)對(duì)煙苗生長(zhǎng)幾乎無(wú)促生作用。