間充質(zhì)干細胞外泌體通過抑制COX-2和NF-κB激活及p38 MAPK磷酸化緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎①

劉繼攀 孫 偉 宋 默 李鳳丹 趙學影（哈勵遜國際和平醫(yī)院，衡水053000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種發(fā)病率較高的慢性非特異性腸道疾病，長期反復發(fā)病于直腸和結(jié)腸，主要病理表現(xiàn)為腸道炎癥和潰瘍，主要癥狀為腹瀉、腹痛、血便等。UC發(fā)病率逐年上升，且被認為是導致結(jié)腸癌的主要原因之一［1］。UC的發(fā)病機制尚未明確，多被認為與炎癥、感染、腸道菌群、遺傳等因素有關，臨床上UC無法根治，主要以抗炎、調(diào)節(jié)菌群等為主要治療手段［2-3］。因此尋找有效的UC治療方法非常重要。近年干細胞療法逐漸用于各種不可逆損傷性疾病治療，研究表明間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可能用于UC臨床治療，但移植數(shù)量、并發(fā)癥預防、治療長效性等問題仍然阻礙其臨床應用［4］。外泌體是一類由多種活細胞分泌的30～100 nm的胞外囊泡，可攜帶多種宿主細胞遺傳信息［5］。研究表明，MSCs外泌體可用于多種疾病治療且副反應較少［6］，但MSCs外泌體在UC中的應用尚未有明確報道，本研究探究MSCs對UC的影響及機制，旨在為UC治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級4周齡C57BL/6雌性小鼠30只（河北省實驗動物中心），許可證號：SCXK（冀）2018-0010，體重15 g；CD79、CD90、CD11B、CD45檢測抗體（福麥斯生物技術有限公司）；CD9、CD63、TSG101抗體（南京凱基生物技術有限公司）；COX-2、NF-κB、P-p38 MAPK、p38 MAPK、GAPDH抗體（沈陽萬類生物技術有限公司）；流式細胞儀（Beckman公司）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，美國MPBiomedicals公司）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs分離與鑒定4周齡C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死，酒精消毒，解剖取股骨和脛骨，剪去兩端，含10%胎牛血清的原代細胞培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔3次，打散沖洗出的骨髓腔內(nèi)細胞，所得細胞團塊用70 μm細胞篩過濾除去細胞團塊。相對密度1.077的淋巴細胞分離液稀釋細胞懸液，2 000 r/min離心30 min，收集單核細胞界面層，1 000 r/min離心10 min，棄上清，原代細胞培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度，接種于培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)觀察。流式細胞術鑒定MSCs：調(diào)整MSCs密度為1×106個/ml，于100 μl流式管中分別與待測抗體CD79、CD90、CD11B、CD45及相應的同型抗體4℃避光孵育30 min，清洗3次，0.5 ml固定液重懸，流式細胞儀檢測，MSCs應表達CD79和CD90，不表達CD11B和CD45。

1.2.2 MSCs提取 調(diào)整細胞密度，含10%無外泌體胎牛血清的原代細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)MSCs 48 h，收集細胞培養(yǎng)上清，差速離心法提取MSCs外泌體：將收集的細胞上清分裝至10 ml離心管，3 000 g、4℃離心15 min，去除死細胞，6 000 g離心40 min，去除細胞碎片，10 000 g離心1 h，取上清，100 000 g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，400 μl PBS重懸外泌體，-80℃保存。

1.2.3 MSCs外泌體鑒定Western blot檢測外泌體表面生物標志物CD9、CD63、TSG101表達：取100 μl外泌體加入50 μl RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，即為外泌體總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，取外泌體蛋白裂解液進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入CD9、CD63、TSG101一抗孵育過夜，加入二抗孵育，洗膜，曝光成像。采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)：稀釋外泌體至蛋白濃度為0.5 mg/ml，將透射電鏡所用銅網(wǎng)平放于稱量紙上，滴加20 μl上述外泌體溶液，紅外燈下烘烤10 min，再滴加2滴磷鎢酸繼續(xù)烘烤10 min，吸去多余液體，透射電鏡下觀察外泌體結(jié)構(gòu)。

1.2.4 UC小鼠造模、分組及給藥 采用DSS誘導小鼠UC：小鼠自由飲用含3%DSS的飲用水7 d，觀察小鼠飲食、皮毛、活動度、腹瀉及便血情況，挑選毛發(fā)稀疏、活動減少、飲食減少、伴有腹瀉和便血的小鼠進行后續(xù)研究。將造模成功的小鼠分為模型組（UC組）和MSCs外泌體治療組（exosome組），每組10只，隨機挑選10只與模型組年齡相同的小鼠作為control組，exosome組小鼠每3 d尾靜脈注射1次10 μg MSCs外泌體，control和UC組注射等體積生理鹽水，給藥3周，實驗共4周。

1.2.5 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）檢測 給藥治療期間每周計算DAI：小鼠每2 d稱重1次，觀察小鼠體重、大便黏稠度及大便出血情況并打分，體重下降0%記為1分，1%～5%記為2分，5%～10%記為3分，10%～15%記為4分，＞15%記為5分；大便黏稠度正常記為1分，松散記為2分，腹瀉記為4分；大便正常未出血記為1分，隱血陽性記為3分，顯性出血記為4分；上述3項指標評分平均值即為DAI。

1.2.6 ELISA檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平 實驗結(jié)束后，各組小鼠眼眶取血，室溫靜置1 h，4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平：鋪好一抗的96孔板內(nèi)加入40 μl待測樣品和10 μl生物素標記抗體，加入100 μl辣根過氧化物酶標記抗體，37℃孵育75 min，清洗96孔板，加入顯色劑顯色，終止，檢測450 nm波長處吸光度，根據(jù)標準曲線計算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.2.7 黏膜損傷指數(shù)（colonmucosa damage index，CMDI）檢測 實驗結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，解剖取結(jié)腸組織，生理鹽水清洗，剖開結(jié)腸觀察組織病變，評價結(jié)腸CMDI：無損傷記為0分，輕度充血、水腫、表面光滑、無糜爛或潰瘍記為1分；中度充血、水腫、糜爛、無潰瘍記為2分；高度充血水腫，黏膜表面有壞死及潰瘍形成、潰瘍最大縱徑＜1 cm、腸壁增厚或表面有壞死及炎癥記為3分；在3分基礎上潰瘍最大縱徑＞1 cm或全腸壁壞死記為4分。

1.2.8 結(jié)腸組織病理分析HE染色觀察并評價各組小鼠結(jié)腸組織病理變化：小鼠結(jié)腸組織固定于組織固定液48 h，清洗，分別用70%、80%、90%、95%及無水乙醇梯度水化，浸入二甲苯中2次，10 min/次，依次經(jīng)軟石蠟和硬石蠟浸泡各2次，浸入石蠟液中，冷卻至凝固，切片，二甲苯脫蠟，依次用100%、95%、90%、80%、75%乙醇水化各10 min，清洗，適量蘇木素染色5 min，清洗，伊紅染色液室溫染色2 min，去除染色液，90%、95%、100%乙醇中浸泡1 min，置于二甲苯中2次，1 min/次，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化，拍照記錄。

1.2.9 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織中COX-2、NF-κB、P-p38 MAPK、p38 MAPK表達 取各組小鼠結(jié)腸組織50 mg于離心管中，加入250 μl RIPA蛋白裂解液和2.5 μl PMSF蛋白酶抑制劑，冰上勻漿，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，即為組織總蛋白。BCA蛋白定量，沸水浴加熱變性，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入COX-2、NF-κB、P-p38 MAPK、p38 MAPK、GAPDH一 抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應30 s，曝光，拍照，Image J軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較次采用方差分析（one-way ANOVA），兩組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs提取與鑒定結(jié)果 分離的MSCs經(jīng)培養(yǎng)后呈短梭形，紡錘狀，細胞可完全貼壁，培養(yǎng)1周后，細胞仍為紡錘狀，細胞變薄，排列整齊（圖1A）；流式細胞術鑒定結(jié)果顯示，提取的MSCs CD79、CD90表達陽性率分別為（99.2±1.8）%和（98.2±2.1）%，CD11b和CD45陽性率分別為（8.6±1.1）%和（5.3±0.7）%，提 取 的MSCs高 表 達CD79和CD90，低表達CD11b和CD45，因此提取的細胞為MSCs（圖1B）。

圖1 MSCs鑒定Fig.1 Identification of MSCs

2.2 MSCs外泌體鑒定結(jié)果 透射電鏡觀察外泌體結(jié)構(gòu)，差速離心法提取的MSCs外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，“杯托”樣，直徑為30～150 nm，與外泌體結(jié)構(gòu)一致（圖2A）；Western blot檢測提取的MSCs外泌體表 達CD9、CD63、TSG101，不 表 達 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 蛋 白GRP94，符合外泌體特征（圖2B）。

圖2 MSCs外泌體鑒定Fig.2 Identification of MSCs exosome

2.3 治療期間各組小鼠一般情況 治療期間各組小鼠均無死亡，control組小鼠狀態(tài)活躍、毛發(fā)光澤順暢、飲食正常、大便為顆粒狀、無明顯UC病征；UC組小鼠造模后和給藥期間均出現(xiàn)稀便并伴有血便、毛發(fā)稀疏且無光澤、活動少、進食量減少，說明UC組小鼠造模成功；與UC組小鼠相比，exosome組小鼠大便呈顆粒狀、質(zhì)地偏軟、但并未出現(xiàn)稀便和血便、毛發(fā)較順、活動增加，表明BMSCs外泌體對小鼠UC有顯著治療效果。

2.4 各組小鼠DAI變化 與control組相比，UC組小鼠DAI值造模1周后顯著提高（P＜0.001），且數(shù)值一直保持在較高水平，說明造模成功；相比于UC組，exosome組小鼠DAI值在給予外泌體治療1周后顯著下降（P＜0.001），且治療期間一直處于下降趨勢，提示MSCs對小鼠UC有顯著治療作用（圖3）。

圖3 各組小鼠治療期間DAI評分Fig.3 DAI scores of mice in each group during treatment

2.5 MSCs外泌體抑制血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達ELISA檢測各組小鼠血清炎癥因子，結(jié)果顯示，相比于control組，UC組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高（P＜0.001），說明小鼠體內(nèi)炎癥反應顯著；相比于UC組，exosome組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β表達顯著降低（P＜0.001），提示MSCs外泌體可顯著抑制UC小鼠體內(nèi)炎癥反應（圖4）。

圖4 治療結(jié)束后各組小鼠血清炎癥因子表達Fig.4 Serum inflammatory factor expressions of mice in each group after treatment

2.6 各組小鼠結(jié)腸長度及CMDI檢測 相比于control組［（10.13±0.95）cm］，UC組小鼠結(jié)腸顯著縮短［（5.63±0.69）cm，P＜0.001］，相比于UC組，exosome組小鼠結(jié)腸顯著變長［（7.51±0.73）cm，P＜0.001］，提示MSCs外泌體可顯著緩解UC小鼠結(jié)腸病變（圖5A）；CMDI計算結(jié)果顯示，UC組小鼠CMDI［（3.30±0.67）分］顯著高于control組［（0.80±0.92）分，P＜0.001］，exosome組［（1.80±0.79）分］顯著低于UC組（P＜0.001），提示MSCs外泌體可顯著緩解結(jié)腸黏膜損傷（圖5B）。

圖5 各組小鼠結(jié)腸長度、CMDI比較Fig.5 Comparison of colon length and CMDI of mice in each group

2.7 MSCs外泌體可緩解UC小鼠結(jié)腸組織病變HE染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織病變，結(jié)果顯示，control組小鼠結(jié)腸上皮黏膜組織結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤，組織整體無病理變化；UC組小鼠結(jié)腸上皮黏膜結(jié)構(gòu)損傷嚴重，有明顯結(jié)構(gòu)缺失，腺體排列紊亂且無清晰腺體結(jié)構(gòu)，有大量炎癥細胞浸潤，病變顯著，說明造模成功；exosome組小鼠結(jié)腸上皮黏膜結(jié)構(gòu)完整，結(jié)構(gòu)較清晰，腺體結(jié)構(gòu)完整且排列整齊，可見少量炎癥細胞浸潤，病理變化顯著緩解（圖6）。

圖6 HE染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理變化（×200）Fig.6 HE staining to observe pathological changes of colon tissue of mice in each group（×200）

2.8 MSCs外泌體抑制COX-2和NF-κB激活及p38 MAPK磷酸化Western blot結(jié)果顯示，相比于control組，UC組小鼠結(jié)腸組織Cox-2、NF-κB總蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.001），p38 MAPK磷酸化水平顯著提高（P＜0.001）；相比于UC組，exosome組小鼠結(jié)腸組織Cox-2、NF-κB表達顯著下調(diào)（P＜0.001），p38 MAPK磷酸化水平顯著降低（P＜0.001），提示MSCs可通過抑制COX-2和NF-κB總蛋白表達及p38 MAPK磷酸化緩解UC（圖7）。

圖7 Western blot檢測COX-2和NF-κB表達及p38磷酸化Fig.7 Western blot detection of COX-2 and NF-κB expressions and p38 phosphorylation

3 討論

UC是一類發(fā)病率較高的非特異性腸道疾病，研究表明，UC與結(jié)腸癌發(fā)病密切相關，但現(xiàn)代醫(yī)學尚未明確UC的發(fā)病機制，目前多數(shù)研究認為其發(fā)病機制可能與環(huán)境、遺傳、腸道黏膜損傷、腸道黏膜菌群失調(diào)、腸道免疫反應異常、機體炎癥反應、個人體質(zhì)等因素有關，由于其發(fā)病機制復雜，目前臨床上尚無有效治療方法，主要治療藥物有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、生物抑制劑、微生態(tài)抑制劑、抗生素等［7］。但藥物治療和手術治療效果并不理想，復發(fā)和加重風險較大，副作用大，尋找新型有效的UC治療方法至關重要［8］。

干細胞治療是目前醫(yī)學領域研究熱點，MSCs具有較強的組織修復能力和再生能力，可向炎癥和組織損傷部位遷移分化，研究表明MSCs可治療UC，但仍存在限制，如個體差異大、培養(yǎng)周期長、機體免疫紊亂等［9-10］。外泌體作為細胞間信息交流的載體，可向靶細胞傳遞生物信息物質(zhì)，研究表明，MSCs外泌體可攜帶MSCs信息物質(zhì)，在MSCs旁分泌中起重要作用，利用外泌體治療不僅可產(chǎn)生與MSCs治療相似的效果，還可避免細胞治療的副作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體可顯著抑制UC小鼠體內(nèi)炎癥反應及結(jié)腸組織病理變化，提示MSCs外泌體有望成為UC治療的新方法。

TNF-α、IL-6、IL-1β是由巨噬細胞和T細胞等分泌的炎癥因子，可在結(jié)腸組織內(nèi)誘導炎癥反應破壞腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)及生理功能，且TNF-α、IL-6、IL-1β可直接作用于腸道黏膜細胞而引發(fā)細胞通透性增加，進而促進炎癥細胞浸潤，導致疾病發(fā)生發(fā)展［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體可顯著抑制小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β表達及結(jié)腸組織炎癥細胞浸潤。

COX-2是COX主要亞型之一，是一種早期應答基因，在正常結(jié)腸組織中不表達或低表達，而在UC結(jié)腸組織中高表達［14-15］。研究表明，NF-κB信號通路異常激活是UC發(fā)生發(fā)展的重要因素，其影響UC的主要機制為COX-2的啟動子含有NF-κB結(jié)合位點，在炎癥因子等病理條件刺激下，NF-κB家族成員降解，導致NF-κB與IκB分離，釋放的NF-κB可明顯促進COX-2表達，COX-2高表達引發(fā)結(jié)腸組織充血、糜爛等［16］。

p38 MAPK與炎癥反應密切相關，結(jié)腸炎癥因子可激活p38 MAPK信號通路，通過磷酸化反應激活下游IκB磷酸化和泛素化，進而激活NF-κB信號通路，促進COX-2表達，導致UC發(fā)展［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體可顯著抑制NF-κB和COX-2表達及p38 MAPK磷酸化。

綜上所述，MSCs可顯著緩解UC，主要機制可能為抑制體內(nèi)炎癥反應、NF-κB和COX-2表達及p38 MAPK磷酸化，但外泌體內(nèi)含有多種物質(zhì)，包括多種miRNA、lncRNA、蛋白、脂質(zhì)等，MSCs外泌體中l(wèi)ncRNA MALAT1可調(diào)控NF-κB信號通路［19］，但外泌體lncRNA MALAT1是否可調(diào)控UC有待進一步探究。