黃芪多糖對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脾細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究①

劉建春 張紅珍 李俊蓮 樊慧杰 柴 智 尉杰忠 于婧文 肖保國 馬存根⑤

（山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，晉中030619）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種主要發(fā)生于青壯年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的慢性、進展性、致殘性的自身免疫性疾病。氧化應(yīng)激、炎癥加重和隨后引發(fā)的髓鞘脫失、神經(jīng)元變性是MS的重要特征［1-2］。近年來，據(jù)MS國際基金會的統(tǒng)計在全球范圍內(nèi)約有300萬MS患者，且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。西醫(yī)治療MS多采用抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方法，但預(yù)后差，且藥物價格昂貴，需長期使用，帶來的副作用也將日趨加重，這給患者的家庭和社會帶來了巨大的精神和經(jīng)濟壓力［3］。因此，有效防治神經(jīng)炎癥病變MS的社會需求越來越迫切。

在延緩MS疾病進程方面，中醫(yī)藥與西藥相比，具有辨證論治、整體調(diào)節(jié)等特點，理應(yīng)在MS的預(yù)防和治療中發(fā)揮其獨特優(yōu)勢［4］。中醫(yī)學(xué)，根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，分別歸屬“痿證”“內(nèi)障”“眩暈”等不同的病名。辨證分型中臨床常見證型之一是氣虛血瘀證，依據(jù)病機辨證論治，治療則應(yīng)以補氣活血兼以祛瘀通絡(luò)為主［5-6］。

山西省道地藥材之一黃芪，在古代醫(yī)書中有“補藥之長”的美譽，具有補氣升陽、生津養(yǎng)血等功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中的主要有效成分黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS），具有增強免疫、抗氧化、抗炎、抗衰老等多種作用，能夠有效治療和改善多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病及神經(jīng)損傷的癥狀［7］。本研究發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢，應(yīng)用APS干預(yù)免疫后第9天多發(fā)性硬化實驗動物模型——實驗性自身免疫性腦 脊 髓 炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠的脾細(xì)胞，探討APS對致腦炎癥脾細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及機制，以期為臨床開發(fā)和應(yīng)用APS治療多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病提供藥理學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物8～10周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠，實驗前小鼠自由飲食喂養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑APS（上海愛必信生物科技有限公司）；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽35-55（myelin oligodendrocyte glycoproten，MOG35-55，上海強耀生物科技有限公司）；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX，Sigma公司）；結(jié)核分枝桿菌（tuberculosis mycobacter ium，TB，Becton Dickinson公司）；完全弗氏佐劑（complete freund's adjuvant，CFA，Alexis公司）；流式抗體LAP（TGF-β）Antibody、PE Anti-mouse CD25 Antibody、PE Anti-mouse-IL-12、FITC Anti-mouse CD4 Antibody（Biolegend公 司）；Flour-488-CD11b、PE-CD16/32和PE-CD206（Becton Dick-inson公司）；IFN-γ、IL-12及IL-10 ELISA試劑盒（R&D公司）；熒光素染料（carboxyfluoresceinsuccinimidyl amino ester，CFSE，碧云天公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（HyClone公司）。

1.1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱及全波長酶標(biāo)儀（Thermo公司）；多用途低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型制備MOG35-55抗原乳劑的配制和注射的方法均嚴(yán)格按照文獻［8］進行。用生理鹽水配制MOG35-55水劑，在完全弗氏佐劑中加入TB配制油劑，將水劑和油劑按等體積的比例混合，反復(fù)抽推混合液制備油包水樣抗原混懸液。在每只小鼠腰骶膨大處脊柱兩側(cè)皮下分4點注射抗原乳劑0.1 ml，將注射的當(dāng)天記為免疫后的第0天。于免疫的當(dāng)天和48 h后，每只小鼠腹腔注射PTX 300 ng以增強小鼠的免疫應(yīng)答［9］。

1.2.2 取材及脾細(xì)胞制備 在免疫后的第9天，麻醉小鼠，無菌操作條件下剪開腹部，取出脾，然后放入預(yù)冷的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在超凈工作臺中采用注射器針芯研磨脾臟，直至組織發(fā)白，過濾后，1 500 r/min離心10 min，倒掉上清液，重懸細(xì)胞，加入滅菌的雙蒸水4 ml，45 s后加入2 ml 2.7%NaCl溶液恢復(fù)到等滲狀態(tài)，去除破碎的細(xì)胞膜，1 500 r/min離心10 min后，倒掉上清，拍打重懸細(xì)胞，制備成單個核細(xì)胞的懸液，細(xì)胞計數(shù)后備用。

1.2.3 脾細(xì)胞培養(yǎng) 實驗分3組：EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組。每組取2個50 ml離心管向其中加入含相同數(shù)量脾細(xì)胞（5×106個/ml）的完全培養(yǎng)液5 ml，加入MOG35-55，使其含量為10 μg/ml。APS低劑量組、APS高劑量組加入相同體積相應(yīng)濃度的APS，使其終濃度分別為0.1 mg/ml、0.2 mg/ml，EAE組加入相同體積的PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集上述細(xì)胞及上清液。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測脾中T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表型的表達(dá) 將EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組收集的脾細(xì)胞懸浮于1% BSA中，分裝于流式管中，每管50 μl，分別加相應(yīng)的流式抗體，室溫避光20 min。PBS洗滌2次各加400 μl PBS，用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+、CD4+TGF-β+、CD4+IFN-γ+、CD11b+CD206+及CD11b+CD16/32+細(xì)胞的變化。

1.2.5 ELISA法測定脾上清中IL-10、IL-12、IFN-γ的水平 取EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組收集的脾細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞上清液中IL-10、IL-12和IFN-γ的吸光度值，根據(jù)直線回歸方程計算所測細(xì)胞因子的含量。

1.2.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 分別取EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組培養(yǎng)48 h后的脾細(xì)胞懸液鋪96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加樣量為100 μl。按照說明書，在每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度值。

1.2.7 CFSE檢測細(xì)胞增殖 從制備好的單個核脾細(xì)胞懸液中取出含6×106個的脾細(xì)胞懸液置于4 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌3次，加入2 ml PBS重懸細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，然后加入等體積胎牛血清終止反應(yīng)，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，加入含10 μg/ml MOG35-55的完全培養(yǎng)液2 ml重懸細(xì)胞。鋪96孔板，分EAE組、APS低劑量組及APS高劑量組，每組3個復(fù)孔，每孔加200 μl。EAE組加PBS，APS低劑量組、APS高劑量組加APS，使其終濃度分別為0.1 mg/ml、0.2 mg/ml。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，上流式細(xì)胞儀檢測CFSE的熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計分析軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS對CD4+T細(xì)胞亞群及巨噬細(xì)胞表型表達(dá)的影響 與EAE組比較，APS高劑量、低劑量均可上調(diào)CD25+、TGF-β+的CD4+T細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.001，P＜0.05）；APS高劑量可下調(diào)IL-12+的CD4+T細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.01），APS低劑量也下調(diào)IL-12+的CD4+T細(xì)胞的表達(dá)，但無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。與EAE組相比，APS低劑量可顯著增加M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD206的表達(dá)（P＜0.001），APS高、低劑量均可顯著抑制M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD16/32+的表達(dá)（P＜0.001，圖2）。

圖1 APS調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞比例Fig.1 APS regulated polarization of CD4+T cells

圖2 APS調(diào)節(jié)脾中M1型和M2型巨噬細(xì)胞比例Fig.2 APS regulate proportion of M1 and M2 macrophages in spleen

2.2 APS對脾上清中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響 與EAE組比較，APS低劑量可使脾細(xì)胞上清液中IL-10分泌增高，IL-12分泌降低（P＜0.05）；APS高劑量有使IL-12、IFN-γ分泌降低，IL-10分泌增加的趨勢（圖3）。

圖3 APS對脾上清中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of APS on cytokine expression in spleen supernatant

2.3 APS對脾細(xì)胞增殖率的影響 分別用CCK-8法和CFSE法檢測APS對脾細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果顯示，與EAE組比較，APS高、低劑量均可使脾細(xì)胞增殖率明顯上升（P＜0.01，P＜0.001，圖4）。

圖4 APS對脾細(xì)胞增殖率的影響Fig.4 Effect of APS on proliferation rate of spleen cells

3 討論

MS是一種自身免疫性疾病。免疫失衡是MS最主要的發(fā)病機制［10-11］。由于免疫紊亂，反應(yīng)性T細(xì)胞，特別是CD4+T細(xì)胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過釋放細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β等，趨化B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞分泌抗體標(biāo)記在髓鞘上，巨噬細(xì)胞利用抗體標(biāo)志吞噬摧毀少突膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致髓鞘脫失，這種免疫攻擊是發(fā)作式的，長期下去，軸突變性，中斷神經(jīng)元之間的交流，最終導(dǎo)致認(rèn)知、運動等障礙［12-13］。

在MS/EAE中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥浸潤主要由反應(yīng)性T細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞引起。脾是兩種細(xì)胞的蓄水池，它們首先在脾中被激活和增殖。隨后，通過血循環(huán)進入脊髓［14］。初始CD4+T細(xì)胞在受到抗原的刺激后，在不同的條件下可分化成Th1、Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等不同的亞群，分泌不同的細(xì)胞因子，執(zhí)行不同的功能［15］。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，TNF-α，IL-12，介導(dǎo)針對細(xì)胞內(nèi)病原微生物的細(xì)胞免疫，被稱為炎癥T細(xì)胞，IFN-γ，IL-12促進Th1分化，而IL-4、IL-10和TGF-β抑制Th1分化。在EAE中，Th1細(xì)胞在CNS內(nèi)通過促進炎癥介質(zhì)的釋放，誘發(fā)脫髓鞘，使EAE加重。Th2細(xì)胞可通過分泌IL-4、IL-5、IL-13，促進機體的體液免疫。Th2細(xì)胞有拮抗Th1細(xì)胞的作用，呈現(xiàn)出與免疫調(diào)節(jié)、減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)的作用，在EAE的脫髓鞘病變過程中發(fā)揮保護作用［16-18］。Th1/Th2細(xì)胞間的動態(tài)平衡可能在MS疾病轉(zhuǎn)歸過程中起著重要的作用。實驗研究采用體內(nèi)注射MOG35-55后第9天獲得一群致腦炎癥脾細(xì)胞，在細(xì)胞水平上研究APS的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，APS能顯著增加CD25+、TGF-β+的CD4+T細(xì)胞亞群的比例，下調(diào)IL-12+的CD4+T細(xì)胞的表達(dá)，使脾細(xì)胞上清液中IL-10分泌增高，IL-12分泌降低，表明APS可以調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫再平衡。

巨噬細(xì)胞來源于血液中的單核細(xì)胞，在維持組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，抗病原體感染等方面起著重要的作用［19］。巨噬細(xì)胞在生理和病理條件下均表現(xiàn)出極大的異質(zhì)性。在不同的微環(huán)境下可極化為M1型和M2型［20］。M1型巨噬細(xì)胞可分泌大量炎癥介質(zhì)IL-1β、IFN-γ、TNF-α以促進繼發(fā)性損傷過程［21-22］；而M2型巨噬細(xì)胞通過分泌抗炎因子IL-10、IL-13和TGF-β等對抗受損區(qū)域的炎癥反應(yīng)，重新建立穩(wěn)態(tài)，同時可產(chǎn)生一系列生長因子，促進少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的髓鞘修復(fù)［23-25］?？梢姡奘杉?xì)胞的極性對EAE疾病的改善或進展具有很大的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，APS可顯著抑制M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD16/32+的表達(dá)，增加M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD206+的表達(dá)，使M1型向M2型轉(zhuǎn)化，改善EAE的炎癥反應(yīng)的微環(huán)境。

綜上所述，APS對致腦炎癥脾細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)抗炎和致炎免疫細(xì)胞的比例，調(diào)整細(xì)胞因子的含量，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，提示APS具有治療EAE的潛能。