顯微鏡下多血管炎患者血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNAs及其功能分析①

閆秋爽 王 陽 魏鑫岳 魏 蔚 馬 駿 鄭 芳（天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，天津300203）

顯微鏡下多血管炎（microscopic polyangiitis，MPA）是一類主要表現(xiàn)為小血管損傷的系統(tǒng)性自身免疫疾病。MPA是抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關(guān)性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）的亞型，主要特征為血清中存在髓過氧化物酶自身抗體（myeloperoxidase-ANCA，MPO-ANCA）［1］。外泌體是由脂質(zhì)雙分子層包裹的微小囊泡，直徑約為30～100 nm，可裝載DNA、RNA、蛋白和脂質(zhì)等重要生物分子，可介導(dǎo)相鄰及遠(yuǎn)距離細(xì)胞信息傳遞［2］。外泌體具有特殊的分子標(biāo)志物，如CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP27等［3］。研究表明，外泌體可能在部分自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［4-6］。MicroRNAs（miRNAs）是一類序列長度為19～25個核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)約90%編碼蛋白的基因，在多種生物學(xué)過程中（如分化、增殖、凋亡和免疫穩(wěn)態(tài)維持等）發(fā)揮重要作用［7-9］。研究表明，外泌體來源的miRNAs參與部分疾病病理過程［10］，但血漿外泌體來源的miRNAs在MPA中的作用尚未見報道。本研究檢測MPA患者及健康志愿者血漿外泌體miRNAs表達(dá)譜，并分析2組研究對象差異表達(dá)的miRNAs（DF-miRNAs）及其功能，為進(jìn)一步揭示外泌體miRNAs與MPA發(fā)病機(jī)制的內(nèi)在聯(lián)系提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2018年1月至2019年8月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的MPA患者46例，男性14例，女性32例，平均年齡（67.8±11.2）歲。選取同期性別和年齡相匹配的健康志愿者54例，男性16例，女性38例，平均年齡（65.7±16.2）歲，臨床資料見表1。MPA患者根據(jù)2009年ACR分類標(biāo)準(zhǔn)和2012年Chapel-Hill共識會議分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，排除患有嚴(yán)重感染和并發(fā)癥的患者。所有血清學(xué)特征以MPO升高為主的AAV患者均符合MPA型血管炎臨床適應(yīng)癥的綜合判斷，包括病史、體格檢查、血清學(xué)檢查、活檢和血管造影。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（IRB2019-KY-147），患者知情同意。

表1 一般臨床資料［±s，例（%）］Tab.1 Clinical characteristics［±s，n（%）］

表1 一般臨床資料［±s，例（%）］Tab.1 Clinical characteristics［±s，n（%）］

Note：WBC.White blood cell；CRP.C-reactive protein；ESR.Sedimentation rate；BVAS.Birmingham Vasculitis Activity；ENT.Ear，nose and throat.

Items Number Age（year）Sex Female Male Hemoglobin（g/L）WBC（109 L-1）CRP（mg/L）ESR（mm/L）Creatinine（μmol/L）Ureaprotein（mg/24 h）MPO-ANCA（RU/ml）BVAS Organ involvement ENT Kidney Lung Central nervous system MPA 46 67.8±11.2 32 14 111.8±14.8 11.0±3.5 43.3±37.9 52.9±22.7 242.1±103.0 462.7±387.6 166.6±79.4 19.1±4.4 9（19.6）44（95.7）42（91.3）6（13.0）NC 54 65.7±16.2 38 16 134.2±4.6 6.3±2.9- - - - - - - - - -

1.1.2 主要試劑與儀器 BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；PVDF膜購自Millipore公司；鼠抗CD63購自Santa Cruz公司；兔抗TSG101購自Abcam公司；血漿外泌體總RNA提取試劑盒miRNeasy Micro Kit購自Qiagen公司；超速離心機(jī)購自Beckman公司；透射電子顯微鏡購自日立公司；在illumina HiSeqTM2500/MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有血漿樣品均取自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，采用含抗凝血劑EDTA的真空采血管收集全血，4℃靜置4 h，5 000 g離心5 min，-80℃儲存。

1.2.2 外泌體分離和純化 血漿依次離心（4℃），3 000 g離心15 min，6 000 g離心15 min，10 000 g離心30 min（重復(fù)1次），去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和聚集體。上清經(jīng)0.22μm無菌濾膜過濾，PBS稀釋，100 000 g、4℃超速離心70 min（重復(fù)1次），得到的沉淀即為外泌體，PBS重懸，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 透射電鏡進(jìn)行外泌體形態(tài)超微鑒定 外泌體懸浮液固定于銅網(wǎng)格上，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，4%乙酸鈾酰固定，透射電子顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot法檢測外泌體表面標(biāo)志物CD63和TSG101表達(dá) 提取血漿外泌體總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，12%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗鼠抗CD63、兔抗TSG101，4℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，檢測蛋白表達(dá)。

1.2.5 外泌體miRNAs表達(dá)及差異分析 從外泌體懸浮液中提取總RNA，按照miRNeasy Micro Kit試劑盒說明書操作，對提取樣本進(jìn)行RNA質(zhì)檢及高通量測序，并進(jìn)行定性和定量分析，統(tǒng)計各樣本中miRNAs表 達(dá)，采 用TPM（transcripts per million reads，TPM）進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理［11］。檢驗樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性。采用基于負(fù)二項分布的DESeq2分析2組中表達(dá)水平顯著差異的miRNAs，當(dāng)差異倍數(shù)（FC）絕對值＞2且P＜0.05時為差異顯著［12］。

1.2.6 DF-miRNAs靶基因預(yù)測及功能分析 為提高靶基因預(yù)測準(zhǔn)確性，采用miRanda、PITA和RNAhybrid軟件對DF-miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，并將3個軟件分析結(jié)果中均存在的靶基因定義為相應(yīng)miRNA的潛在靶基因。進(jìn)一步對獲得的DF-miRNAs靶基因進(jìn)行GO（Gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析［13-14］。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體鑒定 電鏡觀察顯示，超速離心分離獲得的血漿微囊泡為直徑30～100 nm的不規(guī)則球體，具有相對完整的脂質(zhì)雙分子膜（圖1A）。Western blot結(jié)果顯示，患者和健康志愿者血漿微囊泡均表達(dá)CD63和TSG101（圖1B）。提示超速離心法從血漿中獲得的微囊泡為外泌體。

圖1 血漿外泌體鑒定Fig.1 Identification of plasma exosomes

2.2 血漿外泌體來源RNA高通量測序及測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 采用illumina HiSeqTM2500/MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序，得到的原始數(shù)據(jù)文件分析轉(zhuǎn)化為測序序列（Raw reads），并對測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評估（圖2）。測序錯誤率分布檢查用于分析目的測序范圍（1～40個堿基）測序錯誤率異常的堿基位置。每個堿基位置的測序錯誤率低于0.5%為測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。結(jié)果顯示目的測序范圍內(nèi)，6個測序樣本測序錯誤率低于0.5%，表明測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

圖2 實驗樣本測序錯誤率分布Fig.2 Distribution of sequencing error rate of experimental samples

2.3 測序數(shù)據(jù)過濾 Clean reads是對Raw reads進(jìn)行處理后得到的干凈數(shù)據(jù)，后續(xù)統(tǒng)計分析均基于此數(shù)據(jù)。對Raw reads進(jìn)行處理是由于其含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，未經(jīng)過濾會影響信息分析質(zhì)量。miRNA長度集中于21～22個核苷酸，因此在各樣品的Clean reads中篩選了長度為21～22個核苷酸的小RNA（sRNA）進(jìn)行分析。經(jīng)sRNA長度分析篩選后，各樣本得到的總reads數(shù)為Total sRNA。樣本匹配到已知miRNA前體的sRNA個數(shù)為Mapped total sRNA，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 實驗樣本高通量測序數(shù)據(jù)匯總Tab.2 Summary of high-throughput sequencing data of experimental samples

2.4 篩選差異表達(dá)的miRNAs 根據(jù)差異表達(dá)miRNAs的整體分布，從FC值和P值2個水平進(jìn)行評估，篩選差異表達(dá)miRNAs，結(jié)果顯示，MPA組與健康對照組相比，32個血漿外泌體來源miRNAs表達(dá)水平有顯著差異，其中12個表達(dá)顯著上調(diào)，20個表達(dá)顯著下調(diào)（表3）。

表3 MPA患者血漿外泌體中差異表達(dá)的miRNAs（部分）Tab.3 Differentially expressed miRNAs in MPA-exo（part）

2.5 差異表達(dá)的miRNAs靶基因功能分析 MPA中表達(dá)上調(diào)的miRNAs組中，GO-BP分析顯示，差異表達(dá)的miRNAs靶基因功能與樹突發(fā)育調(diào)節(jié)、物質(zhì)運輸、細(xì)胞過程的正向調(diào)控等生物學(xué)過程相關(guān)；GOCC分析顯示，靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等細(xì)胞組分相關(guān)；GO-MF分析中靶基因功能主要與蛋白結(jié)合顯著相關(guān)（圖3A）。而在MPA中表達(dá)下調(diào)的miRNAs組中，GO-BP分析顯示，靶基因功能在單一生物學(xué)過程、細(xì)胞組分正向調(diào)控等方面富集；GO-CC分析表明靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與神經(jīng)、突觸部分相關(guān)；GO-MF分析中靶基因功能與蛋白域特異性結(jié)合、蛋白結(jié)合等密切相關(guān)（圖3B）。KEGG富集分析用于預(yù)測差異表達(dá)miRNAs的靶基因影響的信號通路，上調(diào)的miRNA靶基因主要富集于Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）信號通路、TNF信號通路、溶酶體和AMPK信號通路等（圖4A）。下調(diào)的miRNA靶基因主要參與代謝相關(guān)信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、胰島素信號通路及氨基酸生物合成等（圖4B）。

圖3 差異表達(dá)的miRNAs靶基因的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis for target genes of differentially expressed miRNAs

圖4 差異表達(dá)的miRNAs靶基因KEGG途徑分析Fig.4 KEGG pathway analysis for target genes of differentially expressed miRNAs

3 討論

本研究首次探究了MPA血漿中外泌體來源miRNAs的差異表達(dá)及其在病理機(jī)制中的潛在功能，通過超速離心分離得到MPA患者和健康志愿者的血漿外泌體并進(jìn)行鑒定，高通量測序分析發(fā)現(xiàn)MPA組與健康對照組相比，血漿外泌體有32個表達(dá)顯著差異miRNAs，進(jìn)一步對DF-miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測及其靶基因的功能分析，結(jié)果顯示MPA中差異表達(dá)的血漿外泌體miRNA可能在疾病代謝、免疫和炎癥方面發(fā)揮作用。

幾乎所有細(xì)胞都可以分泌外泌體，因此各種體液中都可以檢測到外泌體［15］。本研究通過超速離心法首次分離得到MPA患者血漿外泌體，并采用透射電鏡和Western blot法對外泌體進(jìn)行鑒定，超微形態(tài)學(xué)觀察和外泌體標(biāo)記蛋白CD63和TSG101檢測結(jié)果顯示，分離得到的細(xì)胞外微囊泡為外泌體。為進(jìn)一步研究MPA患者血漿外泌體miRNAs奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過高通量測序法檢測MPA和健康志愿者血漿外泌體miRNA表達(dá)譜并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2者差異顯著。MPA組有32個血漿外泌體來源miRNAs表達(dá)顯著改變，其中12個表達(dá)顯著上調(diào)，20個表達(dá)顯著下調(diào)。部分DF-miRNAs在多種疾病中發(fā)揮重要作用，如循環(huán)miR-103a-3p可通過SNRK/NFκB/p65調(diào)節(jié)軸促成血管緊張素II誘導(dǎo)的腎臟炎癥和纖維化；心力衰竭患者外泌體中miR-21-5p失調(diào)可影響其再生潛能；miR-150-5p通過靶向HMGA2和β-Catenin信號抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等［16-18］。但目前MPA的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，差異表達(dá)的miRNAs在MPA疾病過程中的作用鮮有報道，且外泌體來源miRNA在MPA中尚未見報道，有待進(jìn)一步研究。

GO分析用于注釋和推測差異表達(dá)的外泌體miRNAs可能涉及的生理功能。當(dāng)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因富含這些GOterms時，提示靶基因的功能與之相關(guān)。GOterms有3種基本分類，分別為生物學(xué)過程（biological process，BP），細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），從不同層面解釋目標(biāo)基因的生物學(xué)功能。MPA血漿外泌體來源的差異表達(dá)miRNA靶基因GO富集分析顯示，GO-BP分析中miRNA靶基因主要富集于細(xì)胞過程等生物學(xué)過程；GO-CC分析中miRNA靶基因主要富集于細(xì)胞內(nèi)和胞質(zhì)組分；GO-MF分析中miRNA靶基因主要富集于蛋白結(jié)合相關(guān)的分子功能。KEGG富集分析顯示，MPA患者血漿差異表達(dá)的miRNAs靶基因參與多個生物學(xué)途徑，其中，相關(guān)性最高的途徑為代謝途徑，且靶基因顯著富集于MAPK和TLR信號通路等。代謝、MAPK和TLR信號通路均參與MPA疾病發(fā)生發(fā)展過程。研究表明，代謝綜合征發(fā)病率在MPA患者中明顯提高，并與MPA患者促炎狀態(tài)和疾病復(fù)發(fā)顯著相關(guān)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK激活是MPO-ANCA抗原易位至細(xì)胞膜表面的關(guān)鍵步驟［20］。此外，AAV中，HMGB1可通過TLR增強(qiáng)MPO-ANCA誘導(dǎo)的NETs生成［21］。由此推測，MPA血漿外泌體差異表達(dá)miRNAs可能在該疾病代謝、炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究首次鑒定了MPA患者血漿外泌體中的差異表達(dá)miRNAs，通過生物信息學(xué)分析對差異表達(dá)miRNAs的潛在功能進(jìn)行預(yù)測，推測其可能在MPA代謝、炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，但差異表達(dá)miRNAs在MPA中作用的分子模式需進(jìn)一步研究。本研究拓寬了MPA病理機(jī)制研究的視野，為闡明MPA發(fā)病機(jī)制和尋找潛在治療靶點提供新方向。