PTEN通過靶向P21誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞衰老的機(jī)制研究①

柯小平 李 莉 李經(jīng)維 劉 平 （同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海200090）

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌［1-2］。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最多見，其次是惡性生殖細(xì)胞腫瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴(yán)重威脅［3］。由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，難以早期發(fā)現(xiàn)，卵巢上皮癌患者手術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占不足30%，大多數(shù)已擴(kuò)散到盆腹腔器官［4-5］，因此，早期診斷和特異性靶向治療是早期發(fā)現(xiàn)和治療的關(guān)鍵。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）是最早發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因［6-7］，是 PI3K 通路的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子［8］，在多種進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性腫瘤中發(fā)生高頻缺失和突變，它通過使PIP3去磷酸化轉(zhuǎn)化為PIP2，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PIP3的水平，拮抗PI3K的活性，負(fù)向調(diào)節(jié)AKT信號通路，使AKT 信號通路失活，進(jìn)一步干擾眾多下游信號，從而調(diào)控腫瘤的增殖、遷移、侵襲［9］。PTEN 信號通路可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管形成、維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性等發(fā)揮其抑癌作用［10］。除了經(jīng)典的PTEN/PI3K/AKT 信號通路，PTEN 是否存在其他的調(diào)控卵巢癌發(fā)生發(fā)展的信號通路？目前大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤與衰老存在密切聯(lián)系，大多數(shù)腫瘤發(fā)生在機(jī)體衰老時(shí)期，衰老細(xì)胞難以修復(fù)錯(cuò)配基因，更易導(dǎo)致原癌基因的激活和抑癌基因的失活［11-13］，另一方面，衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，使細(xì)胞停留在G0/G1 期而抑制細(xì)胞增殖，從而阻止細(xì)胞過度增殖形成腫瘤。許多調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白分子都參與腫瘤的發(fā)生，同時(shí)也參與細(xì)胞衰老的調(diào)控，如P53 和 P21 基因［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，P21 蛋白在卵巢癌組織表達(dá)量較低，P21 表達(dá)減少會促進(jìn)細(xì)胞增殖，使得細(xì)胞不易衰老，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此，進(jìn)一步研究了P21是否影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，以及PTEN是否通過調(diào)控P21抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果顯示，PTEN 通過促進(jìn)TRIM39 與P21 的結(jié)合，導(dǎo)致P21 不能被泛素化降解，間接地促進(jìn)了P21 的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本收集及知情同意 收集2017 年1 月至2019 年12 月在同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院婦產(chǎn)科接受一期手術(shù)的30 例卵巢癌患者組織樣本和30例卵巢囊腫切除的卵巢樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡35~65歲，近3個(gè)月未接受激素類藥物治療，排除術(shù)前接受化療的患者。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面同意書，并告知患者組織只限用于科學(xué)研究。

1.1.2 試劑及設(shè)備 SKOV3 細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫；過表達(dá)PTEN及P21的慢病毒及干擾和過表達(dá)TRIM39 的慢病毒均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司；小鼠PTEN 抗體、小鼠P21 抗體、小鼠TRIM39抗體及兔Vimentin 抗體購自美國Abcam；對應(yīng)二抗羊抗小鼠HRP 或羊抗兔HRP 購自美國CST；4%多聚甲醛、氯仿購自中國國藥集團(tuán)；0.01 mo/l L PBS、抗原修復(fù)液、β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自中國碧云天公司；山羊抗兔555 二抗、DAPI 購自美國Ther?mo Scientific；Trizol 購自美國 Invitrogen；TB Green?Premix Ex Taq?試劑盒購自日本TaKaRa；PVDF膜購自美國Millipore；羊抗小鼠HRP 或羊抗兔HRP 購自美國CST；McCoY's 5A 細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Sigma；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光染色 將卵巢癌組織樣本和正常卵巢組織樣本用眼科剪裁切成1 cm3大小的組織塊，浸泡在4℃4%多聚甲醛的組織固定液中72 h，液體石蠟包埋卵巢組織后行石蠟切片，室溫保存。行免疫熒光染色時(shí)，首先使用二甲苯對石蠟切片進(jìn)行脫蠟，100%、90%、70%乙醇水化，然后放入盛有檸檬酸鈉抗原修復(fù)液的燒杯中，燒杯中的抗原修復(fù)液需漫過組織切片，95℃加熱15 min，自然冷卻至室溫后0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。用含5%正常山羊血清的封閉液室溫孵育組織30 min，將小鼠PTEN抗體（1∶500）、小鼠P21 抗體（1∶500）、小鼠TRIM39抗體（1∶500）及兔Vimentin抗體（1∶500）稀釋于一抗稀釋液中，混勻，滴加在組織表面，4℃孵育過夜，0.01 mo/l L PBS 清洗，10 min×3 次后將山羊抗小鼠488二抗及山羊抗兔555二抗按照1∶1 000稀釋于二抗稀釋液中，混勻，滴加在組織或細(xì)胞表面，37℃室溫孵育 1 h，0.01 mo/l L PBS 清洗，10 min×3 次。在組織切片上滴加DAPI 染色液，蓋玻片封片，正置熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染 McCoY's 5A 細(xì)胞培養(yǎng)液+10%胎牛血清作為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照試驗(yàn)要求分別接種在6 cm 培養(yǎng)皿和24 孔板中，6 cm 培養(yǎng)皿用于檢測靶分子在mRNA 水平和蛋白水平的表達(dá)，24 孔板用于β-gal 和Tunel 染色檢測衰老細(xì)胞和凋亡細(xì)胞情況。過表達(dá)PTEN 及P21 的慢病毒滴度為 1×108TU/ml；干擾和過表達(dá)TRIM39 的慢病毒滴度均為 1×108TU/ml。SKOV3 細(xì)胞用 Mc?CoY's 5A 培養(yǎng)液調(diào)整密度為 5×106個(gè)/ml，接種于6 cm培養(yǎng)皿，待接種密度達(dá)到90%以上，加入400μl病毒感染增強(qiáng)液Hitrans GA 及100 μl 滴度為1×108TU/ml 的慢病毒或陰性對照（neg-control），37℃培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液，感染后約72 h，觀察感染效率（GFP 陽性細(xì)胞數(shù)量），當(dāng)效率達(dá)到或超過90%時(shí)，表示感染成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 Real-time PCR 樣本收集方法按照傳統(tǒng)RNA 抽提方式進(jìn)行，細(xì)胞及血管組織中加入1 ml Trizol 后加入 200 μl 氯仿混勻后靜置 10 min，4℃12 000/r min 離心15 min，將上層的水相轉(zhuǎn)移至新的無 RNA 酶的 EP 管，加入 500 μl 異丙醇，混勻，靜置 10 min 后 12 000/r min 離心 10 min，棄上清，可見白色RNA 沉積于管底，75%乙醇清洗后晾干，待白色RNA 變?yōu)闊o色透明狀，加入30μl 焦碳酸二乙酯（diet-hylpyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA，儲存于?80℃。使用TB Green?Premix Ex Taq?試劑盒進(jìn)行基因的定量PCR 檢測，采用20 μl 反應(yīng)體系，95℃預(yù)變性 30 s 后 95℃ 5 s，60℃ 30 s 進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，依據(jù)公式2?ΔΔCT計(jì)算被檢測基因的相對量，然后進(jìn)行組間比較。PTEN 引 物 序 列 ：forward：5'-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3'，reverse：5'-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3'；P21 引 物 序 列 ：forward：5'-TGCAACTACTACAGAAACTGCTG-3'，reverse：5'-CAAAGTGGTCGGTAGCCACA-3'；TRIM39 引 物 序 列 ：forward：5'-GAAAGGGCGAGTTGACTCCAC-3'，reverse： 5'-GGCTGCATATTTGTCCCCATT-3'； GADPH引物序列：forward：5'-CTTGCTCAAGCTTAGTTCTAGG-3′，reverse：5'-GAGTGCTCAGTGGTATTGC-3'。

1.2.4 Western blot 體外培養(yǎng)細(xì)胞行蛋白抽提后首先進(jìn)行BCA 蛋白定量測定蛋白濃度，在抽提的蛋白中加入相應(yīng)體積的5×loading buffer，混勻后100℃蛋白變性5 min，分裝后置于?80℃保存。制備SDSPAGE，每孔上樣20 μg 總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后，室溫封閉30 min，利用相應(yīng)一抗：小鼠PTEN多克隆抗體、小鼠P21多克隆抗體、小鼠TRIM39多克隆抗體、兔GAPDH 多克隆抗體及對應(yīng)二抗羊抗小鼠HRP 或羊抗兔HRP 檢測相應(yīng)蛋白條帶，運(yùn)用IPP軟件進(jìn)行蛋白定量并比較組間差異。

1.2.5 β-gal 染色 使用β-半乳糖苷酶染色試劑盒對衰老細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。β-半乳糖苷酶染色試劑盒以X-Gal 為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍(lán)色產(chǎn)物，光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞。細(xì)胞使用β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min，0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。然后加入β-半乳糖苷酶染色液A（10 μl）、β-半乳糖苷酶染色液B（10 μl）、β-半乳糖苷酶染色液 C（930 μl）和 X-gal（50μl）按照比例混合的染色工作液，37℃孵育4 h，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。如不能及時(shí)觀察拍照，可以去除染色工作液，加入相應(yīng)體積的PBS，4℃環(huán)境下可以保存數(shù)日。每孔細(xì)胞選取10個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)10個(gè)視野β-半乳糖苷酶陽性染色細(xì)胞數(shù)目，除以總細(xì)胞數(shù)目，即為陽性細(xì)胞比例，對照各組間陽性染色比率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.2.6 Tunel染色 培養(yǎng)的細(xì)胞去除培養(yǎng)液后加入4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min。0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。加入含 0.3% Triton X-100的 PBS，室溫孵育 5 min，0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次。按照TdT酶∶熒光標(biāo)記液∶Tunel檢測液（1∶9∶10）的比例配置Tunel 染色液。每孔細(xì)胞中加入適當(dāng)?shù)腡unel 染色液，置于37℃避光孵育2 h，0.01 mo/l L PBS 清洗，5 min×3 次后，用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)Tunel 陽性染色細(xì)胞數(shù)，每孔細(xì)胞選取10 個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)10 個(gè)視野Tunel 陽性染色細(xì)胞數(shù)目，除以總細(xì)胞數(shù)目，即為陽性細(xì)胞比例，對照各組間陽性染色比率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS18.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量指標(biāo)以表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及Tukey's post-hoc 檢驗(yàn)分析方法，P<0.05表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人卵巢癌組織與正常卵巢組織中PTEN 和P21表達(dá)比較 Real-time PCR 結(jié)果顯示，與正常人卵巢組織相比，人卵巢癌組織中PTEN 和P21 mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖1A）。Western blot結(jié)果顯示，與正常人卵巢組織相比，人卵巢癌組織中PTEN 和P21在蛋白水平表達(dá)均下調(diào)（圖1B）。免疫熒光染色顯示，與正常人卵巢組織相比，人卵巢癌組織中PTEN和P21 在蛋白水平表達(dá)均下調(diào)（圖1C）。依據(jù)上述研究結(jié)果，推測抑癌基因PTEN和衰老蛋白P21的表達(dá)下調(diào)與卵巢癌的發(fā)病具有相關(guān)性。

圖1 人卵巢癌組織與正常卵巢組織中PTEN 和P21 表達(dá)比較Fig.1 Comparison of expression of PTEN and P21 in human ovarian cancer tissue and normal ovarian tissue

2.2 P21 對人卵巢癌細(xì)胞衰老和增殖的影響 βgal 染色顯示，與正常卵巢癌細(xì)胞相比，過表達(dá)P21的SKOV3 細(xì)胞衰老細(xì)胞數(shù)目顯著增加（圖2A），Ki67 表達(dá)顯著降低（圖2B）。過表達(dá)P21 的SKOV3細(xì)胞中PTEN 在mRNA 及蛋白水平表達(dá)未有變化（圖2C）。

圖2 過表達(dá)P21對人卵巢癌細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of overexpression of P21 on human ovarian cancer cells

2.3 PTEN 對人卵巢癌細(xì)胞衰老和增殖的影響 在SKOV3 細(xì)胞中過表達(dá)PTEN，促進(jìn)了SKOV3 細(xì)胞的衰老（圖3A），抑制了SKOV3 細(xì)胞的增殖（圖3B）。過表達(dá) PTEN 的 SKOV3 細(xì)胞中 P21 mRNA 和蛋白水平顯著升高（圖3C、D）。推測PTEN 通過促進(jìn)P21 的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞衰老，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。

圖3 過表達(dá)PTEN對人卵巢癌細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of overexpression of PTEN on human ovari?an cancer cells

2.4 TRIM39 對人卵巢癌細(xì)胞衰老和增殖的影響 與正常卵巢組織相比，TRIM39 在卵巢癌組織中的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著減少（圖4A~C）。在SKOV3 細(xì)胞中過表達(dá) TRIM39，P21 mRNA 和蛋白水平顯著升高（圖4D）。結(jié)果顯示過表達(dá)TRIM39促進(jìn)了SKOV3細(xì)胞的衰老（圖4E）。

圖4 過表達(dá)TRIM39對人卵巢癌細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of overexpression of TRIM39 on human ovarian cancer cells

2.5 PTEN 對人卵巢癌細(xì)胞影響的機(jī)制驗(yàn)證 在加入PTEN 激動劑naringin 的SKOV3 細(xì)胞中Realtime PCR 和 Western blot 結(jié)果顯示，PTEN 激動劑同樣促進(jìn)了TRIM39 的表達(dá)（圖5A、B）。在干擾TRIM39 表達(dá)的SKOV3 細(xì)胞中加入PTEN 激動劑naringin，與對照組相比，P21 mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少，衰老的卵巢癌細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖5C、D），說明PTEN 通過促進(jìn)TRIM39 表達(dá)維持了P21 的穩(wěn)定，減少了P21 的降解，從而促進(jìn)了SKOV3 細(xì)胞衰老。

圖5 PTEN/ TRIM39/ P21 通路在人卵巢癌細(xì)胞衰老中的作用Fig.5 Role of PTEN/ TRIM39/ P21 pathway in senes?cence of human ovarian cancer cells

3 討論

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌而列居第三位。其中上皮性腫瘤占原發(fā)性卵巢腫瘤的50%~70%，其惡性類型占卵巢惡性腫瘤的85%~90%［15-16］。手術(shù)和化療雖然可以治愈大多數(shù)初期患者，但卻不能挽救很多晚期患者的生命［17］。卵巢癌組織類型主要有交界性腫瘤、漿液性癌、內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌、黏液性癌。近10 年來，為了提高卵巢癌的治愈率，人們提出了新的分類方式，將卵巢癌分為Ⅰ型和Ⅱ型［18-19］。Ⅰ型為低級別腫瘤，包含BRAF、KRAS、PTEN 基因突變的內(nèi)膜樣、黏液性、透明細(xì)胞癌。Ⅱ型腫瘤是高級別漿液性和癌肉瘤，包含 p53、BRCA1 和 BRCA2 基因突變［20-21］?；诼殉舶┒嗷蛲蛔兊脑?，目前的治療方式除了傳統(tǒng)的化療藥物外，還包括靶向治療、抗血管生成治療和激素替代療法等。

抑癌基因PTEN（MMAJC1/TEP1）定位于染色體10q23.3 上，它的突變與缺失和人類多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。PTEN 基因主要通過其雙重底物特異性磷酸酶活性，經(jīng)由P13K信號系統(tǒng)和MAPK信號級聯(lián)途徑發(fā)揮腫瘤抑制作用，對細(xì)胞生長、凋亡、增殖及黏附產(chǎn)生影響。近年來的研究成果已經(jīng)證實(shí)，PTEN與子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌等多種婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［22-23］。然而，除了經(jīng)典的PI3K/AKT 通路，PTEN 是否還通過其他途徑抑制卵巢癌的發(fā)生，有待于深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌組織中PTEN、P21、TRIM39 表達(dá)顯著降低，P21 參與調(diào)控細(xì)胞周期，而TRIM39 則負(fù)責(zé)P21 的穩(wěn)定。P21作為一種抑癌基因，隸屬于細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，通過其編碼蛋白的水平來調(diào)控細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，P21 與腫瘤的增生、分化、轉(zhuǎn)移和浸潤程度相關(guān)，同時(shí)具有判斷預(yù)后的價(jià)值。與此同時(shí)，P21 也是一個(gè)調(diào)控細(xì)胞衰老的基因，其通過抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞衰老［24-25］。因此，本研究觀察了P21 是否能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞衰老，PTEN 是否能夠通過調(diào)控P21的表達(dá)抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)果表明，P21 促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞衰老，從而促使卵巢癌細(xì)胞周期停滯，抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，這種作用可以通過調(diào)控PTEN的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，表明PTEN能夠通過促進(jìn)P21的表達(dá)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，PTEN 并不能直接調(diào)控P21 的表達(dá)，因此，推測PTEN 可能通過調(diào)控P21 結(jié)合蛋白TRIM39，影響P21 的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，PTEN 促進(jìn)了TRIM39 的表達(dá)，從而促進(jìn)了TRIM39與P21 的結(jié)合，阻止了P21 被泛素化降解，從而間接促進(jìn)了P21的表達(dá)，促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的衰老。

TRIM39 自2000 年被克隆，其生物學(xué)功能仍不明確［26-27］。P21 是一個(gè)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制分子，它通過調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，參與細(xì)胞生長、分化、衰老和死亡的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞應(yīng)對應(yīng)激刺激以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)TRIM39 與P21 相互作用，從而阻止CRL4Cdt2這個(gè)E3 復(fù)合物中的底物識別蛋白Cdt2 與P21 的結(jié)合，進(jìn)而抑制CRL4Cdt2E3復(fù)合物介導(dǎo)的對P21的泛素化蛋白酶體降解，由此影響細(xì)胞周期以及細(xì)胞對DNA 損傷刺激的應(yīng)答［28-29］。TRIM39 作為調(diào)控細(xì)胞周期的重要分子，在生理狀態(tài)下TRIM39與P21共同負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，在DNA 損傷刺激條件下，TRIM39 對細(xì)胞周期停滯起至關(guān)重要的作用［30］。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN 通過促進(jìn)TRIM39 的表達(dá)從而阻止了P21 的降解，從而促使細(xì)胞周期停滯在G0/G1 期和細(xì)胞衰老，抑制了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。然而，PTEN 可能存在多種調(diào)控通路參與抑制腫瘤的發(fā)生，因此探索更多的調(diào)控腫瘤發(fā)生的下游靶基因，對于腫瘤的靶向治療具有重要意義。