沙眼衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白CT143保護小鼠抵抗衣原體生殖道感染①

楊春芬 廖文彥 任 林 唐雙陽 陳 慧 陸春雪（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，衡陽421001）

沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，Ct）是全球范圍內(nèi)細菌性性傳播疾病的首位病因［1］。其對抗生素治療敏感，但由于絕大多數(shù)生殖道感染患者起病隱匿，無明顯自覺癥狀而不能進行及時有效的治療，導(dǎo)致上行感染并引發(fā)盆腔炎、不孕不育等嚴重并發(fā)癥［2］。育齡期婦女是衣原體生殖道感染的高發(fā)人群，大量醫(yī)療費用被用于衣原體感染及相關(guān)并發(fā)癥的治療，因此全社會迫切呼吁有效的抗衣原體疫苗。Ct是嚴格真核細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細菌，根據(jù)其組織嗜性不同被劃分為4種生物型，包括主要感染人類眼結(jié)膜上皮細胞的沙眼生物型，引起人類泌尿生殖道上皮細胞感染的生殖道生物型，可引起全身性感染的性病淋巴肉芽腫生物型，及引起小鼠肺炎和生殖道感染的鼠生物型，即鼠衣原體（C.muridarum，Cm）［3］。由于Ct生殖道生物型感染的自然宿主為人，在小鼠體內(nèi)不能導(dǎo)致明顯的生殖道病變，而Ct鼠生物型（即Cm）陰道接種小鼠引起的上生殖道病變，如輸卵管炎、輸卵管積水、擴張和不孕等，與女性Ct生殖道生物型感染后的臨床病理過程極為相似，因此Cm小鼠生殖道感染模型被廣泛用于Ct致病機制及免疫學(xué)研究［4］。研究者已經(jīng)通過Cm感染的小鼠模型證實，Th1型細胞免疫應(yīng)答及細胞因子IFN-γ在抗衣原體感染過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5-6］。

本課題組前期從Ct D標準株D/UW-3/CX基因組成功擴增出Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeⅢsecretion systems，T3S）效應(yīng)蛋白CT143的全長編碼基因，并在原核系統(tǒng)實現(xiàn)高效表達及純化［7］，本實驗進一步采用小鼠Cm生殖道感染模型，初步評價CT143蛋白的疫苗保護性作用及相關(guān)的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雌性近交系BALB/c小鼠，體重18～22 g，動物許可證號：SYXK（湘）2020-0002，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，由南華大學(xué)實驗動物部飼養(yǎng)，相關(guān)實驗動物操作均符合南華大學(xué)實驗動物管理委員會的倫理學(xué)規(guī)定。

1.1.2 菌株及試劑 Cm標準株Nigg由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究保存；CT143蛋白由本研究所純化并保存；免疫佐劑CpG購自美國Pharmingen公司；小鼠血清抗體IgG及亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3檢測試劑盒購自上海生工生物工程公司；細胞因子IFN-γ和IL-5檢測試劑盒及Cy2標記的羊抗兔二抗均購自美國eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫小鼠 45只雌性BALB/c小鼠隨機分為CT143重組蛋白免疫組、CT143+CpG免疫組及CPG佐劑對照免疫組，15只/組。小鼠經(jīng)3%異氟醚輕度麻醉后，分別于第0天、第14天和第28天接受滴鼻免疫。CT143+CpG組小鼠每次免疫的CT143蛋白和CpG佐劑劑量分別為30μg和10μg，其他兩組小鼠僅接受CT143蛋白或CpG佐劑免疫。

1.2.2 血清抗體檢測 最后1次加強免疫后20 d，對小鼠（5只/組）實施安樂死，收集血液，分離血清，測量抗體水平。ELISA酶標板用重組CT143蛋白包被（1μg/孔），4℃吸附過夜。將血清從1∶100倍比稀釋至1∶12 800，加入反應(yīng)板孵育2 h、0.05%PBST洗滌3次后，以HRP標記的山羊抗小鼠總IgG為二抗，ABTS為顯色劑，酶標儀測定405 nm處吸光度（OD值）。將CT143免疫組及CT143+CpG免疫組的小鼠血清分別進行1∶800倍稀釋，進一步以HRP標記的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗體為二抗，檢測IgG亞類。

1.2.3 細胞因子檢測 最后1次加強免疫后20 d，對小鼠（5只/組）實施安樂死，收集脾臟，并制作單細胞懸液。用含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基RPMI1640調(diào)整脾細胞數(shù)為5×106個/ml，1 ml/孔加入24孔細胞培養(yǎng)板，以不加抗原的培養(yǎng)基（medium）、10μg BSA或10μg CT143抗原體外刺激3 d，收集上清，按照細胞因子IFN-γ和IL-5檢測試劑盒說明書，ELISA法檢測405 nm處OD值，根據(jù)制備的標準曲線，計算各樣本的細胞因子濃度，以ng/ml表示。

1.2.4 小鼠陰道感染及下生殖道脫落上皮的衣原體含量檢測 末次免疫后25 d，每只小鼠皮下注射2.5 mg Depo-provera，同步化月經(jīng)周期并增加小鼠對衣原體的易感性；5 d后，用20 ml衣原體溶液（含2×104IFUs）陰道感染小鼠。為檢測小鼠下生殖道脫落上皮細胞中的衣原體含量，每隔4 d取陰道拭子接種體外培養(yǎng)的單層HeLa細胞，37℃孵育24 h；細胞經(jīng)甲醛固定及透化處理后，以兔抗衣原體EB為一抗、Cy2標記的羊抗兔為二抗，熒光顯微鏡下計數(shù)衣原體包涵體形成單位（inclusion forming units，IFUs），將IFUs進行l(wèi)og10 IFUs對數(shù)轉(zhuǎn)換后，再計算每組在每個時間點的log10 IFUs均值及標準差。

1.2.5 小鼠上生殖道的病理評估 小鼠陰道感染衣原體60 d后進行安樂死，并分離完整生殖道（含陰道、子宮頸、子宮角、輸卵管及卵巢），拍照記錄后立即放入10%甲醛中固定。樣本經(jīng)石蠟包埋處理后，以5μm/張縱向連續(xù)切片（每切3次，保留1張）5張。切片經(jīng)H&E染色后，觀察其組織結(jié)構(gòu)及炎癥細胞浸潤情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用方差分析比較各組小鼠下生殖道脫落上皮的衣原體含量，用成對樣本的t檢驗比較組間的抗體水平及細胞因子水平，結(jié)果以±s表示。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗CT143特異性體液免疫應(yīng)答 CT143+CpG免疫組血清總IgG水平在各稀釋度下，均明顯高于不添加佐劑的CT143免疫組，CpG佐劑對照組不產(chǎn)生針對CT143的特異性抗體；在1∶800倍血清稀釋度下，CT143+CpG免疫組IgG2a的OD值為1.22±0.04，CT143免疫組IgG2a的OD值為0.43±0.03，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 免疫組小鼠血清抗CT143特異性IgG抗體滴度及亞類Fig.1 Titers and subclasses of anti-CT143 specific IgG antibody in serum of immunized group mice

2.2 CT143+CpG免疫組小鼠產(chǎn)生特異性Th1型細胞免疫應(yīng)答 如圖2所示，CT143+CpG免疫組小鼠脾細胞體外受CT143重組蛋白刺激，產(chǎn)生的Th1型細胞因子IFN-γ較CT143免疫組顯著升高，產(chǎn)生的Th2型細胞因子IL-5較CT143免疫組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CpG佐劑對照組脾細胞受CT143重組蛋白刺激后，其IFN-γ和IL-5分泌水平較刺激前無明顯變化。

圖2 各免疫組小鼠細胞因子IFN-γ和IL-5的產(chǎn)生Fig.2 Production of IFN-γand IL-5 in mice of each immunized group

2.3 CT143+CpG免疫組最早清除下生殖道感染的衣原體 小鼠陰道接種衣原體后，每隔4 d取陰道拭子，檢測拭子脫落上皮細胞中衣原體的含量，監(jiān)測下生殖感染的清除情況。感染后第4天，各組脫落細胞的衣原體含量均在1×105IFUs以上，高于陰道接種劑量，且各組間無顯著差異，提示各組小鼠感染較均一、衣原體成功定植下生殖道。感染后第12、16、20天，CT143免疫組和CT143+CpG免疫組檢出量較CpG佐劑對照組明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；感染后24 d，CT143+CpG免疫組的所有小鼠下生殖道脫落細胞均無衣原體檢出，而CT143免疫組及CpG免疫組持續(xù)排菌24 d或28 d以上（圖3）。

圖3 各免疫組小鼠感染衣原體后下生殖道脫落上皮中的衣原體含量Fig.3 Chlamydia titres in exfoliated epithelium of lower reproductive tract of immunized mice following Chlamydia challenge

2.4 CT143+CpG免疫組小鼠上生殖道病理改變最輕 肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，各組小鼠陰道、子宮頸、子宮角及卵巢均無明顯病變，但輸卵管出現(xiàn)不同程度的積水。其中CT143免疫組和CT143+CpG免疫組積水主要見于單側(cè)，且積水程度明顯低于CpG佐劑對照組。病變的輸卵管組織經(jīng)HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，CpG佐劑對照組管壁增厚，黏膜皺襞減少，頂部纖毛消失，伴有纖維組織增生及炎癥細胞浸潤；CT143+CpG免疫組小鼠輸卵管結(jié)構(gòu)較清晰，管腔稍有水腫，但炎癥細胞浸潤少，且皺襞及纖毛結(jié)構(gòu)完整；CT143免疫組的病理程度介于其他兩組之間（圖4）。

圖4 各免疫組小鼠感染衣原體后的上生殖道病理改變Fig.4 Pathological changes of upper reproductive tract of immunized mice following Chlamydia challenge

3 討論

Ct生殖道感染嚴重影響我國優(yōu)生優(yōu)育政策推行。Ct感染的臨床癥狀不典型，因此疫苗接種被認為是最理想的預(yù)防措施。然而到目前為止，仍無有效疫苗問世［8］。Ct全菌免疫可在一定程度上阻斷衣原體感染，但部分全菌接種患者在隨后的感染中，出現(xiàn)了更嚴重的免疫病理反應(yīng)，提示全菌疫苗包含致敏成分［9］。目前，Ct疫苗研究主要集中于亞單位疫苗，Ct主要外膜蛋白、包涵體膜蛋白IncA、Ct蛋白酶樣活性因子等亞單位疫苗免疫均能提供部分保護作用［10-12］。衣原體以原體形式感染，在宿主細胞包涵體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槭俭w，以始體形式增殖，最后轉(zhuǎn)變?yōu)樵w釋放，感染更多細胞。由于衣原體感染周期復(fù)雜，單一亞單位疫苗難以發(fā)揮全面保護作用，制備Ct聯(lián)合亞單位疫苗以期從黏附、定植、增殖、釋放等環(huán)節(jié)全面阻斷衣原體感染是疫苗研究的重要方向，尋找更多Ct疫苗候選抗原是衣原體研究的長期目標。

在與宿主細胞的相互作用過程中，許多革蘭陰性細菌依靠T3S將效應(yīng)蛋白輸送到真核宿主細胞。Ct在其整個發(fā)育周期中，也通過T3S實現(xiàn)效應(yīng)蛋白的跨包涵體膜及跨宿主細胞膜運輸。有些效應(yīng)蛋白，如TarP、CT694和TepP存在于Ct原體，在衣原體感染早期階段被輸送到宿主細胞，通過調(diào)節(jié)宿主機動蛋白骨架和破壞免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進衣原體侵入宿主細胞；有些效應(yīng)蛋白在Ct胞內(nèi)感染階段產(chǎn)生，而后被輸送并嵌入包涵體膜（Inc），干擾宿主細胞的細胞骨架動力學(xué)、囊泡和非囊泡運輸及死亡信號等；還有一類效應(yīng)蛋白被輸送至包涵體腔或宿主細胞漿，與衣原體的能量代謝、細胞蛋白泛素化和組蛋白甲基化等密切相關(guān)［13］。已有研究證實，Ct的T3S效應(yīng)蛋白IncA和Tarp為有效的疫苗候選抗原［11，14］。

大量研究證實，Th1型細胞免疫應(yīng)答及IFN-γ細胞因子在抗衣原體感染過程中發(fā)揮重要作用［5-6］。2008年，KARUNAKARAN等［15］采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從Cm感染的DC細胞成功篩選出8個T細胞抗原，其中包含TC0420（Ct143蛋白在Cm的同源物），提示CT143免疫可能激發(fā)Th1型細胞免疫應(yīng)答；2010年，WANG等［16］采用Ct全基因組編碼的抗原與99例女性生殖道Ct感染患者的血清反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)CT143蛋白能被50%以上的患者血清優(yōu)勢識別，進一步提示CT143具有良好的免疫活性。2017年，CUNHA等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CT143是Ct T3S的效應(yīng)蛋白，定位于包涵體腔，但其具體功能及是否有保護作用尚未見報道。

本研究采用原核表達并純化的CT143重組蛋白，聯(lián)合Th1型細胞免疫佐劑CpG經(jīng)滴鼻途徑免疫BALB/c小鼠，小鼠生殖道Cm感染模型評估CT143的對衣原體感染的保護性作用。研究發(fā)現(xiàn)，CT143+CpG免疫能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性IgG抗體，尤其是IgG2a亞類的抗體產(chǎn)量顯著高于CT143免疫組及CpG佐劑對照組。有文獻報道IgG2a不僅有體外抗衣原體作用，且體液免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的IgG亞類中，IgG2a血清含量高于IgG1常提示機體存在Th1型細胞免疫應(yīng)答［18］；CT143+CpG免疫組小鼠脾細胞體外受CT143蛋白刺激，產(chǎn)生的IFN-γ（Th1型）細胞因子水平顯著高于CT143不加佐劑組，而IL-5（Th2型）細胞因子水平顯著低于CT143不加佐劑組，進一步說明CT143聯(lián)合佐劑CpG免疫能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的Th1型細胞免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答保護小鼠快速清除下生殖道定植的衣原體。CT143免疫組小鼠感染Cm后12 d，陰道排菌量即與對照組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，且排菌時間明顯縮短。此外，CT143免疫還能顯著降低Cm導(dǎo)致的上生殖道病變，表現(xiàn)為輸卵管水腫減輕，炎癥細胞浸潤減少等，尤其是CT143聯(lián)合佐劑免疫組，輸卵管結(jié)構(gòu)清晰，管壁皺襞且纖毛結(jié)構(gòu)完整。

綜上所述，本研究采用Ct T3S效應(yīng)蛋白CT143聯(lián)合佐劑CpG滴鼻免疫小鼠，成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型細胞免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答能有效保護小鼠抵抗Cm的生殖道感染，免疫組小鼠下生殖道排菌量明顯降低，排菌周期縮短，上生殖道免疫病理減輕。本實驗結(jié)果為深入探討CT143蛋白的疫苗保護作用及衣原體聯(lián)合亞單位疫苗的研制提供了重要參考。