基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從鐵死亡途徑研究補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中的作用機(jī)制

趙馮巖 楊浩瀾 朱炎貞 林美妤 劉芳

〔摘要〕 目的 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究補(bǔ)陽還五湯經(jīng)由鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的作用機(jī)制。方法 通過TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫完成補(bǔ)陽還五湯處方中各藥物的化學(xué)成分、靶點基因及其相應(yīng)對接得分的收集，采用KEGG、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取疾病相關(guān)靶點;采用Cytoscape 3.6.1獲取補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中鐵死亡途徑的作用候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并對該圖進(jìn)行模塊分析和二次篩選;KOBAS 3.0對候選靶點與模塊基因進(jìn)行KEGG通路富集;采用Western blot技術(shù)檢測PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)。結(jié)果 共得到補(bǔ)陽還五湯主要活性成分10個，綜合文獻(xiàn)分析得缺血性腦卒中鐵死亡途徑關(guān)鍵靶點3個，主要KEGG通路7條。驗證實驗結(jié)果提示補(bǔ)陽還五湯通過PI3K-Akt-mTOR信號通路對氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中鐵死亡途徑可能與HSP90AA1、EGFR、GRB2等靶點及MAPK、PI3K-Akt等信號通路有關(guān)，其中HSP90AA1靶點和PI3K-Akt信號通路可能是關(guān)鍵機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 鐵死亡;補(bǔ)陽還五湯;缺血性腦卒中;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

〔中圖分類號〕R255.2 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.016

〔Abstract〕 Objective To use network pharmacology to explore the mechanism of Buyang Huanwu Decoction regulating ischemic stroke through ferroptosis. Methods The chemical components， target genes of Buyang Huanwu Decoction and their corresponding docking scores were collected by TCMSP database or PharmMapper database， and the disease-related targets were obtained through KEGG and GeneCards database; the Cytoscape 3.6.1 software was used to get the network map of candidate targets of Buyang Huanwu Decoction effect on cerebral ischemic stroke by ferroptosis pathway， and the network map of candidate targets was screened twice and MCODE analysis subsquently; the candidate targets and module genes were enriched by KEGG pathway in KOBAS 3.0. Western blot were used to detect the expression of p-PI3K， PI3K， p-Akt， Akt， p-mTOR and mTOR protein in PC12 cells model with oxidative stress injury. Results There were 10 potential active ingredients in Buyang Huanwu Decoction， and 3 key targets and 7 main KEGG pathways in cerebral ischemic stroke by ferroptosis based on the literature analysis. And the validation experiment confirmed that Buyang Huanwu Decoction can protect oxidative stress induced PC12 cells injure via PI3K-Akt-mTOR signal pathway. Conclusion Buyang Huanwu Decoction in regulating cerebral ischemic stroke by ferroptosis may be related to HSP90AA1， EGFR， GRB2 and other signal pathways such as MAPK and PI3K-Akt. Among which the HSP90AA1 and PI3K-Akt signaling pathway may be one of the most crucial mechanisms.

〔Keywords〕 ferroptosis; Buyang Huanwu Decoction; cerebral ischemic stroke; network pharmacology

缺血性腦卒中是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，指突發(fā)的腦組織局部供血不足或血流完全中斷，使該局部腦組織崩解破壞，進(jìn)而產(chǎn)生局部或全腦神經(jīng)功能障礙的一種腦血管疾病。補(bǔ)陽還五湯出自《醫(yī)林改錯》[1]，以氣虛血瘀立論，由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、桃仁、川芎、紅花組合成方，是治療缺血性腦卒中的經(jīng)典名方，現(xiàn)代臨床應(yīng)用也頗為廣泛[2?，F(xiàn)代藥理研究[3-4]表明，補(bǔ)陽還五湯具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量、抗炎、抗缺氧、改善微循環(huán)以及抗血栓等作用，可通過增加血管內(nèi)皮生長因子陽性細(xì)胞數(shù)量、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗感染、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶等多種途徑來防治缺血性腦卒中。但由于中藥復(fù)方多成分、多靶點的特點，補(bǔ)陽還五湯防治缺血性腦卒中的機(jī)制尚不完善。

鐵死亡是一種具有鐵依賴性的新型細(xì)胞程序性死亡方式，由細(xì)胞內(nèi)異常鐵代謝導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化物和活性氧堆積引起的調(diào)節(jié)性的細(xì)胞死亡[5]。缺血性腦卒中發(fā)生時，神經(jīng)元內(nèi)鐵離子聚集導(dǎo)致鐵超載，鐵離子通過Fenton反應(yīng)造成ROS聚集，并且在小鼠缺血性中風(fēng)動物模型中谷胱甘肽（GSH）水平顯著降低，脂質(zhì)過氧化增加[6]，表明鐵死亡亦為缺血性腦卒中病理生理進(jìn)程中神經(jīng)元死亡的一種方式。鐵死亡抑制劑和鐵螯合劑能夠有效減輕缺血性腦卒發(fā)生時神經(jīng)元的損傷，提示鐵死亡途徑中存在調(diào)控缺血性腦卒中的潛在靶點[7-9]。然補(bǔ)陽還五湯能否通過調(diào)控鐵死亡途徑進(jìn)而發(fā)揮藥效尚無研究報道，在已有的中藥復(fù)方經(jīng)鐵死亡調(diào)控腦缺血的研究報道中，僅葛金文團(tuán)隊[10-11]發(fā)現(xiàn)腦泰方（黃芪、川芎、地龍、僵蠶）及其提取物能通過影響鐵死亡的發(fā)生，從而發(fā)揮抗缺血性腦卒中的作用，本課題組在預(yù)實驗中亦發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯對大腦中動脈栓塞模型大鼠海馬中谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）這一鐵死亡關(guān)鍵生物標(biāo)志物具有調(diào)控作用，為保證后續(xù)從鐵死亡途徑開展補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中實驗研究設(shè)計方案合理可行，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，全面系統(tǒng)挖掘補(bǔ)陽還五湯經(jīng)由鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的作用機(jī)制并為闡明補(bǔ)陽還五湯調(diào)控腦缺血的作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 ?藥物

參照前期研究[12]將補(bǔ)陽還五湯原方（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g）和精方（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g）提取制備成干浸膏，使用時用無菌PBS稀釋至適當(dāng)濃度，經(jīng)0.25 ？滋m濾膜過濾除菌。

1.2 ?主要試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系（PC12細(xì)胞）購自長沙科文生物科技有限公司。HRP標(biāo)記山羊抗兔（貨號：GB23303）、HRP標(biāo)記驢抗山羊（貨號：GB23404）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠（貨號：GB23301）、HRP標(biāo)記山羊抗大鼠（貨號：GB23302）、β-actin（鼠源，貨號：GB12001）、Akt（兔源，貨號：GB11689）、p-Akt（兔源，貨號：GB13459）、p-PI3K（兔源，貨號：GB13471）、p-mTOR（兔源，貨號：GB13460）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;mTOR（兔源，貨號：2983）購自美國CST公司;PI3K（鼠源，貨號：BSM-33219M）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;PI3K（貨號：ab151549）、mTOR（貨號：ab2732）均購自英國Abcam公司;Akt（貨號：4691s）購自美國Sigma公司;Akt抑制劑（貨號：HY-10249a）購自MedChemExpress公司。

1.3 ?主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司，型號：3111）;化學(xué)發(fā)光成像儀（美國Cytiva公司，型號：GEAI600）。

2 方法

2.1 ?補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分及成分靶點的收集

在TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（https：//tcmsp-e.com/）分別以“黃芪”“紅花”“當(dāng)歸”“川芎”“赤芍”“地龍”“桃仁”為關(guān)鍵詞搜索化學(xué)成分，以口服利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性（drug like， DL）≥0.18為篩選條件，篩得主要活性化合物并下載其mol2文件，將其代入PharmMapper反向藥效團(tuán)匹配數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）進(jìn)行預(yù)測。整合所有化合物靶點后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將靶點的UniProtKB AC/ID轉(zhuǎn)換為Gene name。

2.2 ?缺血性腦卒中疾病及鐵死亡靶點的收集

分別以cerebral ischemic stroke、cerebral infarction和Ferroptosis為關(guān)鍵詞在基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）（https：//www.kegg.jp/）以及人類基因注釋數(shù)據(jù)庫（GeneCards）（www.genecards.org）中進(jìn)行檢索，獲取缺血性腦卒中疾病及鐵死亡相關(guān)靶點。

2.3 ?藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及模塊分析

采用Cytoscape 3.6.1軟件分別構(gòu)建成分靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)、疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)、成分靶點與疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，同時，選擇Bisogenet插件，將方法設(shè)置為“Input nodes and its neighbors”，參數(shù)為1，輸出方式為基因，在構(gòu)建成分靶點與疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)時，將方法改為“Input nodes only”，其余不變。通過Merge功能將以上3個網(wǎng)絡(luò)合并，取交集部分，分別獲得補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中及鐵死亡的兩個候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖。再將這兩個網(wǎng)絡(luò)圖合并，得到補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖，通過MCODE插件對合并所得候選靶點進(jìn)行模塊分析，得到藥材-模塊基因網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入藥材及其成分信息構(gòu)建藥材-成分-候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖，對藥材-模塊基因網(wǎng)絡(luò)圖和藥材-成分-候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行點度中心性（degree centrality， DC）分析以評估藥材對各模塊基因的作用強(qiáng)度，并篩選出DC前10位的活性成分。

2.4 ?關(guān)鍵靶點的篩選

采用Cytoscape 3.6.1軟件中的CentiScaPe2.2插件對補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的候選靶點進(jìn)行再次篩選，以獲取其關(guān)鍵靶點，以DC、接近中心性（closeness centrality， CC）和中介中心性（betweenness centrality， BC）作為度量節(jié)點重要性的指標(biāo)，去除孤立靶點后，最終獲得DC、CC、BC均位于前10位的靶點作為補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的核心靶點。

2.5 ?通路整合與分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）將所有候選靶點及模塊的Gene name轉(zhuǎn)換為Entrez Gene ID，分別導(dǎo)入KOBAS 3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行KEGG通路注釋分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入OmicShare tools（http：//www.omicshare.com/tools）生成KEGG動態(tài)富集氣泡圖。

2.6 ?Western blot法檢測PC12細(xì)胞中PI3K、Akt和mTOR蛋白的表達(dá)

參照前期結(jié)果[13]，以0.5 mmol·L-1 H2O2處理PC12細(xì)胞2 h制備氧化應(yīng)激損傷模型，2.0 mg·mL-1的補(bǔ)陽還五湯原方和精方提取物均具有一定程度保護(hù)作用，采用20 nmol Akt抑制劑與細(xì)胞共同培育10 h制備通路干預(yù)模型組，初步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果。將PC12細(xì)胞分成7組，分別為正常組、氧化應(yīng)激損傷模型組、Akt抑制劑組、補(bǔ)陽還五湯原方（BYYF）組、補(bǔ)陽還五湯精方（BYJF）組、Akt抑制劑+BYYF組、Akt抑制劑+BYJF組，檢測細(xì)胞中PI3K、Akt和mTOR蛋白的表達(dá)水平。將PC12細(xì)胞以1×107的密度接種于6孔板中，細(xì)胞分組處理后，加入RIPA裂解液收集細(xì)胞離心，收集上清混合于SDS上樣緩沖液中，20 ℃保存?zhèn)溆?。取蛋白樣?5 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，恒壓60 V轉(zhuǎn)30 min，然后120 V轉(zhuǎn)90 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜上恒壓100 V轉(zhuǎn)膜，封閉后分別與一抗（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的稀釋比例均為1∶1 000，β-actin的稀釋比例為1∶1 500）4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）37 ℃孵育1 h。滴加ECL顯影液暗反應(yīng)后用發(fā)光成像儀拍照。采用Image J測定蛋白條帶的灰密度值，以β-actin為內(nèi)參照，以目的條帶IOD值與β-actin條帶IOD值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

2.7 ?統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均經(jīng)過方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗，以“x±s”表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?補(bǔ)陽還五湯中主要化學(xué)成分及其靶點收集

由TCMSP數(shù)據(jù)庫收集得到補(bǔ)陽還五湯主要活性成分106個，其中黃芪20個、當(dāng)歸4個、赤芍29個、川芎8個、桃仁23個、紅花22個。該平臺未收錄“地龍”相關(guān)化合物，且黃芪甲苷、赤芍苷等化合物也并不滿足OB值與DL值的篩選條件，經(jīng)文獻(xiàn)查找[14-17]，黃芪甲苷、赤芍苷等化合物均為補(bǔ)陽還五湯中的有效成分，故補(bǔ)充地龍及其他藥材的有效化合物共20個。將這126個化學(xué)成分導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測，去除無靶點者共得2 802個靶點，其中黃芪452個、當(dāng)歸225個、赤芍458個、川芎445個、桃仁451個、紅花462個、地龍308個。

3.2 ?疾病靶點收集

以“cerebral ischemic stroke”等關(guān)鍵詞在KEGG數(shù)據(jù)庫及GeneCards數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲得缺血性腦卒中直接靶點2 681個，鐵死亡直接靶點105個。通過Bisogenet 插件擴(kuò)展缺血性腦卒中相關(guān)靶點至14 920個，鐵死亡相關(guān)靶點4 614個。

3.3 ?藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果及模塊分析

合并補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中及鐵死亡的兩個候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共得節(jié)點262個，即補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的候選蛋白共262個，得到補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的候選靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1），該過程中各個網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表1，藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的DC分析所得主要活性成分見表2。補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中時呈現(xiàn)出較為豐富的靶點，而其在調(diào)控鐵死亡途徑時僅284個候選靶點，合并兩個靶點網(wǎng)絡(luò)圖后節(jié)點數(shù)為262個，在該方作用于鐵死亡途徑的靶點中占比高達(dá)92.25%，在補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中的所有候選靶點（2 424個）中占比達(dá)到10.8%，證實鐵死亡途徑對補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中具有重要作用。

基于補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中候選靶點進(jìn)行的模塊分析結(jié)果見表3，得到各個模塊的基因均為直接或間接作用與鐵死亡及缺血性腦卒中的相關(guān)靶點。其中，模塊1中各個藥材的DC之和為2 376，明顯高于其他5個模塊，提示模塊1受到各味藥材的作用可能最為顯著。從補(bǔ)陽還五湯配伍特點與其臨床藥理作用相結(jié)合的角度出發(fā)，進(jìn)一步研究補(bǔ)陽還五湯中的藥材對不同信號通路模塊的調(diào)控作用。見圖2。

3.4 ?關(guān)鍵靶點獲取

將DC、CC、BC均位于前10位的7個靶點作為補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的核心靶點，它們依次是熱休克蛋白90α編碼基因（HSP90AA1）、表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤蛋白P53（TP53）、生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）、類固醇受體共激活子（SRC）、雌激素受體1（ESR1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白1（AKT1）。整理基F

PharmMapper數(shù)據(jù)庫的匹配結(jié)果，可得七味藥分別作用于核心靶點的化合物數(shù)目及其化合物在進(jìn)行反向藥效團(tuán)預(yù)測時最高的對接得分。見表4。

3.5 ?關(guān)鍵通路獲取

KEGG富集結(jié)果中，MAPK信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路、Estrogen信號通路、VEGF信號通路和HIF-1信號通路被顯著富集，其中鐵死亡的Rich Factor得分高達(dá)0.4，明顯高于其他通路，證明篩選所得候選靶點與鐵死亡途徑有著密切聯(lián)系，結(jié)果見圖3。

3.6 ?補(bǔ)陽還五湯對PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型PI3K、Akt和mTOR蛋白的影響

PC12細(xì)胞中PI3K、Akt和mTOR蛋白的定量分析結(jié)果見圖4。相較于正常組，氧化應(yīng)激損傷模型細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的比值顯著降低（P<0.05），提示細(xì)胞在氧化應(yīng)激損傷過程中PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化程度降低，該通路被抑制，Akt抑制劑組亦下調(diào)了PC12中3種蛋白的磷酸化（P<0.05）;相較模型組，BYYF或BYJF干預(yù)后，PI3K-Akt-mTOR信號通路被顯著激活，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的比值顯著上調(diào)（P<0.05），而Akt抑制劑+BYYF或BYJF干預(yù)處理的P12細(xì)胞中3種蛋白的磷酸化程度被明顯抑制（P<0.05），證實補(bǔ)陽還五湯可能通過PI3K-Akt-mTOR信號通路對氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

4 討論

目前，缺血性腦卒中有效治療方法十分有限，且現(xiàn)有治療方法都有嚴(yán)格的適應(yīng)癥和一定的風(fēng)險，迫切需要開發(fā)新的治療方法。中醫(yī)藥“多成分、多途徑、多靶點”協(xié)同作用的特點用于缺血性腦卒中的防治獨具優(yōu)勢，如腦泰方、補(bǔ)陽還五湯等中藥方劑均對缺血性腦卒中的防治具有確切療效。為闡明補(bǔ)陽還五湯調(diào)控缺血性腦卒中的具體機(jī)制，故本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對補(bǔ)陽還五湯有效成分和作用機(jī)制進(jìn)行了綜合分析。而現(xiàn)有網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，大都集中在藥物治療疾病方面，如韓根利等[18]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討三七合劑干預(yù)肝缺血再灌注損傷機(jī)制，陳紀(jì)燁等[19]運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行了五苓散治療慢性心力衰竭的機(jī)制研究，這些研究均是直接將藥物靶點與疾病靶點相結(jié)合以得到結(jié)果。針對這一現(xiàn)狀，本研究瞄準(zhǔn)一條細(xì)胞死亡途徑，將藥物成分靶點分別與疾病靶點、細(xì)胞死亡途徑相結(jié)合，取二者交集，以新的思路利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討藥物的作用機(jī)制，結(jié)合分子對接相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)成分與靶點，以獲得更為精準(zhǔn)的結(jié)果，同時從中醫(yī)學(xué)理論角度驗證了補(bǔ)陽還五湯中各味藥材可分別作用于多個通路，并協(xié)同影響鐵死亡途徑，最終調(diào)控缺血性腦卒中，進(jìn)一步證實本研究結(jié)果的科學(xué)合理性。

本研究通過將補(bǔ)陽還五湯組方中的七味藥與核心靶點進(jìn)行對接，發(fā)現(xiàn)黃芪、紅花、桃仁、赤芍與核心靶點的對接化合物數(shù)目和最高得分表現(xiàn)突出，提示補(bǔ)陽還五湯調(diào)控關(guān)鍵靶點的成分較多的來源于此4味藥?，F(xiàn)有研究報道中，薛志遠(yuǎn)[20]通過測定氧化應(yīng)激模型小鼠血清、肝臟及大腦組織中T-SOD、GSH-Px的活力和MDA水平，表明黃芪水提液在體外體內(nèi)均具有良好的抗氧化能力。馬勤等[21]研究發(fā)現(xiàn)紅花中紅花黃色素能提高腦組織抗氧化能力。劉琳等[22]研究顯示，桃仁中多糖對于OH-和O2等均具有明顯的抑制作用。張海燕等[23]發(fā)現(xiàn)赤芍總苷可加速自由基清除和抑制炎性因子的釋放。上述研究均從實驗角度證實了各個藥物的抗鐵死亡潛在作用，提示補(bǔ)陽還五湯可能通過多種藥物協(xié)同發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)控鐵死亡以達(dá)到治療缺血性腦卒中的目的。此外，赤芍雖為佐藥，但其對接化合物數(shù)和最高得分均高于其他藥物，在藥材-模塊基因網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)赤芍對各模塊均具有較強(qiáng)的作用，提示赤芍經(jīng)鐵死亡途徑在缺血性腦卒中的治療中貢獻(xiàn)可能最大，提示后續(xù)實驗研究時，可以此為參考對補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行合理的拆減方。結(jié)合DC、CC、BC均位于前10位的核心靶點和對接化合物及得分表，將HSP90AA1、EGFR、GRB2 3個靶點作為補(bǔ)陽還五湯發(fā)揮療效的關(guān)鍵靶點。

KEGG富集和模塊分析結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中可能與MAPK、PI3K-Akt等信號通路有關(guān)。PI3K-Akt和MAPK信號通路經(jīng)下游多種靶點可促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的存活，在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要的作用[24]。其中PI3K-Akt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生理活動的經(jīng)典通路，具有誘導(dǎo)自噬，減輕氧化應(yīng)激，抗脂質(zhì)過氧化等作用[25-26]，更有研究[27-28]表明，激活PI3K-Akt信號通路可以減輕機(jī)體中鐵死亡的發(fā)生。在模塊分析中PI3K-Akt所受到的調(diào)節(jié)作用也最為顯著。由此推測PI3K-Akt信號通路是補(bǔ)陽還五湯經(jīng)鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中的關(guān)鍵機(jī)制之一。

綜上，本研究提示補(bǔ)陽還五湯經(jīng)由鐵死亡途徑調(diào)控缺血性腦卒中，其可能作用機(jī)制與HSP90AA1、EGFR、GRB2等靶點及MAPK、PI3K-Akt、Ras等信號通路有關(guān)，其中，HSP90AA1靶點以及PI3K-Akt信號通路可能為關(guān)鍵機(jī)制。采用Akt抑制劑處理PC12細(xì)胞，結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯通過PI3K-Akt信號通路對氧化應(yīng)激損傷的PC12模型細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，從實驗角度一定程度證實本研究結(jié)果的準(zhǔn)確度，為后續(xù)探索補(bǔ)陽還五湯治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制提供了新的思路和方向。由于該研究是基于生物信息學(xué)及大量數(shù)據(jù)庫的計算得出的結(jié)果，本課題組后續(xù)將基于本文結(jié)果深入開展實驗驗證研究。

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