信號(hào)素6d（Sema6d）對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞天然免疫功能的影響及機(jī)制研究①

程玉潔 劉 娟（海軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所暨醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200433）

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）作為天然免疫和獲得性免疫的連接橋梁，在維持免疫穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。DC的數(shù)量、功能異常與炎癥性疾病、自身免疫性疾病等免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。鑒定DC分化發(fā)育和功能活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白對(duì)于深入了解免疫應(yīng)答的內(nèi)在規(guī)律、尋找免疫性疾病新型發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

不同的DC亞群及其不同的功能狀態(tài)在免疫應(yīng)答中發(fā)揮多樣化的調(diào)節(jié)作用［4］。外周未成熟DC（immature DC，imDC）在受到炎癥環(huán)境或抗原刺激下攝取抗原并加工為抗原肽，同時(shí)分泌IL-6、TNF等炎癥性細(xì)胞因子，在此過(guò)程中逐漸發(fā)育為成熟DC（mature DC，mDC），并在細(xì)胞膜表面趨化因子受體CCR7的相應(yīng)趨化因子配體19（chemokine ligand 19，CCL19）和趨化因子配體21（chemokine ligand 21，CCL21）的誘導(dǎo)下向次級(jí)淋巴結(jié)遷移，最終向T細(xì)胞提呈抗原肽，進(jìn)而活化T細(xì)胞反應(yīng)。DC攝取抗原后迅速啟動(dòng)遷移過(guò)程，并在后期及時(shí)終止，以保證機(jī)體在及時(shí)啟動(dòng)保護(hù)性免疫應(yīng)答的同時(shí)避免免疫反應(yīng)過(guò)度造成自我損傷［5］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA lnc-dpf3通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α途徑抑制CCR7依賴的DC遷移，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥性疾病的發(fā)生［6］。同時(shí)，也有文獻(xiàn)提示CCL19在DC凋亡過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用［7］。因此，需要進(jìn)一步探究體內(nèi)是否存在其他機(jī)制對(duì)DC成熟活化和遷移功能的平衡進(jìn)行精密調(diào)控，促使機(jī)體能夠及時(shí)清除病原體，同時(shí)避免不必要的炎癥損傷。

信號(hào)素家族為一類(lèi)含有共同胞外信號(hào)素結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，在神經(jīng)發(fā)育、骨骼形成、肝臟、腎臟等器官功能中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［8-13］。多個(gè)信號(hào)素家族成員在免疫系統(tǒng)發(fā)育及免疫細(xì)胞功能中可能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。比如，信號(hào)素4d能夠促進(jìn)DC活化并誘導(dǎo)T細(xì)胞啟動(dòng)免疫應(yīng)答［14］；信號(hào)素7a可通過(guò)整合素途徑活化T細(xì)胞以啟動(dòng)免疫應(yīng)答，同時(shí)通過(guò)整合素和絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)［15-16］。表達(dá)信號(hào)素6a分子的朗格漢斯細(xì)胞（langerhans cell，LC）在功能未成熟狀態(tài)時(shí)表達(dá)趨化因子受體CCR7并具有體內(nèi)遷移功能，提示信號(hào)素6a在抗原提呈細(xì)胞的天然免疫功能中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［17］。DC是體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，關(guān)于信號(hào)素6亞家族成員（Sema6a、6b、6c、6d）在其成熟、活化及遷移過(guò)程中具體發(fā)揮何種功能尚不清楚。因此，本研究通過(guò)篩選，獲得在CCL19/CCL21刺激后表達(dá)量顯著上調(diào)的信號(hào)素亞家族分子信號(hào)素6d（Semaphorins 6d，Sema6d），并探究該分子在DC成熟、活化和遷移中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為機(jī)體天然免疫應(yīng)答提供新的分子機(jī)制解釋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡C57BL/6J雄鼠，體重16～20 g，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk（滬）2018-0006，購(gòu)自上海西普爾-必凱公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 基礎(chǔ)培養(yǎng)基PRIM1640購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Biowest公司；重組小鼠CCL19、CCL21、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、IL-4購(gòu)自R&D公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、緩沖液購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB green購(gòu)自TaKaRa公司；紅細(xì)胞裂解液、流式抗體購(gòu)自BD公司；BCA試劑盒、顯影發(fā)光底物購(gòu)自Thermo Fisher公司；蛋白免疫印跡抗體購(gòu)自CST和Abcam公司；RNA Fast 2000試劑盒購(gòu)自飛捷公司；遷移孔板購(gòu)自康寧公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、蛋白酶抑制劑Cocktail、PMSF購(gòu)自Sigma公司；小干擾RNA由上海吉瑪公司合成；5×Loading buffer購(gòu)自生工公司；LSRFortessa流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）的培養(yǎng)及刺激 取6～8周齡雄鼠，頸椎脫臼處死，取股骨和脛骨骨髓組織，注射器反復(fù)吹打分散，過(guò)濾，離心獲得細(xì)胞沉淀，加入1 ml 1×紅細(xì)胞裂解液，混勻后靜置3 min破紅，加入2 ml 1×PBS終止破紅，3 000 r/min離心5 min，棄上清獲得細(xì)胞沉淀，加入18 ml細(xì)胞培養(yǎng)基（500 ml PRIM1640+50 ml胎牛血清+55μl 100 ng/μl GMCSF+11μl 50 ng/μl IL-4），充分混勻后均勻接種至6孔板。以培養(yǎng)當(dāng)天算作第0天，分別在第2和第4天每孔補(bǔ)充DC培養(yǎng)液1 ml，第5天加入LPS（100 ng/ml）刺激12 h促其成熟。

1.2.2 小RNA干擾 成熟細(xì)胞鋪板后，靜置2～3 h使其穩(wěn)定，3×105個(gè)細(xì)胞以100μl緩沖液+1μl小干擾RNA+3μl干擾用混合液，6×105個(gè)細(xì)胞以200μl緩沖液+2μl小干擾RNA+5μl干擾用混合液緩慢滴入。干擾24～48 h后檢測(cè)細(xì)胞天然免疫功能及信號(hào)通路活化。干擾RNA序列見(jiàn)表1。

表1 干擾RNA序列Tab.1 Interference RNA sequence

1.2.3 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，取13.5μl RNA、4μl MLV緩沖液、1μl脫氧核糖核苷三磷酸、1μl多聚胸腺嘧啶、0.5μl逆轉(zhuǎn)錄酶混勻，然后以72℃59 min，42℃15 min的PCR程序逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后加入60μl無(wú)菌水稀釋獲得cDNA。

1.2.4 熒光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR，qPCR）根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR，擴(kuò)增體系為每孔5μl滅菌水+10μl TBgreen+1μl目標(biāo)引物+4μl cDNA，PCR程序在quant studio flex7儀器上完成。以β-actin的循環(huán)數(shù)值作為背景并減去，2ΔCt公式計(jì)算獲得樣品的擴(kuò)增倍數(shù)。引物序列見(jiàn)表2。

表2 qPCR引物序列Tab.2 Primers used for qPCR

1.2.5 流式微球技術(shù)（cytometric bead array，CBA）根據(jù)CBA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞上清蛋白定量檢測(cè)。50μl細(xì)胞上清加入1μl捕獲微球和50μl檢測(cè)液，室溫避光結(jié)合1 h后加入1μl檢測(cè)微球和50μl檢測(cè)液，繼續(xù)室溫避光結(jié)合2 h后加入800μl洗液，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200μl 1×PBS，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell assay） 本實(shí)驗(yàn)在含有8μm孔徑聚碳酸酯過(guò)濾器的24孔遷移板進(jìn)行。提前30 min在遷移板下層室加入600μl 10%1640培養(yǎng)基，上層室加入100μl 10%1640培養(yǎng)基并于37℃孵箱預(yù)熱。將對(duì)照組和干擾組細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至100μl，培養(yǎng)基內(nèi)含有3×105個(gè)細(xì)胞，吸凈預(yù)熱用培養(yǎng)基后，下層室加入600μl 10%1640培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔，實(shí)驗(yàn)孔中加入CCL19和CCL21（50 ng/ml），對(duì)照孔不添加，在上層室加入細(xì)胞。37℃共孵育12 h后收集下層室細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200μl 1×PBS，流式細(xì)胞儀記錄1 min內(nèi)檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)量。以對(duì)照孔內(nèi)自發(fā)遷移的細(xì)胞數(shù)為背景，減去背景后得到遷移細(xì)胞數(shù)量。以對(duì)照組遷移數(shù)量為基礎(chǔ)值，實(shí)驗(yàn)組遷移數(shù)量除以基礎(chǔ)值得到實(shí)驗(yàn)組相對(duì)遷移比值。

1.2.7 Western blot

1.2.7.1 制備樣品 細(xì)胞干擾48 h后收集至1.5 ml離心管，3 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入100μl按比例配制的細(xì)胞裂解液，4℃振蕩裂解30 min后，12 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，在上清中加入20μl 5×loading buffer，10 min水浴煮沸制備。

1.2.7.2 免疫印跡 根據(jù)待檢測(cè)的蛋白分子量大小制備相應(yīng)濃度的電泳凝膠，取20μg蛋白樣品進(jìn)行電泳分離（80 V，室溫，3 h）、轉(zhuǎn)膜（300 mA，4℃，90 min）、封閉（5%BSA，室溫，2 h），孵育盒中加入按說(shuō)明書(shū)稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。次日以1×TBST，10 min×4次洗凈一抗后加入按說(shuō)明書(shū)稀釋的相應(yīng)二抗，室溫孵育1～2 h。孵育結(jié)束后，1×TBST，10 min×4次洗凈。參照顯影試劑盒說(shuō)明書(shū)配制顯影發(fā)光底物，將膜置于底物溶液中孵育，在顯影儀下曝光拍照。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞干擾24 h后收集至1.5 ml離心管，3 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入50μl 1×PBS和1μl相應(yīng)流式抗體，室溫避光結(jié)合20 min后加入1 000μl 1×PBS清洗，3 000 r/min離心5 min，棄上清后加入200μl 1×PBS上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用雙尾t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析差異顯著性，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，NS（not significant）表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL19/CCL21刺激12 h后信號(hào)素6d表達(dá)量改變 成熟DC鋪板后加入CCL19/CCL21刺激12 h，收集細(xì)胞并獲得cDNA后，qPCR檢測(cè)信號(hào)素6a、6b、6c和6d mRNA水平變化。結(jié)果顯示，經(jīng)CCL19/CCL21刺激后，信號(hào)素6a和信號(hào)素6c表達(dá)量無(wú)明顯變化，信號(hào)素6b表達(dá)下調(diào)，信號(hào)素6d表達(dá)上調(diào)（圖1）。提示趨化因子配體刺激后可誘導(dǎo)信號(hào)素6d分子表達(dá)量上調(diào)。因此，鎖定信號(hào)素6d為目標(biāo)研究分子。

圖1 DC在CCL19/CCL21刺激12 h后信號(hào)素6d表達(dá)上調(diào)Fig.1 Expression of Sema6d in DC was up regulated after stimulation of CCL 19/CCL21 for 12 h

2.2 干擾信號(hào)素6d對(duì)DC膜表面標(biāo)志物和凋亡功能的影響 以小RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究信號(hào)素6d功能。成熟DC分別使用si-NC和si-Sema6d干擾36 h并獲得cDNA，qPCR檢測(cè)信號(hào)素6d mRNA水平表達(dá)量變化結(jié)果顯示，si-Sema6d處理后信號(hào)素6d表達(dá)量著下調(diào)，表明信號(hào)素6d被有效干擾（圖2A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC干擾信號(hào)素6d分子24 h后膜表面標(biāo)志物以明確該分子是否影響細(xì)胞成熟、活化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，干擾組DC膜表面標(biāo)志物CD11c、CD40、CD86和CD80無(wú)明顯差異（圖2B）。同時(shí)檢測(cè)成熟DC干擾信號(hào)素6d分子24 h并使用CCL19/CCL21刺激12 h后的凋亡標(biāo)志物。結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡標(biāo)志無(wú)明顯變化（圖2C）。以上結(jié)果提示，信號(hào)素6d對(duì)細(xì)胞膜表面成熟標(biāo)志物及凋亡功能無(wú)明顯影響。

圖2 信號(hào)素6d干擾后DC膜表面成熟標(biāo)志物和凋亡功能無(wú)變化Fig.2 Expression of surface markers and apoptosis function did not change after Sema6d interference in DC

2.3 干擾信號(hào)素6d對(duì)DC天然免疫功能的影響qPCR和流式微球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)干擾信號(hào)素6d 36 h并LPS刺激12 h后細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量變化，同時(shí)通過(guò)體外遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移功能變化。結(jié)果顯示，信號(hào)素6d干擾后炎癥因子表達(dá)上調(diào)（圖3A），而遷移功能下調(diào)（圖3B）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，信號(hào)素6d分子在成熟DC中發(fā)揮抑制炎癥因子分泌，同時(shí)促進(jìn)趨化因子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移作用。

圖3 信號(hào)素6d干擾后對(duì)DC天然免疫功能的影響Fig.3 Effect of Sema6d interference on DC innate immune function

2.4 干擾信號(hào)素6d對(duì)MAPK和NF-kB信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)MAPK通路和NF-κB通路相關(guān)信號(hào)蛋白在細(xì)胞干擾48 h，并分別以LPS或CCL19/CCL21刺激不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。結(jié)果顯示，干擾信號(hào)素6d后，LPS刺激后的MAPK信號(hào)蛋白pp38和p-Erk表達(dá)下調(diào)，而NF-κB信號(hào)蛋白p-p65表達(dá)上調(diào)，提示信號(hào)素6d分子可能通過(guò)抑制p-p65的活化發(fā)揮抑制LPS刺激的炎癥因子分泌的功能。而在干擾信號(hào)素6d后，CCL19/CCL21刺激的p-p38、p-Erk及p-p65表達(dá)均下調(diào)，提示信號(hào)素6d分子能夠廣泛促進(jìn)細(xì)胞遷移信號(hào)觸發(fā)的MAPK及NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化（圖4）。以上結(jié)果提示，信號(hào)素6d分子對(duì)LPS或CCL19/CCL21刺激的MAPK和NFκB信號(hào)通路發(fā)揮差異化調(diào)控作用。

圖4 信號(hào)素6d干擾后對(duì)MAPK和NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Sema6d interference on expressions of key molecules of MAPK and NF-κB signaling pathways

3 討論

信號(hào)素6d分子在調(diào)控帕金森疾病、心臟疾病及急性腎損傷過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，并被發(fā)現(xiàn)是骨肉瘤及三陰性乳腺癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)［18-20］。但該分子在免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚。本研究證實(shí)信號(hào)素6d分子在天然免疫中具有重要調(diào)控作用。CCL19和CCL21刺激可誘導(dǎo)信號(hào)素6d表達(dá)量著上調(diào)，上調(diào)的信號(hào)素6d分子能夠反饋性地抑制脂多糖引發(fā)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)趨化因子介導(dǎo)的細(xì)胞遷移。因而，信號(hào)素6d分子促使免疫系統(tǒng)在受到病原體刺激后能夠抑制過(guò)度的炎癥因子分泌，同時(shí)及時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞遷移，是DC實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)控、維持免疫平衡的重要分子。

代謝調(diào)控作為一種動(dòng)態(tài)精準(zhǔn)的胞內(nèi)調(diào)控方式得到廣泛關(guān)注。已有研究證實(shí)了胞內(nèi)糖酵解途徑在DC的炎癥反應(yīng)及遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［21］。近期研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路在信號(hào)素6d調(diào)控巨噬細(xì)胞的抗炎極化和脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用［22］。本課題組發(fā)現(xiàn)，信號(hào)素6d分子在DC中能夠促進(jìn)CCL19/CCL21刺激后的p-p65活化，抑制LPS刺激后的p-p65信號(hào)活化。信號(hào)素6d分子是否通過(guò)影響胞內(nèi)代謝通路活化，或借助某些代謝產(chǎn)物的改變發(fā)揮影響DC的天然免疫信號(hào)及活化和遷移功能仍有待進(jìn)一步研究。

CCL19/CCL21與DC膜表面趨化因子受體相結(jié)合以觸發(fā)細(xì)胞遷移。信號(hào)素6d通過(guò)何種方式調(diào)控趨化因子受體與配體間介導(dǎo)的信號(hào)通路活化以實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞遷移的功能尚不明確。文獻(xiàn)提示信號(hào)素家族的信號(hào)素結(jié)構(gòu)域通過(guò)與叢狀蛋白受體結(jié)合參與誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞質(zhì)膜上的重組并促進(jìn)細(xì)胞遷移［23］。信號(hào)素6d是否依賴叢狀蛋白受體影響趨化因子受體內(nèi)化及下游信號(hào)激活，是否通過(guò)其信號(hào)素結(jié)構(gòu)域影響細(xì)胞骨架系統(tǒng)重塑，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了信號(hào)素6d分子在DC天然免疫功能中的重要調(diào)控作用，揭示了免疫平衡的新型調(diào)控機(jī)制，可能為DC功能紊亂相關(guān)炎癥性疾病、自身免疫性疾病提供新型機(jī)制揭示和潛在防治靶標(biāo)。