參葛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

駱慧琳，謝燕*，李國(guó)文，張彤，高月求

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201203)

參葛顆粒是由丹參、葛根、片姜黃等六味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾祛濕，化瘀消痰的功效，藥理實(shí)驗(yàn)和臨床研究［1］表明對(duì)非酒精性脂肪肝病(Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)有較好的療效。為了控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究及調(diào)閱文獻(xiàn)［2-4］，采用薄層色譜鑒別方法對(duì)女貞子、片姜黃、葛根、丹參進(jìn)行定性鑒別，以葛根中葛根素和丹參中丹酚酸B作為定量測(cè)定的指標(biāo)成分，并建立定量測(cè)定方法，所建立的方法能客觀(guān)反映參葛顆粒的品質(zhì)，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);Kromasil 100-5C18色譜柱(AKZO NOBEL公司);CAMAG ATS4全自動(dòng)點(diǎn)樣儀、CAMAG Reprostar 3數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司);Sartorius CPA225D電子天平(賽多利斯公司)。

1.2 試藥參葛顆粒(自制，批號(hào):110901、110902、110903)，齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào):110709-200505)，片姜黃對(duì)照藥材(批號(hào):121006-200903)，丹參對(duì)照藥材(批號(hào):120923-200912)，葛根對(duì)照藥材(批號(hào):121551-200902)，葛根素對(duì)照品(批號(hào):110752-200912)，丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào):111562-200908)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。硅膠G、GF254(青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng))，甲醇(色譜級(jí)，霍尼韋爾公司)，純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 女貞子薄層鑒別取本品研至細(xì)粉狀，稱(chēng)取4 g，加50 mL三氯甲烷，超聲30 min，抽濾，濾液至蒸發(fā)皿中低溫蒸發(fā)有機(jī)溶劑至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，離心，取上層溶液作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺女貞子陰性對(duì)照樣品8 g，按上述方法和步驟制成陰性對(duì)照溶液;另取適量的齊墩果酸對(duì)照品，至10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各4 μL，用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，把環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)作為展開(kāi)劑［5］，展開(kāi)至前沿線(xiàn)，取出，晾干后均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液，置加熱板上105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，于紫外燈366 nm下觀(guān)察熒光，結(jié)果見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，而供試品與齊墩果酸在相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖1 女貞子薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Ligustri lucidi Fructus

2.1.2 片姜黃薄層鑒別［6］取本品研至細(xì)粉狀，稱(chēng)取4 g，加20 mL水超聲10 min，濾過(guò)，濾液用石油醚(30～60℃)萃取3次，每次20 mL，合并石油醚層，濃縮至0.5 mL，作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺片姜黃陰性對(duì)照樣品4 g，按上述方法和步驟制成陰性對(duì)照溶液;另取0.4 g片姜黃對(duì)照藥材，加2 mL石油醚(30～60℃)，超聲30 min，離心，取上清液，濃縮至0.5 mL，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照藥材溶液1 μL、2 μL、2 μL，用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，把石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(17∶3)作為展開(kāi)劑，展開(kāi)至前沿線(xiàn)，取出，晾干后均勻噴灑5%香草醛硫酸溶液顯色，置加熱板上100℃加熱至斑點(diǎn)清晰，白光下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖2。陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，而供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.3 葛根薄層鑒別取本品研至細(xì)粉狀，稱(chēng)取0.1 g，加50 mL 25%甲醇超聲30 min，濾過(guò)，水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，離心，棄去沉淀，取上層液體作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺葛根陰性樣品0.1 g，按上述方法和步驟制成陰性對(duì)照溶液;另取0.2 g葛根對(duì)照藥材，同上述處理制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各1 μL，用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，把環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)作為展開(kāi)劑，展開(kāi)至前沿線(xiàn)，取出，晾干，用氨水熏10 min［7-8］，在紫外燈254 nm下觀(guān)察熒光，結(jié)果見(jiàn)圖3。陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，而供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖2 片姜黃薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Wenyujin Rhizoma Concisum

圖3 葛根薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Puerariae lobatae Radix

2.1.4 丹參薄層鑒別取本品研至細(xì)粉狀，稱(chēng)取0.2 g，加50 mL 25%甲醇超聲30 min，濾過(guò)，水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，離心，棄去沉淀，取上層液體作為供試品溶液。再取按處方比例及工藝制備的缺丹參陰性樣品0.2 g，按上述方法和步驟制成陰性對(duì)照溶液;另取0.2 g丹參對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各3 μL，用自動(dòng)點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上使成條帶狀，把甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶0.8)作為展開(kāi)劑［9］，展開(kāi)至前沿線(xiàn)，取出，晾干后在紫外燈366 nm下觀(guān)察熒光，結(jié)果見(jiàn)圖4。陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾，而供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖4 丹參薄層色譜圖Fig.4 TLC chromatogram of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma

2.2 定量測(cè)定

2.2.1 葛根素

2.2.1.1 色譜條件Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);以甲醇-水(25∶75)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm［10］。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000［11］。

2.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備取適量葛根素對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含葛根素100 μg的溶液。

2.2.1.3 供試品溶液的制備取本品粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲10 min，放冷后再稱(chēng)定質(zhì)量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察取適量葛根素對(duì)照品精密稱(chēng)定后置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，以25%甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e得到質(zhì)量濃度為1.82、4.56、9.12、22.81、38.02、47.52 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述葛根素對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以葛根素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=43.365X－15.474，r=0.999 8。結(jié)果表明葛根素進(jìn)樣量在0.018～0.480 μg范圍內(nèi)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于配制后0、1、2、4、8、12 h重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定。以葛根素峰面積計(jì)算，RSD為0.87%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h基本穩(wěn)定。

2.2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)供試品6份，按照正文定量測(cè)定方法操作并測(cè)定，其含有量的RSD為0.32%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.2.1.7 精密度試驗(yàn)精密吸取同一對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為21.50 μg/mL)10 μL，相同條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，求得葛根素峰面積的RSD為0.56%，結(jié)果表明該儀器有良好的精密度。

2.2.1.8 回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知葛根素含有量的同一批號(hào)樣品9份，按相當(dāng)于參葛顆粒中葛根素量的80%、100%、120%(即低、中、高劑量組)加入葛根素對(duì)照品溶液，按2.2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。葛根素的平均回收率為103.17%，RSD為2.43%。

表1 葛根素回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.2.1.9 空白試驗(yàn)按照處方的組成和比例，取除葛根以外的其余藥味并按照工藝條件制成缺葛根的供試品。按2.2.1.3項(xiàng)下的方法制備成陰性樣品溶液。取陰性樣品溶液10 μL，按照2.2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，色譜圖在葛根素相應(yīng)的保留時(shí)間處沒(méi)有色譜峰，說(shuō)明陰性樣品溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖5。

2.2.1.10 樣品測(cè)定取3批參葛顆粒(批號(hào)110901、110902、110903)適量，按2.2.1.3項(xiàng)下方法制備樣品，以葛根素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，相應(yīng)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得樣品的峰面積代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算葛根素含量。按2.2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖5 葛根素對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)和陰性樣品溶液(C)HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of puerarin reference substance(A)，granules sample(B)and negative sample(C)

表2 參葛顆粒中葛根素的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 DeterminationresultsofpuerarininShenge Granules(n=3)

2.2.2 丹酚酸B

2.2.2.1 色譜條件Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);以甲醇-乙腈-1.67%甲酸水溶液(27∶10∶63)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000［11］。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備取適量丹酚酸B對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 40 μg的溶液。

2.2.2.3 供試品溶液制備取本品粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲10 min，放冷后再稱(chēng)定質(zhì)量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察取適量丹酚酸B對(duì)照品精密稱(chēng)定后置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，以25%甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e得到質(zhì)量濃度為201.49、80.60、50.37、30.22、15.11、9.07 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述葛根素對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以丹酚酸B質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=596.13X－6.350 1，r=0.999 9。結(jié)果表明丹酚酸B進(jìn)樣量在0.091～2.015 μg范圍內(nèi)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于配制后0、1、2、4、8、12 h重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定。以丹酚酸B峰面積計(jì)算，RSD為1.25%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h基本穩(wěn)定。

2.2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)供試品6份，按照正文定量測(cè)定方法操作并測(cè)定，其含有量的RSD為0.71%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.2.2.7 精密度試驗(yàn)精密吸取同一對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為40.35 μg/mL)10 μL，相同條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，求得丹酚酸B峰面積的RSD為0.51%，結(jié)果表明該儀器有良好的精密度。

2.2.2.8 回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知葛根素含有量的同一批號(hào)樣品9份，按相當(dāng)于參葛顆粒中丹酚酸B量的80%、100%、120%(即低、中、高劑量組)加入丹酚酸B對(duì)照品溶液，按2.2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。丹酚酸B的平均回收率為101.38%，RSD為2.83%。

表3 丹酚酸B回收率測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests of salvianolic B

2.2.2.9 空白試驗(yàn)按照處方的組成和比例，取除丹參以外的其余藥味并按照工藝條件制成缺丹參的供試品。按2.2.2.3項(xiàng)下的方法制備成陰性樣品溶液。取陰性樣品溶液10 μL，按照2.2.2.1項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，色譜圖在丹酚酸B相應(yīng)的保留時(shí)間處沒(méi)有色譜峰，說(shuō)明陰性樣品溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖6。

圖6 丹酚酸B對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)和陰性樣品溶液(C)HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of salvianolic acid B re-ference substance(A)，granules sample(B)and negative reference(C)

2.2.2.10 樣品測(cè)定取3批參葛顆粒(批號(hào)110901、110902、110903)適量，按2.2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品，按2.2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含有量測(cè)定，以丹酚酸B對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，相應(yīng)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)得樣品峰面積代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，

計(jì)算丹酚酸B含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 參葛顆粒中丹酚酸B的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determination results of salvianolic acid B in Shenge Granules(n=3)

3 討論

在對(duì)片姜黃進(jìn)行薄層鑒別中，供試品的處理方法曾經(jīng)嘗試直接用石油醚(30～60℃)提取，但供試品溶液的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材未能很好的對(duì)應(yīng)，考慮到片姜黃的主要成分——揮發(fā)油可能由于經(jīng)過(guò)β-環(huán)糊精包合，在有機(jī)溶劑中很難被提取出來(lái)，所以采用先以水提取后再以石油醚(30～60℃)萃取的方法處理樣品，結(jié)果斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)一致。

在葛根的薄層鑒別中，展開(kāi)晾干后若立即在紫外燈254 nm下觀(guān)察，斑點(diǎn)很不明顯，需放置1～3 h才能使斑點(diǎn)清晰，后改用氨水熏蒸，只需10 min就可使斑點(diǎn)顯現(xiàn)。

在參葛方中，丹參為君藥，葛根為臣藥。丹參中的丹酚酸B具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及抗肝纖維化作用，其機(jī)制可能為丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，從而減少肝細(xì)胞的損傷，抑制TGF-β的產(chǎn)生和HSC的增殖活化，具有抗肝纖維化作用［12］。葛根中的葛根素能明顯防治實(shí)驗(yàn)性大鼠NAFLD，與辛伐他汀相比，葛根素能更高好地減輕脂類(lèi)在肝臟中的積聚、降低炎癥反應(yīng)、保護(hù)肝細(xì)胞［13］，兩者分別被2010年版《中國(guó)藥典》一部定為控制丹參、葛根質(zhì)量的目標(biāo)成分。故選擇丹參中的丹酚酸B和葛根中的葛根素作為控制本品質(zhì)量的定量指標(biāo)。

該質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)便可靠、精密度高、分離效果好，可用于參葛顆粒的質(zhì)量控制。

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