基于免疫學(xué)機(jī)制探討Twist2上調(diào)與牙周炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系①

牛 羚 陳 雷 孫 琳 劉欣蔚 劉立峰（北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林132011）

牙周炎是一種常見可導(dǎo)致成人牙齒非正常脫落的重要疾病，是由革蘭氏陰性厭氧桿菌感染導(dǎo)致的牙齒慢性骨吸收病變［1］。感染后細(xì)菌持續(xù)廣泛地?fù)p傷牙周組織，隨時(shí)間推移，各種慢性病癥累積，出現(xiàn)牙齦出血、牙齦炎、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)甚至脫落等多種病癥，嚴(yán)重影響牙齒健康和生活質(zhì)量。目前，無(wú)論是藥物還是手術(shù)治療牙周炎多為對(duì)癥治療，無(wú)法實(shí)現(xiàn)牙周組織再生和修復(fù)。牙齒形成和維護(hù)是成骨與破骨的動(dòng)態(tài)平衡過程，牙周炎中炎癥環(huán)境抑制成骨細(xì)胞活動(dòng)，導(dǎo)致牙槽骨骨代謝平衡失調(diào)。Twist2是一種對(duì)骨骼發(fā)生和發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用的基因，通過抑制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)使其停滯于前成骨細(xì)胞階段，從而抑制骨形成［2-4］。Twist2表達(dá)于軟骨發(fā)育早期的成軟骨細(xì)胞和周圍間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用［4-5］。研究顯示，Twist2對(duì)人牙周韌帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化具有調(diào)節(jié)作用，而Twist2與牙周炎發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)尚未闡明，本研究通過模擬牙周炎炎癥環(huán)境對(duì)牙周膜細(xì)胞中Twist2表達(dá)狀況進(jìn)行檢測(cè)，初步探討Twist2與牙周炎的關(guān)系，以期為牙周炎發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制和的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牙周膜細(xì)胞及牙齒 牙周膜細(xì)胞均從門診收集的健康牙齒上刮取，所有牙齒為因正畸需要而拔除的15～25歲青年的健康恒磨牙。

1.1.2 主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、青霉素、鏈霉素、胎牛血（FBS）、Trizol試劑盒、qRT-PCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen）；轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京Transgen公司）；多聚甲醛（PFA）、細(xì)胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑（美國(guó)Sigma公司）；磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯色試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司）；PVDF膜（美國(guó)Milli Pore公司）；PCR檢測(cè)試劑盒（TaKaRa公司）；電泳儀（愛寶來(lái)濟(jì)南生物技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞獲取與培養(yǎng) 將磨牙牙根面用含雙抗的無(wú)菌PBS液反復(fù)沖洗，冠部采用75%酒精浸泡2 min，無(wú)菌條件下刮下牙根面1/3的牙周膜，無(wú)菌PBS液清洗，剪碎移至離心管，加入Ⅰ型膠原酶，37℃水浴消化20 min，終止消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mlα-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100μg/ml抗壞血酸、2 mmol/L谷胺酰胺，0.5μg/ml青-鏈霉素），將細(xì)胞吹勻后接種至6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)傳代。

1.2.2 LPS模擬體外炎癥環(huán)境 將傳代后生長(zhǎng)良好的牙周膜細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種至6孔板，加入α-MEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)至80%融合，去除原培養(yǎng)液，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入α-MEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含1μg/ml LPS的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)Twist2表達(dá) 將培養(yǎng)24 h的2組細(xì)胞于無(wú)菌環(huán)境下去除培養(yǎng)基，加入Trizol試劑完全裂解，提取總RNA，Nano DropRND-1000檢測(cè)RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照400 ng反轉(zhuǎn)10μl體系將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用qPCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以U6為內(nèi)參，引物由Invitrogen公司合成，序列如下：GAPDH F：5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3'（203 bp），R：5'-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3'；Twist2 F：5'-GCAAGAAGTCGAGCGAAGAT-3'（96 bp），R：5'-GCTCTGCAGCTCCTCGAA-3'。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Twist2蛋白表達(dá) 將牙周膜細(xì)胞裂解后離心收集上清，得到總蛋白，BCD法測(cè)定蛋白濃度。將樣品蛋白移入預(yù)制的聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃反應(yīng)過夜，PBST洗膜5次，加入二抗（1∶1 500），常溫?fù)u床孵育1 h，PBST快速洗滌10 min，反復(fù)3次，暗室中紅外線下發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，曝光、顯影、定影。掃描儀掃描膠片，目標(biāo)條帶灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白條帶光密度與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，加權(quán)處理后進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)Twist2 mRNA表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，1μg/ml LPS刺激24 h后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Twist2 mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05），LPS處理后形成的炎癥環(huán)境中Twist2 mRNA表達(dá)上調(diào)，炎癥牙周膜細(xì)胞中Twist2 mRNA升高為正常牙周膜細(xì)胞的3倍（圖1），說明Twist2 mRNA與牙周炎發(fā)生密切相關(guān)。

圖1 2組細(xì)胞中Twist2 mRNA表達(dá)Fig.1 Expression of Twist2 mRNA in two groups of cells

2.2 Western blot檢測(cè)Twist2蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，1μg/ml LPS刺激24 h后，與對(duì)照組組比，實(shí)驗(yàn)組Twist2蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），炎癥環(huán)境中Twist2蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01，圖2）。

圖2 Western blot檢測(cè)Twist2蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot to detect expression of Twist2 protein

3 討論

牙周炎是嚴(yán)重危害牙齒健康的慢性炎癥性口腔疾病，是由牙周致病菌引起的炎癥繼發(fā)性骨吸收病變。牙周炎引起的各種牙齒損傷嚴(yán)重影響患者咀嚼進(jìn)食，影響患者生活質(zhì)量［6］。牙周炎現(xiàn)有治療方法以抑制炎癥為主，無(wú)法實(shí)現(xiàn)牙周骨組織修復(fù)再生，治療結(jié)果不理想。牙周炎中炎癥發(fā)展破壞成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞所維持的骨代謝的平衡，成骨細(xì)胞生長(zhǎng)被各種炎癥因子抑制，導(dǎo)致基質(zhì)分泌礦化受阻。研究牙周炎牙槽骨吸收機(jī)制，尋找抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成的靶點(diǎn)對(duì)于防治牙周炎牙槽骨吸收具有重要意義。

Twist2是位于人2q37.3染色體、與真皮發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞因子［7-8］。Twist2對(duì)骨骼發(fā)育、真皮發(fā)育、腫瘤生成及轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用。，隨人成骨細(xì)胞分化水平進(jìn)展，Twist2 mRNA含量先增加后減少。研究顯示，成骨細(xì)胞系MC3T3在分化過程中Twist2表達(dá)下調(diào)，提高Twist2表達(dá)，骨鈣素（OC）和/或堿性磷酸酶（AP）含量下降，成骨細(xì)胞發(fā)育被抑制，停留于前成骨細(xì)胞階段，骨形成被抑制［5］。采用Jagged-1處理牙周韌帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HPDLs）分化后，Twist2 mRNA表達(dá)下調(diào)，而Notch通路靶基因hes-1、hey-1表達(dá)上升，HPDLs成骨增多，說明Twist2參與HPDLs分化調(diào)節(jié)過程［9］。本研究采用qRT-PCR和Western blot對(duì)正常牙周細(xì)胞和模擬炎癥環(huán)境中的牙周細(xì)胞中的Twist2 mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境中Twist2 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，說明Twist2與牙周炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其作用機(jī)制可能為由于炎癥及免疫細(xì)胞及因子刺激促進(jìn)Twist2表達(dá)，導(dǎo)致牙周組織中成骨細(xì)胞分化受抑制，成骨被抑制，破骨相對(duì)增加，二者平衡被打破，牙槽骨被吸收卻無(wú)法進(jìn)行成骨補(bǔ)充，導(dǎo)致牙根部破壞，甚至牙齒損毀脫失。本研究顯示，Twist2上調(diào)可能是牙周炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素，但未對(duì)其作用通路及機(jī)制進(jìn)行深入研究，其與牙周炎發(fā)生發(fā)展如何作用及作用靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，炎癥環(huán)境中Twist2表達(dá)上調(diào)，提示其與牙周炎發(fā)生發(fā)展中的骨吸收相關(guān)，可能成為抑制牙齒骨吸收或修復(fù)牙再生的靶點(diǎn)，為臨床防治牙齒脫落提供新思路。