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    干旱和UV-B輻射脅迫及其互作對白沙蒿抗性生理的影響

    2021-08-21 02:32:18韓曉栩趙媛媛張麗靜郭丁傅華李永善楊成新
    草業(yè)學報 2021年8期
    關鍵詞:白沙類黃酮不飽和

    韓曉栩,趙媛媛,張麗靜,郭丁,傅華,李永善,楊成新

    (1.蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室,蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室,蘭州大學草地農業(yè)科技學院,甘肅 蘭州730020;2.內蒙古自治區(qū)孿井灘氣象站,內蒙古 嘉爾嘎勒賽漢鎮(zhèn)750312;3.內蒙古自治區(qū)阿拉善盟草原工作站,內蒙古 巴彥浩特750306)

    據統(tǒng)計,全球干旱半干旱地區(qū)占陸地面積的45%以上[1]。干旱程度正隨著全球氣候的變暖而加劇,面積也正在以較快速度擴大[2]。干旱是影響植物生長和發(fā)育的重要因子。與此同時,由臭氧層損耗引起的UV-B輻射增加已經成為全球性的環(huán)境問題[3],植物對UV-B輻射增強的反應將是未來幾十年的重要問題[4]。在干旱地區(qū),UV-B輻射和干旱是常見的脅迫因子且常同時發(fā)生,因此植物對二者復合脅迫的適應機制受到廣泛關注[5-6]。

    干旱和UV-B復合脅迫會在植物中引起協(xié)同或拮抗作用。干旱和UV-B輻射復合脅迫可加劇單一脅迫造成的損傷:與干旱脅迫相比,復合脅迫使滇楊(Populusyunnanensis)植株變矮、葉面積和總生物量下降[7];添加UV-B輻射使干旱脅迫對長須銀柴胡(Stellaria longipes)葉面積和干物質積累的抑制作用增強[8]。與之相反,大量研究表明干旱和UV-B復合脅迫可緩解單一脅迫造成的損傷:復合脅迫可增加葉角質層厚度,減少UV-B輻射在葉內的滲透,同時減少蒸騰失水[9];增加光合色素合成,提高光合速率,促進光合作用[10];誘導大量酚類和類黃酮等紫外吸收物質和脯氨酸等滲透調節(jié)物質產生[3],抗氧化酶系統(tǒng)活性增加[11],清除細胞內活性氧自由基、減輕膜脂過氧化[12]。目前,干旱與UV-B輻射復合脅迫的相關研究主要集中在表型、光合作用及抗氧化能力等方面。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)會造成膜脂過氧化,從而降低植物抗逆性[13]。有研究表明類黃酮可抑制脂氧合酶活性[14],但目前在干旱和UV-B復合脅迫中類黃酮是否可通過抑制LOX活性減輕膜脂過氧化,從而緩解膜損傷尚不清楚。通過改變不飽和脂肪酸水平來調節(jié)膜流動性,是植物抵抗非生物脅迫的特征之一[15]。在單獨干旱[16]和UV-B輻射[17]脅迫中,脂肪酸含量、組成以及不飽和度均發(fā)生變化,但目前關于植物脂肪酸含量、組成以及不飽和度在干旱和UV-B復合脅迫中的變化尚無報道,關于不飽和脂肪酸在植物抵抗干旱和UV-B輻射復合脅迫中的作用尚不清楚。

    近年來,荒漠植物對干旱和UV-B輻射獨特的適應性及其應對策略受到廣泛關注[18-19]。白沙蒿(Artemisia sphaerocephala),菊科蒿屬,多年生半灌木,廣泛分布于中國西北的甘肅、寧夏、陜西、新疆以及內蒙古地區(qū)[20],是流動沙丘和半流動沙丘上最重要的先鋒固沙植物之一,對維持荒漠生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性具有特殊意義[21]。本試驗模擬荒漠生境,探究干旱和UV-B輻射脅迫及其互作對白沙蒿幼苗生長、次生物質類黃酮代謝、脂肪酸代謝的影響,以探究白沙蒿在荒漠條件下的適應機理,為荒漠生態(tài)系統(tǒng)的恢復與治理提供科學依據。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試植物材料為2014年9月采自阿拉善的白沙蒿種子。白沙蒿種子種于混合土(灰鈣土∶細砂=2∶1)中,試驗于溫室(晝夜溫度:25℃/12℃;光周期:16 h/8 h;光合有效輻射:150 mol·m-2·s-1;相對濕度:30%)內進行,出苗30 d后,進行間苗,每盆留長勢一致的白沙蒿幼苗1株,開始進行脅迫處理。

    1.2 干旱和UV-B輻射處理

    處理分為對照(control,CK)、干旱(drought,D)處理、UV-B輻射(UV-B radiation,U)處理以及干旱和UV-B輻射復合(D+U)處理,每處理設10個重復。土壤含水量以田間最大持水量(測得為25.5%)為根據。CK處理,土壤含水量為田間持水量的78%,輻射量為0μW·cm-2;D處理,土壤含水量為田間持水量的45%,輻射量為0μW·cm-2;U處理,土壤含水量為田間持水量的78%,輻射量為15.95μW·cm-2;D+U處理,土壤含水量為田間持水量的45%,輻射量為15.95μW·cm-2。處理過程中使用稱重法控制盆中土壤含水量。使用40 W UV-B燈管(北京電光源研究所,中國)模擬UV-B輻射。UV-B輻射強度用UV-B輻照計(北京師范大學光電儀器廠,中國)測定。UV-B照射時間為每日固定2 h。處理21 d后取樣進行測定。

    1.3 測定指標及方法

    隨機選取完整新鮮葉,使用便攜式葉面積掃描儀(AM 2000E,英國)測定葉面積,用精確度為0.01 m的直尺測量株高,即白沙蒿幼苗基部至最頂端的距離。將植株的根、莖、葉分別在105℃條件下快速殺青30 min,然后在85℃條件下連續(xù)烘干48 h直至恒重并稱重獲得其干物質量。

    使用稱重法測定葉的相對含水量(relative water content,RWC)[22]。使用浸泡法測定葉的相對電導率(relative electric conductivity,REC)[23]。

    使用植物脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)活性試劑盒(蘇州科銘生物有限公司,中國)進行LOX活性測定;使用硫代巴比妥酸法進行丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定[24]。根據Liu等[25]的方法測定白沙蒿葉的類黃酮含量;使用植物苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)酶聯免疫分析試劑盒、植物查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)酶聯免疫分析試劑盒以及植物查爾酮異構酶(chalcone isomerase,CHI)酶聯免疫分析試劑盒(南京森貝伽生物有限公司,中國)對3種酶含量進行測定。

    參照楚秉泉等[26]的方法提取脂肪酸,使用GC-MS氣質聯用法對脂肪酸組成及含量進行測定。

    按照UNIQ-10柱式Trizol RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司,中國)說明書方法提取白沙蒿葉RNA。使用Prime-Script RT-PCR Kit試劑盒(Takara,中國)將RNA反轉錄為cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq Kit試劑盒(Takara,中國)在實時定量PCR儀(BIO-RAD,美國)上進行qRT-PCR。重復3次,以UBC9作為內參基因[27],用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

    1.4 數據分析

    使用Microsoft Excel 2019對原始數據進行整理,使用SPSS 20.0軟件進行方差分析(Duncan,P<0.05),使用Microsoft Excel 2019和Microsoft Office PowerPoint 2019制圖。

    2 結果與分析

    2.1 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿幼苗生長的影響

    D和U處理下,白沙蒿幼苗生長均受到抑制,生物量均顯著降低(P<0.05);D+U處理后,此種抑制有所緩解,葉、莖、根重及總生物量較D處理顯著升高(P<0.05),為U處理的1.19、1.08、1.12和1.12倍(表1)。3個處理根冠比與CK均無顯著差異(表1)。D和U處理白沙蒿幼苗株高和葉面積均顯著降低,D+U處理株高分別為D和U處理的1.14和1.09倍,葉面積分別為D和U處理的1.69和1.16倍(表1)。

    表1 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿幼苗生長的影響Table 1 Effect of growth indices on A.sphaerocephala seedlings treated with drought and UV-B radiation acting individually and in combination

    D和U處理白沙蒿葉RWC顯著低于CK,D+U處理RWC分別為D和U處理的1.09(P<0.05)和1.03倍(圖1)。

    圖1 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉相對含水量的影響Fig.1 Effect of RWC on A.sphaerocephala leaves treated with drought and UV-B radiation acting individually and in combination

    2.2 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿膜脂氧化損傷的影響

    各處理REC含量均顯著高于CK,D+U處理分別為D和U處理的89.58%和84.61%(P<0.05)(圖2)。D處理MDA含量為CK的1.65倍(P<0.05),U處理與CK無顯著差異,D+U處理為D處理的66.79%(P<0.05),與U處理無顯著差異。D處理LOX活性為CK的3.69倍(P<0.05),U處理與CK無顯著差異。D+U處理可緩解D處理引起的LOX活性升高,D+U處理為D處理的44.00%(P<0.05),與U處理無顯著差異。

    圖2 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉相對電導率、丙二醛含量和脂氧合酶活性的影響Fig.2 Effect of REC,MDA content and LOX activity on A.sphaerocephala leaves treated with drought and UV-B radiation acting individually and in combination

    2.3 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉次生物質類黃酮代謝的影響

    D和U處理白沙蒿葉類黃酮含量分別為CK的1.25和1.37倍(圖3),D+U處理較D和U處理進一步提高,分別為其1.57和1.40倍(P<0.05)。

    圖3 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉類黃酮含量及其合成途徑中關鍵酶的影響Fig.3 Effect of flavonoids content and key enzymes in its synthesis pathway on A.sphaerocephala leaves treated with drought and UV-B radiation acting individually and in combination

    各處理白沙蒿葉PAL、CHS含量均顯著高于CK(P<0.05),D+U處理PAL含量分別為D和U處理的1.06和1.77倍(P<0.05);D+U處理CHS含量分

    別為D和U處理的94.83%和93.26%。與CK相比,D和U處理均引起CHI含量顯著下降(P<0.05),D+U處理分別為D和U處理的1.60和1.87倍(P<0.05)。

    2.4 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉脂肪酸代謝的影響

    2.4.1 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉脂肪酸組成及含量的影響 白沙蒿葉6種主要脂肪酸分析結果表明,3種飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA):棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、花生酸(C20:0),占總脂肪酸25.24%;3種不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA):油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3),占總脂肪酸74.76%(表2)。

    表2 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉脂肪酸組成及含量的影響Table 2 Effect of fatty acid composition and content on A.sphaerocephala leaves tr eated with dr ought and UV-B r adiation acting individually and in combination(%)

    D和U處理均造成SFA上升,分別為CK的1.09(P<0.05)和1.01倍;UFA下降,為CK的97.11%(P<0.05)和99.51%。UFA中,D處理C18:1、C18:2和C18:3含量分別為CK的1.19倍、80.95%和1.07倍(P<0.05);U處理C18:1、C18:2和C18:3含量分別為CK的2.77倍、1.10倍和79.12%(P<0.05)。D+U處理C18:1、C18:2和C18:3含量分別為D處理的80.05%、1.19倍和94.07%,為U處理的34.28%、87.81%和1.27倍(表2)。D處理不飽和脂肪酸指數(index of unsaturated fatty acid,IUFA)與CK相比無顯著差異,U處理為CK的91.96%(P<0.05),D+U處理與CK和D處理無顯著差異,為U處理的1.08倍(P<0.05,表2)。

    2.4.2 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉不飽和脂肪酸合成途徑中關鍵基因的影響 脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2,FAD2)和FAD6通過去飽和作用促使C18:1合成C18:2,FAD3和FAD7/8則促使C18:2合成C18:3[28]。D處理FAD2基因表達量與CK無顯著差異,FAD3基因不表達(圖4,5);FAD7/8和FAD6基因表達量分別是CK的2.22和2.69倍。U處理FAD2和FAD3基因表達量分別為CK的29.08和4.28倍;FAD6和FAD 7/8基因表達量與CK無顯著差異。D+U處理FAD2與D處理無顯著差異,為U處理的11.61%;FAD3基因表達量為U處理的44.16%(P<0.05);FAD6基因表達量分別為D和U處理的14.50%和37.86%(P<0.05);FAD7/8與D處理無顯著差異,為U處理的2.38倍(P<0.05)(圖4)。

    圖4 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿葉中FAD基因表達的影響Fig.4 Effect of FAD gene expression on A.sphaerocephala leaves treated with drought and UV-B radiation acting individually and in combination

    3 討論

    本研究發(fā)現,D和U處理均造成白沙蒿幼苗葉、莖、根生物量及總生物量積累減少、株高和葉面積降低;D+U處理下,單一脅迫引起的生長抑制得到有效緩解,上述指標較單一脅迫均有所增加(表1)。這一結果與大量研究一致,干旱和UV-B復合脅迫可增加光合色素合成、提高光合速率、促進光合作用,增加抗氧化酶系統(tǒng)活性、清除細胞內活性氧自由基,從而緩解單一脅迫引起的生物量下降[10-12]。本研究中,D和U處理白沙蒿葉的REC分別為CK的1.40和1.48倍(圖2),表明干旱和UV-B輻射單獨脅迫造成的膜損傷可能是造成白沙蒿生物量下降的重要原因之一;D+U處理下,REC分別為D和U處理的89.58%和84.61%(圖2),表明干旱和UV-B輻射復合脅迫緩解了其在單一脅迫下受到的膜損傷。

    干旱和UV-B輻射復合脅迫對自由基代謝、紫外吸收物質、抗氧化系統(tǒng)等方面均會造成影響。其中,類黃酮作為抗氧化物質和紫外吸收物質,在響應干旱和UV-B輻射時均在葉中大量積累,從而保持植物氧化還原平衡,并減少UV-B輻射的滲透[29]。本研究D和U處理類黃酮含量分別為CK的1.25和1.37倍,這與對大麥(Hordeum vulgare)、萵苣(Lactuca sativa)、蒙古蕕(Caryopteris mongolica)的研究結果一致[30-32]。PAL、CHS、CHI是類黃酮合成途徑中的3種關鍵酶,其會隨脅迫程度加重以及多種脅迫復合而增加[33-34]。本研究中,D和U處理白沙蒿PAL和CHS含量分別為CK的2.09、1.35倍和1.58、1.61倍,二者與D和U處理下類黃酮含量增加一致,而CHI含量為CK的90.41%、77.14%(圖3),表明UV-B輻射和干旱單獨脅迫下,PAL和CHS可能起主要作用。本研究中,復合脅迫下PAL和CHI含量在D和U處理下顯著升高(圖3),與D+U處理白沙蒿類黃酮含量顯著高于D和U處理的結果一致,表明復合脅迫下PAL和CHI含量增加是復合脅迫下類黃酮增加的主要原因。

    LOX會產生氫過氧化合物,造成膜脂過氧化。研究表明類黃酮含量達到一定數值時,其能夠抑制LOX活性,從而降低膜脂過氧化[14]。本研究中,與CK相比,D和U處理均造成白沙蒿類黃酮含量升高,但U處理LOX活性和MDA含量無顯著變化,D處理LOX活性和MDA含量分別為CK的3.25和1.65倍(P<0.05)(圖2和圖3)。上述結果表明,U處理白沙蒿類黃酮含量升高,使LOX活性保持與CK相當的水平,未造成膜脂過氧化產物MDA含量升高;D處理雖然類黃酮含量顯著高于CK,但這一抑制現象并未體現,推測類黃酮含量需要達到一定閾值才能對LOX活性具有抑制作用,而干旱脅迫下LOX活性上升是其造成白沙蒿膜損傷的重要原因。D+U處理下類黃酮含量進一步提高,分別為D和U處理的1.57和1.40倍(P<0.05),LOX活性和MDA含量分別為D處理的44.00%和66.79%(P<0.05),但均與U處理無顯著差異(圖2和圖3)。上述結果表明,D+U處理類黃酮進一步增加導致LOX活性降低,緩解了干旱引致的膜脂過氧化,MDA含量減少,這種抑制也存在于大豆(Glycine max)中[35]。類黃酮含量的提高,且其對LOX活性的抑制作用是干旱和UV-B復合脅迫下緩解白沙蒿膜損傷的重要原因之一。

    脂肪酸是生物膜的主要組分,其不飽和度升高可以增加細胞膜的流動性,從而維持生物膜基本功能和細胞生命活動,提高植物的抗逆性。植物抗旱性以及耐UV-B輻射能力與其脂肪酸不飽和度密切相關:干旱脅迫下,葡萄(Vitis vinifera)、馬尼拉草(Zoysia matrella)可維持高水平的脂肪酸不飽和度,提高膜流動性,維持膜正常功能[36-37];UV-B輻射下,黃瓜(Cucumis sativus)UV-B不敏感品種的不飽和脂肪酸水平高于敏感品種[38]。脂肪酸不飽和度可用IUFA來衡量,值越大則不飽和程度越高[16,39]。本研究中,與CK相比,D處理IUFA無顯著差異,U處理C18:1、C18:2、C18:3含量和IUFA分別為CK的2.77倍、1.10倍、79.12%和91.96%(P<0.05)(表2)。上述結果表明,干旱脅迫下白沙蒿脂肪酸不飽和度保持了與CK相當的水平,膜流動性未受到影響,而U處理由于C18:3含量顯著下降,導致IUFA顯著下降,UV-B輻射下白沙蒿脂肪酸不飽和度下降導致膜流動性下降是其造成白沙蒿膜損傷的重要原因。D+U處理IUFA與D處理無顯著差異;D+U處理C18:1、C18:2、C18:3含量和IUFA為U處理的34.28%、87.81%、1.27倍和1.08倍(P<0.05)(表2),表明D+U處理提高C18:3含量導致IUFA升高,緩解了UV-B輻射引致的脂肪酸不飽和度下降。脂肪酸不飽和度上升恢復膜流動性是干旱和UV-B復合脅迫下緩解白沙蒿膜損傷的重要原因之一。

    FAD是不飽和脂肪酸合成途徑的關鍵酶,調控脂肪酸的不飽和程度[28]。干旱、鹽、病原菌等眾多脅迫中,植物通過調節(jié)FAD基因表達水平從而維持脂肪酸不飽和程度的適應機制受到廣泛關注[40]。本研究對干旱、UV-B輻射及其復合脅迫下FAD基因表達水平進行研究發(fā)現,D處理FAD2基因表達量與CK無顯著差異,FAD3基因不表達;FAD 7/8和FAD6基因表達量分別是CK的2.22倍和2.69倍(圖4),C18:3含量為CK的1.07倍(表2),表明FAD7/8和FAD6的上調表達,是D處理C18:3含量上升導致IUFA無顯著變化的主要原因,這與對轉LeFAD7基因番茄(Lycopersicon esculentum)的研究結果一致[41]。U處理FAD2和FAD3基因表達量分別為CK的29.08和4.28倍,FAD6和FAD7/8基因表達量與CK無顯著差異(圖4),C18:2和C18:3含量為CK的1.10倍和79.12%,表明U處理C18:2含量上升和C18:3含量下降可能是由于FAD3基因表達量上調倍數遠小于FAD2基因,造成C18:1向C18:2的轉化程度比C18:2向C18:3的轉化程度更活躍。D+U處理FAD2、FAD3和FAD6基因表達量下降,為U處理的11.61%,44.16%和37.86%(P<0.05),而FAD7/8基因表達量為U處理的2.38倍(P<0.05)(圖4),表明干旱和UV-B復合脅迫下白沙蒿通過誘導FAD7/8上調表達,促使C18:3顯著上升,造成IUFA上升(圖5)。

    圖5 干旱和UV-B輻射及其互作對白沙蒿類黃酮和脂肪酸代謝的影響Fig.5 Effects of drought and UV-B radiation on flavonoid metabolism and fatty acid metabolism in A.sphaerocephala

    4 結論

    干旱造成LOX活性增加從而引發(fā)膜脂過氧化,UV-B輻射誘導FAD2表達水平增加從而降低IUFA,單一脅迫下造成的膜損傷是導致白沙蒿生物量減少的重要原因。干旱和UV-B輻射復合脅迫通過增加類黃酮含量抑制LOX活性和提高FAD 7/8表達水平增加IUFA,二者間的互作緩解了白沙蒿在單一脅迫下受到的膜損傷(圖5)。

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