AAV患兒的高背景cANCA陽(yáng)性熒光模式和實(shí)驗(yàn)室特征①

代玉梅 朱品謀 林茗嫣 劉云鋒（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)療中心臨床檢驗(yàn)部，廣州510623）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎［（antineutrophil cytoplasmic autoanti-body，ANCA）-associated vasculitis，AAV］是一類(lèi)以原發(fā)或繼發(fā)性小、中血管結(jié)構(gòu)反應(yīng)性損傷伴血管壁白細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾?。?］。ANCA在其發(fā)病、診斷及臨床分類(lèi)中具有重要價(jià)值［2］。雖然AAV在兒童中發(fā)病率較低，若累及腎臟等器官可能會(huì)造成嚴(yán)重后果［3］。目前臨床試驗(yàn)室用于AAV篩查的常規(guī)項(xiàng)目是血管炎4項(xiàng)：間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）判斷ANCA類(lèi)型為核周型（perinuclear pattern，pANCA）、胞漿型（cytoplasmic pattern，cANCA）或非典型（atypical pattern，aANCA）；ELISA鑒定靶抗原髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和/或蛋白酶3（proteinase 3，PR3）。用于ANCA IIF分析的基質(zhì)片有單基質(zhì)、雙基質(zhì)、多基質(zhì)等。本研究采用歐蒙公司生產(chǎn)的、經(jīng)甲醛和乙醇固定的正常中性粒細(xì)胞構(gòu)成的雙基質(zhì)片。

課題組發(fā)現(xiàn)，某些患兒的血清標(biāo)本在排除黃疸等干擾因素影響且標(biāo)準(zhǔn)化操作下，仍會(huì)在基質(zhì)片上呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光背景，產(chǎn)生原因不明。本研究以2016年1月至3月初診并行血管炎4項(xiàng)篩查的AAV患兒為對(duì)象，比較分析ANCA陽(yáng)性高背景組、ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組與血管炎4項(xiàng)檢測(cè)均陰性組患兒血清主要的免疫學(xué)指標(biāo)（IgG、IgE，補(bǔ)體C3、C4）、肝臟生化指標(biāo)［白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）］和血液學(xué)指標(biāo)［白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMP）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血小板寬度（PDW）等］，觀察高背景cANCA陽(yáng)性AAV患兒的實(shí)驗(yàn)室特征，并探討非特異性綠色熒光背景產(chǎn)生的可能原因。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月至3月初我院收治的初診、行血管炎4項(xiàng)檢測(cè)的AAV患兒，分組收集ANCA陽(yáng)性高背景、ANCA陽(yáng)性無(wú)背景、血管炎4項(xiàng)均呈陰性的血清標(biāo)本共90例（30例/組，剔除溶血、脂血、黃疸標(biāo)本），同時(shí)收集患兒外周EDTA抗凝血標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)分析。

1.1.2 主要試劑與儀器ANCA IIF檢測(cè)試劑盒、anti-MPOELISA檢測(cè)試劑盒、anti-PR3 ELISA檢測(cè)試劑盒（德國(guó)歐蒙）；IgG、IgE、C3、C4診斷試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特）；ALB、ALT、AST生化分析試劑盒（北京九強(qiáng)）；BX517R-32FB3-F01免疫熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；IMMAGE 800特種蛋白分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特）；全自動(dòng)生化分析儀（7600，日本日立）；System XE-5000全自動(dòng)血液分析儀（美國(guó)希森美康）。

1.2 方法

1.2.1 血管炎4項(xiàng)檢測(cè) 待檢血清（起始稀釋度為1∶10）采用ANCA IIF雙基質(zhì)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行IIF染色，熒光顯微鏡下由2名資深技術(shù)專(zhuān)家判斷ANCA的熒光模式：乙醇基質(zhì)中顯示分布在整個(gè)中性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒型熒光為胞漿型（cANCA），中性粒細(xì)胞核周顯示光滑帶狀熒光為核周型（pANCA），注意排除抗核抗體（ANA）干擾。熒光高背景：常規(guī)IIF染色，固定中性粒細(xì)胞的背景基質(zhì)呈可見(jiàn)的較強(qiáng)綠色熒光；熒光無(wú)背景：常規(guī)IIF染色，固定中性粒細(xì)胞的背景基質(zhì)無(wú)明顯可見(jiàn)綠色熒光。采用anti-MPO/PR3 ELISA試劑盒半定量分析待檢血清中的靶抗原。

1.2.2 免疫球蛋白及補(bǔ)體檢測(cè) 血清IgG、IgE、C3、C4按照商品化試劑盒操作說(shuō)明書(shū)采用IMMAGE 800全自動(dòng)酶免儀分析。

1.2.3 肝臟生化指標(biāo)及血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 采用ALB、ALT、AST試劑盒及7600全自動(dòng)生化分析儀定量分析待測(cè)血清中相應(yīng)生化指標(biāo)，血液分析儀System XE5000常規(guī)分析患兒外周血WBC、LYMP、NEUT、PLT和PDW，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Chi-square進(jìn)行二分類(lèi)資料檢驗(yàn)；計(jì)量資料多組間比較采用Ordinary Oneway ANOVA檢驗(yàn)；組間兩兩比較采用Turkey's multiple comparison test。P＜0.05為 差 異 具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試人群一般臨床特征ANCA陽(yáng)性高背景組患兒74%為男性（20/27），平均年齡略高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組。ANCA陽(yáng)性高背景組與ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組患兒血清cANCA、pANCA、MPO陽(yáng)性率存在顯著差異（P＜0.01，表1）。IIF染色后，雙基質(zhì)片中，27例ANCA陽(yáng)性高背景組患兒血清在乙醇側(cè)（EOH）主要表現(xiàn)為具有較強(qiáng)綠色熒光背景的弱陽(yáng)性cANCA核型（44.44%，僅1例pANCA），甲醛側(cè)（HCHO）熒光染色均為陰性（或弱陽(yáng)性）；25.93%（7/27）患兒靶抗原為MPO，14.82%（4/27）患兒靶抗原為PR3。ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組患兒血清在雙基質(zhì)片中則僅在已固定的中性粒細(xì)胞核周或胞漿出現(xiàn)典型綠色熒光，核型主要為陽(yáng)性或弱陽(yáng)性pANCA（64.29%，18/28），背景干凈清晰、無(wú)綠色熒光；39.29%（11/28）患兒靶抗原為MPO，10.71%（3/28）患兒靶抗原為PR3。ANCA陽(yáng)性高背景及無(wú)背景患兒血清多伴有低滴度ANA（圖1）。

表1 ANCA陽(yáng)性高背景組、陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性人群血管炎4項(xiàng)分析［±s，例（%）］Tab.1 Analysis of 4-items vasculitis in positive high background group，positive no background group and negative population［±s，n（%）］

表1 ANCA陽(yáng)性高背景組、陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性人群血管炎4項(xiàng)分析［±s，例（%）］Tab.1 Analysis of 4-items vasculitis in positive high background group，positive no background group and negative population［±s，n（%）］

Features Male/Female Age（month）cANCA（+）pANCA（+）MPO（+）PR3（+）ANCA+With background（n=27）20/7 65.3±10.02 12（44.44）1（3.70）7（25.93）4（14.82）Without background（n=28）12/16 34.71±8.19 6（21.43）18（64.29）11（39.29）3（10.71）ANCA-（n=30）12/18 67.71±9.68 0 0 0 0 P＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

圖1 IIF高背景ANCA在乙醇/甲醛基質(zhì)中的代表性結(jié)果Fig.1 Representative results of IIF high background ANCA in EOH/HCHO fixed matrix

2.2 ANCA陽(yáng)性高背景組患兒免疫學(xué)指標(biāo)3組受試患兒血清IgG、IgE、C3、C4分析結(jié)果如圖2所示，ANCA陽(yáng)性高背景組血清IgG水平［（9.87±4.34）μg/ml］顯著低于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組［（13.89±6.43）μg/ml，P＜0.05］及陰性對(duì)照組［（10.39±4.75）μg/ml，P＞0.05］；ANCA陽(yáng)性高背景組血清C3［（1.22±0.39）μg/ml］顯著高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組［（0.88±0.33）μg/ml，P＜0.05］和陰性對(duì)照組［（0.96±0.26）μg/ml，P＜0.01］；IgE、C4雖在ANCA陽(yáng)性高背景組、ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性對(duì)照組呈逐漸增高或降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 ANCA陽(yáng)性高背景組、ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性對(duì)照組免疫學(xué)指標(biāo)比較Fig.2 Comparison of immunological index in ANCA positive high background group，ANCA positive no background group and negative control group

2.3 ANCA陽(yáng)性高背景組患兒肝臟生化指標(biāo)3組患兒肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，ANCA陽(yáng)性高背景組ALB、ALT、AST水平均高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 ANCA高背景組、ANCA無(wú)背景組及陰性對(duì)照組肝臟生化指標(biāo)比較Fig.3 Comparison of liver biochemical indexes in ANCA high background group，ANCA no background group and negative control group

2.4 ANCA陽(yáng)性高背景患兒血液學(xué)指標(biāo)3組患兒血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)分析結(jié)果顯示，ANCA陽(yáng)性高背景組WBC、LYMP及PDW水平均高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組和陰性對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。ANCA陽(yáng)性高背景組患兒PLT計(jì)數(shù)［（402.6±191.2）×1012個(gè)/L］顯著高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組［（302.3±22.9）×1012個(gè)/L，P＜0.05］；ANCA陽(yáng)性高背景組RBC計(jì)數(shù)［（4.39±0.39）×1012個(gè)/L］與ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組患兒［（3.99±0.94）×1012個(gè)/L］低于陰性對(duì)照組［（4.49±0.40）×1012個(gè)/L］，且ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組與陰性對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。

圖4 ANCA陽(yáng)性高背景組、ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性對(duì)照組血液學(xué)指標(biāo)比較Fig.4 Comparison of hematological indexes in ANCA positive high background group，ANCA positive no background group and negative control group

3 討論

中性粒細(xì)胞活化及補(bǔ)體系統(tǒng)參與是AAV病程中的主要事件。臨床常根據(jù)ANCA在IIF染色時(shí)呈現(xiàn)的熒光模式和對(duì)應(yīng)的靶抗原進(jìn)行AAV診斷并判斷藥物療效。已知的ANCA靶抗原除MPO、PR3外，尚有殺菌/通透性增加蛋白酶、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白等［4］，目前臨床試驗(yàn)室篩查較為普遍的是MPO和PR3。

課題組ANCA實(shí)際檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，某些患兒的臨床血清標(biāo)本在IIF染色時(shí)會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光背景，而成人血清標(biāo)本則鮮少出現(xiàn)此種情況。為探索這種非特異性熒光高背景產(chǎn)生的可能原因，課題組隨機(jī)留取行AAV篩查的ANCA陽(yáng)性高背景、ANCA陽(yáng)性無(wú)背景及血管炎4項(xiàng)均呈陰性的患兒血清標(biāo)本，觀察ANCA陽(yáng)性高背景血清標(biāo)本的熒光類(lèi)型及非特異性高背景的形成規(guī)律，并比較3組患兒的主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，尋找可能與綠色熒光背景相關(guān)的因素。

IIF分析結(jié)果顯示，高背景ANCA陽(yáng)性病例性別構(gòu)成多為男性，血清在雙基質(zhì)片中呈現(xiàn)的皆為甲醛敏感型cANCA，靶抗原MPO、PR3陽(yáng)性率分別為25.93%、14.82%，提示這些ANCA陽(yáng)性高背景血清存在MPO、PR3以外的未知粒細(xì)胞（或單核細(xì)胞）自身抗原。ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組pANCA陽(yáng)性率較ANCA陽(yáng)性高背景組明顯升高，且多為pANCA和cANCA雙陽(yáng)的混合模式，MPO檢出率相對(duì)較高（39.29%），提示pANCA相關(guān)兒童血管炎靶抗原與成人相似，多為MPO，這些初診的ANCA陽(yáng)性無(wú)背景AAV患兒與高背景組患兒相比，年齡相對(duì)偏小，這種非典型的雙陽(yáng)模式產(chǎn)生原因有待進(jìn)一步研究。

循環(huán)型IgG在乙醇固定的中性粒細(xì)胞基質(zhì)片上可呈現(xiàn)胞漿型熒光［5］。IgG的某些亞類(lèi)水平與疾病鑒別診斷有關(guān)［6］。3組患兒血清免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，ANCA陽(yáng)性高背景組總IgG水平低于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組和陰性對(duì)照組，且與ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組存在顯著差異，提示疾病狀態(tài)下ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組患兒產(chǎn)生更高滴度的自身抗體。研究發(fā)現(xiàn)，治療AAV的藥物環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、利妥昔單抗等可能會(huì)誘導(dǎo)低IgG血癥和B細(xì)胞數(shù)減少［7-8］。這些小分子藥物半抗原可能會(huì)與患兒血清中的某些蛋白（或IgG）結(jié)合成完全抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)IgG，并與基質(zhì)片上的抗原發(fā)生非特異性結(jié)合產(chǎn)生綠色高熒光背景。對(duì)初診患者而言，藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是不存在的，本研究發(fā)現(xiàn)，某些血管炎4項(xiàng)全陰性患兒抽血前及時(shí)靜注人IgG、阿司匹林或人源化單抗，IIF染色時(shí)也并未出現(xiàn)非特異性綠色熒光背景，提示藥物應(yīng)用并非導(dǎo)致非特異性熒光背景的必然原因。若要排除藥物對(duì)于ANCA篩查時(shí)綠色背景的影響，需要更嚴(yán)格地挑選實(shí)驗(yàn)對(duì)象、更精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以排除混雜因素（如血藥濃度、血藥半衰期、藥物代謝和藥物動(dòng)力學(xué)等）的影響，以防得出有歧義的結(jié)論。

C3是體內(nèi)最豐富的補(bǔ)體蛋白，3條補(bǔ)體激活途徑的啟動(dòng)均需C3參與。C3是非常重要的炎癥介質(zhì)，在調(diào)理吞噬、介導(dǎo)炎癥、趨化白細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、溶解免疫復(fù)合物、針對(duì)自身小分子抗原的特異性抗體形成等免疫進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，補(bǔ)體活化在AAV病程中扮演重要角色［9］。MPO陽(yáng)性的活動(dòng)期AAV患者外周EDTA抗凝血漿補(bǔ)體降解物C3a、C5a、sC5b-9水平較正常人群較高，緩解期Bb、C3a、sC5b-9水平更高，而PR3陽(yáng)性的活動(dòng)期AAV患者C3a、C5a、sC5b-9和C4d水平較高，緩解期時(shí)C3a、C4d水平更高，血清C3較低的AAV患者生存率較低，腎功能預(yù)后相對(duì)較差［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，ANCA陽(yáng)性高背景組C3水平顯著高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性對(duì)照組，說(shuō)明ANCA陽(yáng)性高背景組患兒血清補(bǔ)體呈高活化狀態(tài)，非特異性綠色強(qiáng)熒光背景的產(chǎn)生可能與患兒血清C3水平有關(guān)。結(jié)合ANCA陽(yáng)性高背景組及陽(yáng)性無(wú)背景組患兒外周血RBC計(jì)數(shù)均低于陰性對(duì)照組，課題組認(rèn)為C3及RBC的組間差異可能與患兒機(jī)體炎癥狀態(tài)及血液免疫復(fù)合物的清除有關(guān)；C3水平相對(duì)較高的ANCA陽(yáng)性高背景組患兒預(yù)后可能相對(duì)較好。

AAV患者血液中的免疫細(xì)胞亞群尤其是調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目和功能與自身免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、蔓延及自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)［11］。PLT升高作為活動(dòng)性AAV診斷的生物標(biāo)志物，對(duì)區(qū)分活動(dòng)期AAV和緩解期AAV、活動(dòng)性疾病與急性感染有重要意義［12］。PLT/淋巴細(xì)胞比值（PLR）是臨床上評(píng)價(jià)患者疾病負(fù)荷的有效指數(shù)，與AAV診斷密切相關(guān)［13］。課題組發(fā)現(xiàn)，除RBC存在組間差異外，ANCA陽(yáng)性高背景組患兒WBC、LYMP、PDW指標(biāo)均高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組及陰性對(duì)照組，PLT計(jì)數(shù)也明顯高于ANCA陽(yáng)性無(wú)背景組，除受患兒機(jī)體炎癥狀態(tài)和疾病活動(dòng)度影響外，這種顯著差異可能也與研究對(duì)象的疾病構(gòu)成有關(guān)。ANCA陽(yáng)性高背景組有12例川崎病，陽(yáng)性無(wú)背景組有5例過(guò)敏性紫癜。前者是一種以全身血管炎為主要病變的急性發(fā)熱出疹性小兒疾病，高發(fā)于5歲以下嬰幼兒（男多于女），患兒臨床特征多伴有WBC及PLT升高，過(guò)敏性紫癜患兒則多伴有PLT降低，異常增高的PLT是否是免疫熒光高背景形成的直接驅(qū)動(dòng)因素有待深入研究。

綜上，伴有非特異性高熒光背景產(chǎn)生的ANCA多為甲醛敏感型cANCA，患者體內(nèi)同時(shí)有較低滴度的ANA。本研究顯示，AAV患兒的炎癥狀態(tài)激活中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及補(bǔ)體系統(tǒng)，細(xì)胞損傷及損傷細(xì)胞胞內(nèi)成分釋放作為新的抗原成分刺激宿主產(chǎn)生cANCA、ANA等抗體。非特異性綠色熒光背景的形成可能是PR3以外的新抗原在基質(zhì)片上呈現(xiàn)的一種非典型的、新的熒光模式?；純貉簩W(xué)指標(biāo)以低IgG、高C3、高PLT為特征，未來(lái)課題組將進(jìn)一步驗(yàn)證IgG（及亞類(lèi)）、C3、PLT與ANCA間接熒光高背景的關(guān)系（排除C3、補(bǔ)給IgG等），并探索相關(guān)機(jī)制。