雙陰性T淋巴細(xì)胞在兒童腺病毒肺炎患兒中的變化及意義探討①

李權(quán)恒 董偉然 李金英 高文杰 徐麗娟 張中馥 張麗君

（河北省兒童醫(yī)院急診科，石家莊050031）

腺病毒是兒童肺炎常見(jiàn)病原，近1/3 可發(fā)展為重癥腺病毒肺炎，甚至引起呼吸窘迫綜合征而導(dǎo)致死亡，并可遺留不同程度的后遺癥，嚴(yán)重影響兒童的生活［1］。重癥腺病毒發(fā)生除與病毒表型和載量有關(guān)外，病毒感染后免疫功能紊亂和機(jī)體免疫功能低下也可導(dǎo)致其發(fā)生、發(fā)展［2］。雙陰性T 淋巴細(xì)胞（double negative T cell，DNT）是一特殊類(lèi)型T 淋巴細(xì)胞，具有一定的抑制性免疫調(diào)節(jié)作用，參與自身免疫性疾病、腫瘤性疾病以及移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［3-6］。為探討DNT 在腺病毒肺炎中的變化以及與患兒病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，本文對(duì)癥腺病毒肺炎患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群的水平進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 資料 選擇 2016 年 1 月至 2019 年 12 月在河北省兒童醫(yī)院呼吸一科住院診斷為腺病毒肺炎患兒為研究對(duì)象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①腺病毒肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床表現(xiàn)及胸部影像學(xué)診斷為肺炎的患兒，并鼻咽部分泌物或痰腺病毒DNA 陽(yáng)性。根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為輕癥腺病毒肺炎、重癥腺病毒肺炎兩組，病情嚴(yán)重程度參照2019 年國(guó)家衛(wèi)生健康委制定的《兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范》［7］；②年齡1 月~6 歲，性別不限；③近兩周之內(nèi)無(wú)嚴(yán)重感染性疾病、未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物；④無(wú)免疫缺陷病史、自身免疫性疾病、先天性心臟病、血液系統(tǒng)疾病及其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；⑤臨床資料完善。共入組312 例，其中輕癥腺病毒肺炎患兒197 例，重癥腺病毒肺炎患兒115例。并選同期在保健科進(jìn)行健康體檢的60 例兒童作為健康對(duì)照組，其中男41 例，女19 例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，家屬知情同意。

1.2 方法 所有患兒及正常對(duì)照組兒童均由護(hù)士取得血樣后送檢，送檢后8 h 內(nèi)由我院兒研所專(zhuān)門(mén)醫(yī)師應(yīng)用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司FC500型流式細(xì)胞儀嚴(yán)格按操作手冊(cè)及試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD3+CD4?CD8?、CD3+CD4+CD8+、CD19+、CD56+進(jìn)行檢測(cè)，并記錄。正常參考范圍：CD3+∶60%~82%；CD4+∶35%~58%；CD8+∶20%~35%；CD4+/CD8+∶0.7%~2.5%；CD3+CD4?CD8?（DNT）∶<6.7%；CD3+CD4+CD8+∶<2.0%；CD19+∶5%~18%；CD56+∶4%~18%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間采用重復(fù)測(cè)量方差分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney 秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用n表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 共入組腺病毒肺炎患兒312例，男 202 例，女 110 例，平均年齡 16.5（11，35）月齡，輕癥腺病毒肺炎患兒共197 例，其中男125 例，女72例，平均年齡17（11，39）月齡，重癥腺病毒肺炎共115例，其中男77例，女38例，平均年齡16（11.5，36）月齡，正常對(duì)照組兒童60 例，其中男41 例，女19例，平均年齡21.5（15，36）月齡。三組的年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)腺病毒肺炎患兒進(jìn)行年齡分層，輕癥腺病毒肺炎組和重癥腺病毒肺炎組各年齡段性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組腺病毒肺炎患兒年齡分層比較［M（P25，P75）］Tab.1 Comparison of age stratification between two groups of children with adenovirus pneumonia［M（P25，P75）］

2.2 不同組間外周血T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較 見(jiàn)表2，三組比較CD3+、CD4+、DNT、CD3+CD4+CD8+、CD19+百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其余指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與正常對(duì)照組相比輕癥腺病毒肺炎組和重癥腺病毒肺炎組CD3+、CD4+、DNT 百分比下降，重癥腺病毒肺炎組下降更顯著（P<0.05）；CD19+百分比在正常對(duì)照組與重癥腺病毒肺炎組及輕癥與重癥腺病毒肺炎組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而正常對(duì)照組組與輕癥腺病毒肺炎組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 不同組間外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平比較［，M（P25，P75）%］Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between different groups［，M（P25，P75）%］

表2 不同組間外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平比較［，M（P25，P75）%］Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between different groups［，M（P25，P75）%］

Note：Compared with normal control group，1）P<0.05；Compared with severe adenovirus group，2）P<0.05.

CD3+68.73±6.0438.53±6.48 Normal control（n=60）Mild adenovirus pneumonia（n=197）Severe adenovirus pneumonia（n=115）Z/ F P 22.73±5.24 22.52±6.50 64.20（56.40，69.30）1）2）34.90±9.301）2）21.40（17.40，26.00）1.60（1.40，2.20）1.60（1.20，2.10）7.10（4.80，8.40）4.30（2.90，6.00）1）2）0.10（0.00，0.10）0.10（0.10，0.20）1）24.60（17.90，31.00）5.80（3.40，8.30）6.20（3.60，9.80）6.50（3.70，9.50）1.017 0.601 58.74±12.301）31.81±10.281）27.91±11.71）34.283 0.000 19.043 0.000 20.70（16.50，25.40）2.111 0.348 1.60（1.00，2.00）4.633 0.099 3.50（2.40，5.00）1）53.877 0.000 0.10（0.00，0.20）1）18.253 0.000 9.938 0.007 CD4+Groups CD8+CD19+CD4+/ CD8+CD3+CD4?CD8?CD3+CD4+CD8+CD56+

2.3 腺病毒肺炎患兒外周血T 淋巴細(xì)胞亞群按年齡分層比較 0~1 歲和3~6 歲輕癥、重癥腺病毒肺炎患兒外周血總淋巴細(xì)胞亞群各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在1~3 歲年齡段重癥腺病毒肺炎患兒CD3+、CD4+、DNT 水平低于輕癥腺病毒肺炎組，CD19+高于輕癥腺病毒肺炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

表3 腺病毒肺炎患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群年齡分層結(jié)果比較［，M（P25，P75）%］Tab.3 Comparison of age stratification results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of adenovirus pneumonia chil?dren［，M（P25，P75）%］

表3 腺病毒肺炎患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群年齡分層結(jié)果比較［，M（P25，P75）%］Tab.3 Comparison of age stratification results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of adenovirus pneumonia chil?dren［，M（P25，P75）%］

Age（Years）Groups CD3+CD4+CD8+CD4+/ CD8+CD3+CD4?CD8?CD3+CD4+CD8+CD19+CD56+33.32±11.26 59.88±11.7918.90（15.80，23.50）1.90（1.30，2.70）2.70（1.95，3.45）0.10（0.00，0.20）23.70±10.736.30（3.10，10.70）0~159.44±13.3133.23±11.6920.70（16.40，24.50）1.60（1.30，2.00）3.00（2.20，4.40）0.10（0.00，0.20）27.69±12.636.70（4.50，10.50）1.476 0.143 0.157 0.875?1.484 0.138?1.500 0.134 Mild adenovirus pneumonia（n=69）Severe adenovirus pneumonia（n=44）Z/ F P Mild adenovirus pneumonia（n=98）Severe adenovirus pneumonia（n=54）Z/ F P Mild adenovirus pneumonia（n=30）Severe adenovirus pneumonia（n=17）Z/ F P?1.440 0.15?0.853 0.394?0.064 0.949?0.380 0.704 62.50（55.50，67.80）34.50±8.2221.61±5.771.60（1.20，2.00）5.20（3.60，6.20）0.10（0.10，0.20）25.70（19.50，30.92）6.25（3.77，9.85）1~354.20±10.1329.40±8.7919.60（16.10，25.70）1.60（0.90，2.10）4.95（3.62，6.20）0.10（0.00，0.20）31.34±10.825.40（2.30，8.00）?4.304 0.000 3.578 0.000?0.755 0.45?1.488 0.137?5.497 0.000?1.443 0.149?3.665 0.000?1.675 0.094 67.60（63.10，73.30）34.04±8.4325.10（20.52，28.60）1.40（1.00，1.70）5.65（4.32，7.50）0.10（0.00，0.20）20.10（15.47，25.67）5.35（3.47，9.70）3~667.03±10.3134.47±9.9322.40（17.67，36.90）1.50（1.12，1.90）6.18±3.530.10（0.07，0.30）21.11±8.837.30（3.77，9.37）?0.188 0.851?0.210 0.838?0.856 0.392?0.632 0.527?0.370 0.714?0.166 0.869?0.188 0.851?0.470 0.638

3 討論

腺病毒是兒童呼吸道感染常見(jiàn)病原，其導(dǎo)致的兒童重癥肺炎占兒童重癥肺炎20%以上，在進(jìn)行機(jī)械通氣的兒童重癥肺炎患兒中，腺病毒亦是檢出最多的病毒病原，其易造成2 歲以下嬰幼兒及存在免疫功能障礙患者的死亡，腺病毒感染后可引起T、B細(xì)胞數(shù)量及功能的降低，造成Th1/Th2比例失衡，引起機(jī)體免疫功能紊亂［8-11］。T 淋巴細(xì)胞是參與細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，按T細(xì)胞抗原受體表達(dá)不同，分為CD4+淋巴細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞兩個(gè)亞群，CD3+是T細(xì)胞激活的標(biāo)志物，CD4+是T 細(xì)胞應(yīng)答功能的標(biāo)志物，CD8+是對(duì)非己抗原誘發(fā)免疫應(yīng)答抑制作用的標(biāo)志物，正常情況下這兩種淋巴細(xì)胞亞群之間相互協(xié)調(diào)、相互平衡，使機(jī)體處于免疫穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+降低說(shuō)明T 細(xì)胞對(duì)外來(lái)入侵的抑制功能降低［12-14］。B 淋巴細(xì)胞是體液免疫效應(yīng)細(xì)胞，CDl9+細(xì)胞為活化B 細(xì)胞，可分泌多種免疫球蛋白和抗體，介導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答，外周血中CD19+分子的表達(dá)高低可代表B淋巴細(xì)胞水平。

研究表明呼吸道感染患兒CD3+、CD4+水平下降，CD19+水平升高，且隨病情加重，CD3+、CD4+水平下降以及CD19+水平偏移越明顯［15-16］。呼吸道病毒感染T淋巴細(xì)胞改變程度大于細(xì)菌感染［17］。腺病毒感染時(shí)CD3+、CD4+、CD19+改變程度大于呼吸道合胞病毒，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)［18-20］。本研究也發(fā)現(xiàn)腺病毒肺炎患兒CD3+、CD4+低于正常對(duì)照兒童，且重癥腺病毒肺炎患兒CD3+、CD4+降低程度大于輕癥腺病毒肺炎患兒，提示腺病毒感染可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損，病情越重?fù)p傷程度越明顯，且CD19+兩組患兒均高于正常值，重癥腺病毒肺炎升高更明顯，分析考慮與重癥腺病毒肺炎細(xì)胞免疫功能受損、B 淋巴細(xì)胞依賴(lài)的T細(xì)胞功能受損、B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體功能不足有關(guān)，造成機(jī)體免疫失衡，所以對(duì)于重癥腺病毒肺炎患兒適當(dāng)給予免疫調(diào)節(jié)劑，有助于患兒免疫狀態(tài)的改善，從而提高治療效果。

DNT 是T 淋巴細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群，既不表達(dá)CD4+也不表達(dá)CD8+，其在體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制十分復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)DNT 可以抑制免疫細(xì)胞及炎癥因子，對(duì)具有相同T 細(xì)胞受體的特異性CD8+和CD4+產(chǎn)生抑制作用，發(fā)揮免疫抑制功能［21］；DNT 還可通過(guò)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells,APC）途徑轉(zhuǎn)變成既表達(dá)特異性抗原又表達(dá)凋亡相關(guān)因子配體 (factor association suicide ligand,FASL )的“殺傷”細(xì)胞，并通過(guò)其FasL 將凋亡信號(hào)傳遞給CD8+細(xì)胞［22］。而 CD4+、CD8+及 DNT 可從 APC 上獲得主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility com?plex，MHC）短肽復(fù)合物并將此抗原遞呈于其鄰近的T 淋巴細(xì)胞，從而誘導(dǎo)免疫耐受［23］。在兒童不同病毒感染性疾病中DNT 表達(dá)有所不同，EB 病毒引起傳染性單核細(xì)胞增多癥患者中，DNT 處于高表達(dá)［24］。而在兒童手足口病的研究中DNT 處于低表達(dá)狀態(tài)［25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論輕癥腺病毒肺炎還是重癥腺病毒肺炎患兒中都存在一定水平的DNT 細(xì)胞，但水平顯著低于正常對(duì)照兒童，且重癥腺病毒肺炎患兒DNT 水平明顯低于輕癥腺病毒肺炎患兒，提示DNT 可能參與重癥腺病毒肺炎發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，考慮機(jī)制可能為DNT 減少導(dǎo)致其免疫抑制功能降低，從而引起腺病毒肺炎氣道炎癥調(diào)節(jié)紊亂的持續(xù)存在，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

有研究表明兒童CD3+、CD8+和CD56+百分比隨年齡增長(zhǎng)均呈逐漸升高趨勢(shì)，CD4+、CD19+百分比及CD4+/CD8+比值隨年齡增長(zhǎng)均呈逐漸降低趨勢(shì)，男女淋巴細(xì)胞升高、降低的程度略有不同［26］。另有研究表明，學(xué)齡前兒童隨年齡增長(zhǎng)CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD19+呈下降趨勢(shì)，而 CD56+、CD8+呈上升趨勢(shì)［27］。還有研究表明CD3+在嬰兒期后保持相對(duì)穩(wěn)定［28］。本研究對(duì)入組患兒進(jìn)行年齡分層研究發(fā)現(xiàn)輕癥腺病毒肺炎患兒 CD3+、CD4+、CD8+、DNT 隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，CD4+/CD8+、CD56+隨年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，而重癥腺病毒肺炎患兒僅DNT 隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，其余指標(biāo)均與年齡無(wú)顯著性差異，且只有 1~3 歲年齡組患兒 CD3+、CD4+、DNT、CD19+輕、重癥腺病毒肺炎比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腺病毒感染1~3歲兒童可引起更加嚴(yán)重的免疫功能的紊亂，考慮與1 歲以?xún)?nèi)的患兒帶有一定的母體免疫，3 歲以上兒童免疫功能逐漸完善，1~3 歲患兒免疫功能發(fā)育不完善有關(guān)。

綜上所述，腺病毒感染人體后引起臨床癥狀輕重與機(jī)體免疫功能紊亂有關(guān)，病情越重細(xì)胞免疫抑制程度越明顯，尤其是對(duì)于1~3 歲兒童，CD4+、CD8+T 細(xì)胞是介導(dǎo)腺病毒感染的免疫應(yīng)答主要細(xì)胞，DNT 減少導(dǎo)致其免疫抑制功能降低，從而進(jìn)一步加重免疫功能紊亂狀態(tài)，促進(jìn)病情的進(jìn)一步加重，所以對(duì)腺病毒肺炎患兒進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定可為預(yù)測(cè)病情的發(fā)展提供一定依據(jù)。