添加單寧酸對(duì)青貯葛藤有氧穩(wěn)定性和霉菌毒素含量的影響

楊冬梅，李俊年，陶雙倫

（吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首416000）

葛藤（Pueraria lobata）為蝶形花科葛藤屬，是多年生藤本植物。葛藤再生能力強(qiáng)，枝繁葉茂，每年藤蔓可伸長(zhǎng)10 m以上，每年可刈割3~4次，葛藤鮮草產(chǎn)量5萬(wàn)~6萬(wàn)kg·hm-2。葛藤莖葉中粗蛋白含量為20.89%~29.20%［1-2］。同時(shí)，葛藤中所含葛根素、黃酮、甙元等生物活性物質(zhì)，可提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，具有促進(jìn)性腺、生殖功能、副性器官的發(fā)育和第二性征出現(xiàn)的作用，能緩解和防治由應(yīng)激原引起的應(yīng)激綜合癥［3］。我國(guó)西南地區(qū)各省均在大力推廣種植葛藤，生產(chǎn)葛粉，附加產(chǎn)生的大量葛藤莖葉，是牛羊的最佳飼料［4-5］。但西南地區(qū)氣候潮濕，晾曬的牧草易發(fā)霉變質(zhì)，進(jìn)行葛藤莖葉青貯是解決其發(fā)霉變質(zhì)的有效途徑［6］。加之葛藤莖葉含水量大、蛋白質(zhì)含量高且碳水化合物含量低，這些特性易導(dǎo)致青貯葛藤發(fā)酵期間的養(yǎng)分流失，降低青貯品質(zhì)［4，6］。因此，選擇適宜的青貯添加劑提高葛藤青貯發(fā)酵品質(zhì)顯得尤其重要。

單寧酸（tannic acid，TA）是具有還原性和抗氧化性的有機(jī)酸，具有殺菌、防腐、凝固蛋白質(zhì)的作用［7-8］。在青貯飼料中添加單寧酸可迅速降低青貯飼料p H值，抑制雜菌的繁殖，降低氨態(tài)氮和總酸的含量，從而改善青貯飼料的品質(zhì)［9-10］。單寧酸在動(dòng)物消化道內(nèi)部可與植物蛋白形成復(fù)合物，提高反芻動(dòng)物過瘤胃蛋白，從而提高飼料中養(yǎng)分的可利用率［11-13］。同時(shí)，諸多研究也已表明，單寧酸能抑制小白鼠表皮與大腸多環(huán)芳香烴的誘變作用和腫瘤增生的作用，降低血脂清除自由基，將其應(yīng)用于青貯過程中，以替代對(duì)人體健康具有潛在威脅的CH2O和CH2O2［14］，有助于生產(chǎn)綠色健康的有機(jī)畜產(chǎn)品。

青貯時(shí)添加單寧酸能降低p H，改善青貯品質(zhì)，被應(yīng)用于苜蓿（Medicago sativa）、象草（Pennisetum purpureum）、黑麥草（Lolium perenne）等青貯調(diào)制［15-18］。迄今，單寧酸應(yīng)用于葛藤莖葉青貯中的報(bào)道較少，僅楊冬梅等［19］將3%和4%單寧酸添加在青綠葛藤莖葉中，青貯60d后添加單寧酸的葛藤莖葉青貯飼料質(zhì)地松散完整，具有酸香味，干物質(zhì)損失率顯著降低；可溶性碳水化合物和中性洗滌纖維含量顯著增加，但未深入檢測(cè)單寧酸對(duì)青貯葛藤莖葉品質(zhì)及安全性的影響。本研究擬探討不同濃度單寧酸對(duì)青貯葛藤莖葉發(fā)酵品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性及霉菌毒素含量的影響，為西南山區(qū)葛藤莖葉的科學(xué)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青貯原料

新鮮葛藤莖葉采自湖南湘西土家族苗族自治州古丈縣斷龍鄉(xiāng)楊家寨。采樣區(qū)海拔800~1200 m，地理坐標(biāo)為東經(jīng)109°10′-110°22.5′，北緯27°44.5′-29°38′。采樣區(qū)氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)，年平均氣溫15.0~16.9℃，最高氣溫40.5℃，最低氣溫-5.5℃。年降水量1300~1500 mm，無霜期250~280 d。年平均相對(duì)濕度77%，平均日照1397.2 h。

1.2 青貯制作

葛藤收獲后立即運(yùn)往吉首大學(xué)生態(tài)研究所。將葛藤切割成2 cm左右小段，將水分含量調(diào)至60%~70%，以手握切碎的青貯料，手指縫中略有水為青貯料含水適中，沒有水為過干，適當(dāng)勻撒些水，水分過多的通過晾曬達(dá)到水分適當(dāng)。

添加單寧酸的比例參照李茂等［17］和楊冬梅等［19］的方法，并結(jié)合以前的預(yù)試驗(yàn)。其中，單寧酸的添加濃度分別為0、1.0%、1.5%、2.0%（4個(gè)處理，處理組編號(hào)分別為對(duì)照組，1.0%TA，1.5%TA，2.0%TA），然后裝入塑料袋，每袋凈重500 g，每個(gè)處理15袋。用真空包裝機(jī)抽空塑料袋中的空氣，隨即密封并存放在干燥的室內(nèi)。

1.3 樣品采集

青貯第5、10、35、50和70天分別采集樣品，按照4分法采集，一部分（100 g）青貯葛藤樣品直接保存于-80℃，用于霉菌毒素含量的測(cè)定；另一部分（25 g）加180 mL蒸餾水，榨汁機(jī)攪拌搗碎后用2層紗布和定性濾紙過濾得浸出液，所得浸出液一份于-80℃保存，用于發(fā)酵品質(zhì)的測(cè)定，另一份進(jìn)行10-1~10-7梯度稀釋，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物的數(shù)量。在添加放線菌酮（200μg·mL-1）的MRS肉湯培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g·L-1，肉膏10.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，磷酸氫二鉀2.0 g·L-1，檸檬酸氫二銨2.0 g·L-1，乙酸鈉5.0 g·L-1，硫酸鎂0.58 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，半胱氨酸0.5 g·L-1，吐溫80 1.0 g·L-1）中檢測(cè)乳酸菌數(shù)量，再在滅菌酒石酸調(diào)pH至3.5的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中檢測(cè)酵母菌數(shù)量。乳酸菌MRS瓊脂平板在37℃厭氧條件下培養(yǎng)24~48 h，酵母菌馬鈴薯瓊脂平板在37℃下培養(yǎng)48~72 h。

1.4 有氧穩(wěn)定性

青貯50 d后，從每個(gè)青貯袋中取30 g樣品放入干凈的80 mL青貯瓶中，覆蓋2層紗布，在室溫下保存。取出的樣品在0，5及10 d進(jìn)行一次取樣（10 g），測(cè)定p H，分析乳酸含量以及酵母菌的數(shù)量。有氧穩(wěn)定性采用p H等指標(biāo)進(jìn)行分析，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.5 樣品分析

參照張麗英［20］的方法測(cè)定樣品營(yíng)養(yǎng)成分。采用烘干法測(cè)定干物質(zhì)（dry matter，DM）含量；采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白（crude protein，CP）含量［21］；采用ANKOM 220纖維分析儀（ANKOM，美國(guó)）測(cè)定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量［22］；參照余汝華等［23］的方法測(cè)定可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量；采用苯酚-次氯酸鈉比色法［24］測(cè)定氨態(tài)氮（NH3-N）含量。用雷磁PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測(cè)定pH值。采用島津LC-20A型高效液相色譜儀測(cè)定乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）含量，重復(fù)3次。

用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定樣品中黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、嘔吐毒素（vomitoxin，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）含量，重復(fù)3次，試劑盒購(gòu)自上海逸峰生物科技有限公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子和雙因子方差分析（青貯時(shí)間×單寧酸添加量，有氧暴露時(shí)間×單寧酸添加量）進(jìn)行處理組間差異比較，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，青貯葛藤莖葉粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量均有所下降（表1），但差異不顯著（P>0.05），可溶性碳水化合物含量顯著降低（P<0.05），青貯時(shí)間和單寧酸添加量對(duì)可溶性碳水化合物含量具有顯著的交互作用（P<0.05）。葛藤莖葉青貯50 d后，在2.0%單寧酸處理?xiàng)l件下可溶性碳水化合物含量和中性洗滌纖維含量較對(duì)照組顯著增加（P<0.05），粗蛋白含量雖有所增加，但差異不顯著。葛藤莖葉青貯70 d后，添加2.0%單寧酸的可溶性碳水化合物含量較對(duì)照組提高16%（P<0.05）。

表1 添加單寧酸對(duì)青貯葛藤莖葉營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 1 Effect of tannin acid addition on the nutrient content of silage kudzu vine

葛藤莖葉青貯50 d后，添加單寧酸對(duì)青貯葛藤莖葉中乙酸含量、氨態(tài)氮含量、乳酸菌數(shù)量均無顯著影響（P>0.05）。單寧酸處理組未檢出丙酸和丁酸。而隨著葛藤莖葉青貯單寧酸添加量的增加，乳酸含量顯著下降（P<0.05）。各處理組酵母菌數(shù)量均低于2.00 lg CFU·g-1FM（表2）。

表2 添加單寧酸對(duì)青貯葛藤莖葉發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effects of addition of tannic acid on fermentation par ameters of silage kudzu vine

隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，青貯葛藤莖葉中黃曲霉毒素、嘔吐毒素以及玉米赤霉烯酮含量均顯著降低（P<0.05），單寧酸能顯著降低黃曲霉毒素、嘔吐毒素以及玉米赤霉烯酮含量。青貯時(shí)間和單寧酸添加量對(duì)3種毒素的含量具有顯著的降低作用（表3）。

在青貯第35天，2.0%TA組青貯葛藤莖葉中黃曲霉毒素含量較對(duì)照組降低23.7%，嘔吐毒素含量較對(duì)照組降低57.3%，玉米赤霉烯酮含量較對(duì)照組下降30.0%；青貯第50天，2.0%TA組黃曲霉毒素含量較對(duì)照組降低79.3%，嘔吐毒素含量較對(duì)照組降低54.4%，玉米赤霉烯酮含量較對(duì)照組下降23.2%；青貯第70天，2.0%TA組黃曲霉毒素含量較對(duì)照組降低47.6%，嘔吐毒素含量較對(duì)照組下降53.9%，玉米赤霉烯酮含量較對(duì)照組降低37.4%（表3）。

表3 添加單寧酸對(duì)青貯葛藤霉菌毒素含量的影響Table 3 Effects of tannin acid addition on mycotoxin contents of silage kudzu vine（μg·kg-1）

在青貯葛藤莖葉開封第10天時(shí)，對(duì)照組p H顯著高于第0天；各處理組p H值略有升高，但各處理組間無顯著差異（P>0.05）（表4）。在青貯葛藤莖葉開封第10天時(shí)，對(duì)照組p H較開封第0天升高104.0%，1.0%TA組p H值較開封第0天升高65.6%，1.5%TA組較開封第0天p H值升高52.6%，2.0%TA組p H值較開封第0天升高19.0%。單寧酸處理組乳酸降幅顯著低于對(duì)照組（P<0.05），2.0%TA組酵母菌數(shù)量最低（P<0.05）。因此，2.0%TA組的p H值最低，乳酸降幅較小，酵母菌增加幅度較低，有氧穩(wěn)定性最佳。有氧暴露時(shí)間對(duì)添加單寧酸的青貯葛藤莖葉p H（P<0.05）、乳酸含量（P<0.05）及酵母菌數(shù)量（P<0.05）具有極顯著影響。

表4 添加單寧酸對(duì)青貯葛藤有氧暴露過程中p H、乳酸含量和酵母菌數(shù)量的影響Table 4 Effects of addition of tannic acid on p H，lactic acid and yeast counts in silage kudzu vine

3 討論

青貯過程中葛藤莖葉借助微生物的發(fā)酵，形成大量的乳酸和揮發(fā)性脂肪酸，使pH低于4.2，抑制了所有微生物的活動(dòng)，從而有效保存青貯飼料的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)在葛藤莖葉青貯中添加單寧酸能有效降低可溶性碳水化合物、中性洗滌纖維和蛋白質(zhì)的損失，在青貯70 d后，添加2.0%單寧酸的青貯葛藤莖葉中可溶性碳水化合物含量較對(duì)照升高15%。前人對(duì)黑麥草［8］、苜蓿［12］、葛藤［19］和木薯葉［17］添加單寧酸增加了青貯飼料的DM、CP含量，本研究結(jié)果與此相近。單寧酸能迅速降低青貯葛藤莖葉飼料的p H，不僅抑制其他雜菌的繁殖，同時(shí)也抑制了葛藤自身的代謝。同時(shí)，單寧酸蛋白質(zhì)結(jié)合形成難以水解的絡(luò)合物，降低蛋白質(zhì)在瘤胃中的降解率，顯著增加青貯飼料過瘤胃蛋白，從而提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料蛋白質(zhì)的利用率［10］，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體體質(zhì)。這為我國(guó)西南山區(qū)草食畜牧業(yè)發(fā)展提供了新的途徑。

評(píng)價(jià)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)為有機(jī)酸，乳酸占有機(jī)酸總量比值越大，丁酸占比值越小，青貯飼料品質(zhì)越好［25-27］。本研究發(fā)現(xiàn)葛藤莖葉添加單寧酸青貯后，青貯葛藤乳酸含量顯著下降，且沒有檢測(cè)出丙酸和丁酸，與Salawu等［9］、楊冬梅等［19］報(bào)道的結(jié)果相似。說明添加單寧酸可使青貯葛藤莖葉p H迅速降低，從而進(jìn)一步抑制各種微生物的生長(zhǎng)，有效阻遏了青貯飼料養(yǎng)分的丟失。這可能是單寧酸與蛋白質(zhì)絡(luò)合抑制了微生物的繁殖，降低了它們對(duì)青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的利用，特別是對(duì)蛋白質(zhì)的分解利用。

青貯飼料有氧穩(wěn)定性一直以來都是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)［28］。青貯飼料有氧變質(zhì)可導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失、霉變、毒素蓄積，酵母菌是引起該過程的主要微生物［29-31］。本研究中青貯葛藤莖葉開封后，2.0%TA組的pH值最低，乳酸含量降幅較小，酵母菌數(shù)量增加幅度較低，有氧穩(wěn)定性高。單寧酸能夠改善有氧穩(wěn)定性，主要是抑制酵母菌、霉菌的活性，降低其對(duì)青貯葛藤莖葉養(yǎng)分的消耗和有毒物質(zhì)的形成。此外，單寧酸處理組乳酸含量較高，在一定程度上也抑制了酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了青貯飼料在有氧條件下的穩(wěn)定性。

霉菌毒素可通過飼料進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，導(dǎo)致動(dòng)物中毒或者生產(chǎn)性能下降，積聚在動(dòng)物體內(nèi)或動(dòng)物產(chǎn)品（蛋奶等）中，從而降低動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)，甚至引發(fā)消費(fèi)者急性或慢性中毒［32］。霉菌毒素是霉菌等雜菌在被污染的作物上代謝形成的有毒代謝產(chǎn)物［33］。本研究顯示單寧酸能顯著降低青貯葛藤莖葉中黃曲霉毒素、嘔吐毒素以及玉米赤霉烯酮的含量，隨著青貯飼料發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3種毒素的含量也逐漸降低。對(duì)照組在有氧發(fā)酵階段，霉菌大量繁殖產(chǎn)生霉菌毒素，當(dāng)pH進(jìn)一步下降到乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌群時(shí)，霉菌活動(dòng)受限，霉菌毒素產(chǎn)量逐漸減少。在青貯葛藤中添加單寧酸，不僅使青貯葛藤莖葉p H值下降，而且單寧酸可與霉菌體內(nèi)的蛋白酶結(jié)合，致使胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，無法進(jìn)行正常新陳代謝而死亡，從而達(dá)到抑制細(xì)菌滋生的效果。湘西地區(qū)氣候潮濕，干草易于滋生霉菌形成霉菌毒素，不利于葛藤晾制干草。將青綠葛藤莖葉青貯，不僅可充分利用當(dāng)?shù)刎S富的葛藤莖葉資源，同時(shí)可解決冬季牛羊牧草不足的問題。

4 結(jié)論

在青貯葛藤莖葉中加入適量單寧酸，對(duì)青貯葛藤莖葉的品質(zhì)具有提高作用，可取代甲酸、甲醛等對(duì)人及家畜有危害的青貯飼料添加劑，可有效抑制不良微生物活性，提高青貯葛藤莖葉品質(zhì)，為西南山區(qū)草食畜牧業(yè)的發(fā)展提供新的途徑。