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    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的制備及初步生物學(xué)評價(jià)

    2021-08-20 02:33:28董瑞林宋志浩張?zhí)N瀚陳孟毅邱珊珊王成龍成偉華
    核技術(shù) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:荷瘤生長抑素多肽

    高 菲 董瑞林 宋志浩 張?zhí)N瀚 陳孟毅 邱珊珊 王成龍 許 林 成偉華

    (原子高科股份有限公司 北京102413)

    神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(Neuroendocrine Tumors,NETs)是一類起源于不同神經(jīng)內(nèi)分泌器官的一組異質(zhì)性腫瘤,主要以胃、腸和胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤多見,發(fā)病率約為十萬分之七[1-3]。NETs的罕見性和無癥狀的臨床過程使得漏診和誤診率高,近60%的患者在初診時(shí)發(fā)現(xiàn)已處于晚期[4]。生長抑素受體(Somatostatin Receptor,SSTR)為七螺旋G蛋白偶聯(lián)糖蛋白跨膜受體,有5種不同的分子亞型[5],研究表明高達(dá)94%的NETs細(xì)胞表面有SSTR的高表達(dá),甚至一些低分化的腫瘤細(xì)胞中也有SSTR的表達(dá)。SSTR成為診斷和治療NETs并進(jìn)行治療的重要靶點(diǎn)。

    從20世紀(jì)80年代至今,已經(jīng)報(bào)道并評估了許多放射性標(biāo)記的SSTR靶向分子探針[6-9]。其中奧曲肽作為一種人工合成的生長抑素類似物,因其理想的代謝半衰期,使得放射性核素標(biāo)記的奧曲肽及其類似物的研究成為熱點(diǎn)。例如,采用治療核素放射性標(biāo)記的SSTR激動(dòng)劑(如90Y-或177Lu-DOTATOC和177Lu-DOTATATE),可進(jìn)行肽受體放射性核素治療(Peptide Receptor Radionuclide Therapy,PRRT)[10],以及用于正電子發(fā)射斷層顯像(Positron Emission Tomography,PET)的68Ga標(biāo)記的SSTR激動(dòng) 劑68Ga-DOTATOC[11]、68Ga-DOTANOC和68Ga-DOTATATE[12],可對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)行顯像定位。SSTR-PET/CT在檢測原發(fā)性腫瘤、未知原發(fā)性腫瘤、分期、再灌注和評估NETs患者的治療反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用,18F標(biāo)記的多肽類似物也成為熱門的研究方向。

    與其他放射性核素相比,18F核素產(chǎn)生的正電子能量較低,最高只有0.635 MeV,平均為0.25 MeV,其在組織中湮滅距離短(約2.4 mm),具有合適的半衰期(t1/2=109.8 min),可以得到高分辨率的圖像,因此成為臨床應(yīng)用最廣泛、最理想的PET顯像核素。Schottelius等[13]報(bào) 道 的Cel-S-Dpr([18F]FBOA)TOCA展現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)和較高的腫瘤與背景比值,并且首次在患者研究中證實(shí)了PET成像潛力,然而較低標(biāo)記效率限制18F-肽標(biāo)記在臨床上的應(yīng)用。之后,Wester等[14]報(bào)道18F-FP-Gluc-TOCA展現(xiàn)出較高的腫瘤特異性和較好的對比度,成為SSTR陽性腫瘤PET成像示蹤劑,并應(yīng)用于臨床,但由于標(biāo)記過程繁瑣,很大程度上影響臨床使用。William、江大衛(wèi)、李葆元等[15-18]發(fā)表的Al18F復(fù)合物偶聯(lián)雙功能螯合劑(NOTA、DOTA等)標(biāo)記方法的應(yīng)用很大程度上推動(dòng)18F標(biāo)記多肽類正電子藥物的進(jìn)展,該方法標(biāo)記簡單、快速,可在水環(huán)境中實(shí)現(xiàn)18F核素的標(biāo)記。溫凱、郭飛虎等[19-20]研究糖基化奧曲肽衍生物18FTa-Gluc-TOCA以 及n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA探針,水溶性好,體內(nèi)外穩(wěn)定。通過生物分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在生長抑素受體高表達(dá)的胰腺中有一定的攝取,其中18F-Ta-Gluc-TOCA在腫瘤內(nèi)保留時(shí)間較長,有望用于生長抑素受體陽性腫瘤PET顯像劑。近期,美國國立衛(wèi)生研究院生物醫(yī)學(xué)影像與生物工程研究所陳小元教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合廈門大學(xué)分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心以RGD2為靶向分子、PEG4為連接基團(tuán)偶聯(lián)NOTA后,通過Al18F標(biāo)記,先后開發(fā)出氟[18F]阿法和18F-阿法肽(18F-AlfatideⅡ)。與世界同類產(chǎn)品相比,氟[18F]阿法肽不僅有親和力高、非靶本底清除速度較快,而且穩(wěn)定性好、標(biāo)記過程簡單易于操作[21]。2018年,中國國家藥品監(jiān)督管理局授予18F-AlfatideⅡ臨床試驗(yàn)批件,成為國內(nèi)首個(gè)獲批的正電子放射性一類新藥。這進(jìn)一步表明Al18F標(biāo)記方法標(biāo)記多肽是具有良好應(yīng)用前景。

    KE108多肽作為生長抑素類似物,具有和奧曲肽相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),并且在對5種不同亞型受體都具有較高的親和力(表1),對于SSTR陽性腫瘤具有廣譜性[23]。研究發(fā)現(xiàn),奧曲肽的糖基化可降低多肽的親脂性和肝膽代謝,優(yōu)化體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)[24]。2016年,張健等采用99Tcm間接標(biāo)記的方法,利用雙功能螯合劑(Hydrazinonicotinamide,HYNIC),分別以Tricine[三(羥甲基)甲基甘氨酸]和乙二胺-N,N-二乙酸為協(xié)同配體對多肽KE108進(jìn)行標(biāo)記99Tcm[25]。優(yōu)化之后的標(biāo)記率90%以上,標(biāo)記物99Tcm-HYNICKE108在腫瘤組織中有較好攝取率,并且給藥后1 h內(nèi)腫瘤顯像較為清晰,說明KE108多肽對生長抑素受體具有一定的靶向性和親和力。

    表1 生長抑素及其類似物對SSTR不同亞型的親和力(IC50/nmol·L-1)Table 1 Binding affinity of somatostatin and its analogues to all sst subtypes(IC50/nmol·L-1)

    本研究通過對KE108多肽進(jìn)行化學(xué)修飾,設(shè)計(jì)并制備了一種新型通過偶聯(lián)雙功能螯合劑NOTA的糖基化生長抑素類似物,通過標(biāo)記18F核素得到Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108以靶向SSTR陽性腫瘤,分別在體內(nèi)外進(jìn)行生物學(xué)評價(jià),評估其用于SSTR陽性腫瘤早期診斷的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    ECLIPSE HP型回旋加速器(德國Siemens公司);PET/CT(比利時(shí)Molecube公司);自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀(Perkinelmer Wallac公司);ESI-MS質(zhì)譜儀(美國Capintec公司);MH-2800加熱模塊;活度計(jì)CRC-15;CBN-20A高效液相儀(日本Shimadzu公司);色譜柱Agilent ZORBAX XDB-C18,5μm,4.6 mm×250 mm;GABI型放射性檢測器(德國Raytest公司)。

    Fmoc-Phe-CTC Resin、O-苯并三氮唑-四甲基脲六 氟 磷 酸 鹽(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate,HBTU)、N-甲基嗎啉(4-Methylmorpholine,NMM)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride,EDC·HCl)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Glucose-Lys(Fmoc)-OH、NOTA(OtBu)、鈀碳(Pd/C)、哌啶(Piperidine,Pip)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、六 氟 異 丙 醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)、二 氯 甲 烷(Dichloromethane,DCM)、甲 醇、乙 二 硫 醇(Ethanedithiol,EDT)、冰 乙 醚、三 氟 乙 酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、1-羥基苯并三唑(NHydroxybenzotrizole,HOBT)、乙腈、六水合三氯化鋁(百靈威科技有限公司);H218O(江蘇華益科技有限公司);龍膽酸(阿拉?。?。

    1.2 多肽合成

    Gluc-Lys(NOTA)-KE108結(jié)構(gòu)及其合成路線見圖1和圖2。稱量0.3 mmol·g-1的Fmoc-Phe-CTC Resin 5 g,20%Pip/DMF脫保護(hù)30 min,之后按當(dāng)量比例(AA:HBTU:NMM=3:2.85:6)投入原料,加入適量DMF,鼓氮?dú)夥磻?yīng)30 min,通過茚三酮檢測反應(yīng)完全,用DMF、DCM、甲醇依次洗滌;重復(fù)上述步驟,得 到Fmoc-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe-CTC Resin(樹脂肽)。將樹脂肽置于30%HFIP/DCM中,搖床控溫1 h,抽濾收集濾液,旋蒸濃縮得到粗品Fmoc-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe-OH(1)。

    圖1 Gluc-Lys(NOTA)-KE108的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    圖2 Gluc-Lys(NOTA)-KE108的合成路線Fig.2 Synthetic route of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    將1溶解于DCM中,分別加入EDC·HCl、HOBT(1.2當(dāng)量)和NMM(2當(dāng)量),攪拌反應(yīng)過夜,旋蒸濃縮得到環(huán)化后的粗品Cyclo(Fmoc-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(2)。

    將2溶解于20%Pip/DMF中,攪拌反應(yīng)1 h,濃縮,然后依次加入1.1當(dāng)量的Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶解于DMF中,之后添加EDC·HCl、HOBT(1.2當(dāng)量)和NMM(2當(dāng)量),之后用20%Pip/DMF處理1 h,濃縮后得到粗品Tyr(tBu)-Cyclo(H-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(3)。

    重復(fù)上述步驟,連接Glucose-Lys(Fmoc)-OH得到粗產(chǎn)品Gluc-Lys-H-Tyr(tBu)-Cyclo(H-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-LysThr(tBu)-Phe)(4)。

    重復(fù)上述步驟,繼續(xù)連接NOTA(OtBu)得到粗品Gluc-Lys-(NOTA(OtBu))-H-Tyr(tBu)-Cyclo(HDab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(5)。

    將5溶解于甲醇中,加入Pd/C氫化后得到粗品Gluc-Lys(NOTA(OtBu))-H-Tyr(tBu)-Cyclo(H-Dab-Arg-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(6)。

    將6溶解于TFA/EDT/H2O=95/2.5/2.5切割液,搖床控溫3 h,抽濾,收集濾液后加入6倍體積冰乙醚,離心沉淀收集固體,將沉淀的粗品用乙醚洗三遍,干燥后用反相高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)純化,得到最終的產(chǎn)品Gluc-Lys(NOTA)-KE108。

    1.3 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108制備

    向西林瓶中依次加入0.1 mol·L-1醋酸緩沖液(100μL,pH=4.0),AlCl3的0.1 mol·L-1醋酸緩沖液(3μL,2 mmol·L-1),10μL 1 mg·mL-1的龍膽酸,100μL[18F]F-生理鹽水溶液,200μL無水乙腈,加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108(50μL,1 mg·mL-1),95℃反應(yīng)10 min,冷卻至常溫。用1 mL去離子水稀釋,取其中20μL用HPLC測定標(biāo)記率。然后標(biāo)記物緩慢上Sep-pak C-18 light柱(預(yù)先活化,用10 mL無水乙醇、10 mL純化水活化后吹干),用5 mL純化水洗去未反應(yīng)的18F氟離子等水溶性雜質(zhì),用1 mL的75%乙醇淋洗下產(chǎn)品,通過氮吹除去乙醇,并加入適量生理鹽水稀釋。

    利用高效液相色譜儀對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記率、比活度、放射性化學(xué)純度的測定,液相條件如表2所示。

    表2 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108高效液相色譜條件Table 2 HPLC conditions of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108

    1.4 理化性質(zhì)研究

    1.4.1 脂水分配系數(shù)

    取500μL正辛醇、400μL磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline,PBS)溶液置于2 mL離心管內(nèi),之后加入100μL Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108注射液。將混合液劇烈旋渦充分混合1 min,并以10 000 min-1的速度離心5 min。從上述溶液中提取100μL有機(jī)相,添加到含有400μL正辛醇和500μL PBS的新離心管中,重復(fù)上述步驟三次。分別取100μL有機(jī)相和水相(n=5)溶液,使用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀測定,計(jì)算脂水分配系數(shù)(lgP值)。

    1.4.2 體外穩(wěn)定性

    在體外分別進(jìn)行標(biāo)記物在生理鹽水和10%小牛血清中的穩(wěn)定性測定。檢測在生理鹽水中的穩(wěn)定性:將37 MBq Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108溶于生理鹽水中,在室溫下放置2 h,通過HPLC測定標(biāo)記物在0.5 h、1 h和2 h的放射性化學(xué)純度。檢測在血清中的穩(wěn)定性:將37 MBq Gluc-Lys([18F]NOTA)-KE108溶于1 mL小牛血清中,37℃孵育,分別在0.5 h、1 h和2 h取300μL上述血清,加入相同體積的乙腈渦旋、離心,取上清液通過0.22μm過濾器,用HPLC進(jìn)行檢測。

    1.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及荷瘤鼠構(gòu)建

    所有細(xì)胞株均培養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,SSTR陽性腫瘤AR42J和BON1細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將AR42J細(xì)胞種于BALB/c小鼠(20 g左右)右上肢腋下(腫瘤直徑為0.5~1.0 cm)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

    1.5.2 細(xì)胞飽和實(shí)驗(yàn)

    將生長狀態(tài)良好的AR42J和BON1細(xì)胞分別鋪于24孔板,細(xì)胞數(shù)量約為1×105,培養(yǎng)24 h。向每孔內(nèi)加入Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108(放射性濃度范圍1~250 nmol·L-1),抑制組加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108(每孔10μL,100μg·mL-1)阻斷細(xì)胞攝取,在37℃孵育1 h。然后用1 mL PBS(pH=7.4)洗滌兩次細(xì)胞,最后使用1 mL NaOH(1 mol·L-1)消化5 min裂解細(xì)胞。采用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀測量收集的放射性活度。采用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算Bmax和Kd值。

    1.5.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    向生長狀態(tài)良好的每孔AR42J和BON1細(xì)胞內(nèi)加 入37 kBq Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在37℃培養(yǎng)15 min、0.5 h、1 h、2 h后,抑制組加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108(每孔10μL,100μg·mL-1)阻斷細(xì)胞攝取,之后用1 mL PBS(pH=7.4)洗滌兩次細(xì)胞,使用1 mL NaOH(1 mol·L-1)消化5 min裂解細(xì)胞,最后計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的攝取率。攝取率=細(xì)胞中的放射性計(jì)數(shù)/總放射性計(jì)數(shù)×100%。

    1.6 PET顯像研究

    取AR42J荷瘤鼠,正常組經(jīng)尾靜脈給藥(3.7 MBq(100μL·只)),分別在給藥后0.5 h、1 h、2 h和3 h進(jìn)行PET顯像,小鼠呈俯臥位,使用異氟烷和氧氣混合全身麻醉下掃描。抑制組在Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108給藥前0.5 h注射Gluc-Lys(NOTA)-KE108前體(100μg/125μL),使用異氟烷和氧氣混合全身麻醉下掃描小鼠。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行衰減校正。勾畫腫瘤感興趣區(qū)(Region of interest,ROI),記錄ROI內(nèi)的平均計(jì)數(shù)[(%ID·g-1,-x±s)]。使用Prism軟件計(jì)算各主要部位的Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108富集以及靶與非靶比值。

    1.7 生物分布研究

    取8只AR42J荷瘤鼠隨機(jī)分為兩組,每組4只。正 常 組 靜 脈 注 射0.18 MBq Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108后,觀察探針在AR42J荷瘤鼠體內(nèi)的分布情況。抑制組將Gluc-Lys(NOTA)-KE108(100μg)和Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108共注射(n=4),小鼠在注射后1 h處死并解剖,取心、肝、脾、肺、骨、腫瘤等組織和臟器,稱取重量,用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀計(jì)算放射性計(jì)數(shù),計(jì)算各組織%ID·g-1。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 多肽合成

    采用Fmoc固相合成法,通過氨基酸縮合,樹脂上多肽的切除,多肽的環(huán)化,反相HPLC分離純化,得到最終的產(chǎn)品Gluc-Lys(NOTA)-KE108。由質(zhì)譜圖(圖3)可知,ESI-MS(+)m/z:1 852.8,說明制備得到的多肽分子量與Gluc-Lys(NOTA)-KE108理論分子量(1 852.1)相符合。通過HPLC分析(圖4)可知,其純度大于95%,保留時(shí)間為9.09 min。

    圖3 Gluc-Lys(NOTA)-KE108多肽質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    2.2 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108制備

    通過HPLC分析,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108保留時(shí)間為9.69 min(圖4),與Gluc-Lys(NOTA)-KE108多肽的HPLC保留一致(9.09 min),由此確定標(biāo)記化合物制備完成。Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108標(biāo)記率為(30±5)%(n=6),放射化產(chǎn)率為(20±5)%(n=6),經(jīng)HPLC檢測放射性純度大于95%,比活度大于1.37 GBq·μmol-1。

    圖4 Gluc-Lys(NOTA)-KE108與Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的HPLC分析圖譜Fig.4 HPLC analysis of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 and non-radioactive compound Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    2.3 理化性質(zhì)研究

    測得Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在正辛醇和PBS中的脂水分配系數(shù)lgP=-2.172±0.03(n=3),說明該探針呈水溶性,利于腎臟代謝。通過HPLC分析可知,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在生理鹽水和小牛血清中都很穩(wěn)定(圖5),放置2 h放化純均大于95%。

    圖5 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在生理鹽水(a)和血清中(b)的體外穩(wěn)定性分析圖譜Fig.5 In vitro stability of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in saline(a)and serum(b)

    2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    2.4.1 細(xì)胞飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J和BON1細(xì)胞中的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在AR42J細(xì)胞中Kd值為(152.3±49.1)nmol·L-1(n=4),Bmax為7.8×104min-1/105細(xì)胞。在BON1細(xì)胞中的Kd值 為(45.5±13.6)nmol·L-1(n=4),Bmax為1.9×104min-1/105細(xì)胞。Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108展現(xiàn)了較高的SSTR靶向能力。

    圖6 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J(a)和BON1(b)細(xì)胞中飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig.6 Saturation binding experimental results of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J(a)and BON1(b)cells

    2.4.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J和BON1細(xì)胞中攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J細(xì)胞中攝取率隨時(shí)間延長不斷增加,在1.5 h達(dá)最大值為(5.31±0.37)%,明顯高于抑制組(2.84±0.09)%。在BON1細(xì)胞中攝取率在30 min達(dá)最大,為(4.83±0.53)%,同樣探針能夠被特異性抑制((2.12±0.53)%)。

    圖7 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J(a)和BON1(b)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的攝取Fig.7 Uptake of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J(a)and BON1(b)cells at the indicated time points

    2.5 PET顯像研究

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J和BON1腫瘤細(xì)胞均具有良好的細(xì)胞親和力和特異性,我們選擇在AR42J腫瘤鼠中進(jìn)行PET顯像。結(jié)果顯示:Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在肝臟和腎臟攝取值高,說明可通過腎臟和肝膽進(jìn)行清除,AR42J腫瘤攝取在注射后0.5 h達(dá)到峰值((2.25±0.44)%ID·g-1),之后稍微降低并逐漸趨于平穩(wěn)(圖8(a)),但由于周圍器官攝取值較高,對比度較低(圖8(b)),注射后1~2 h為顯像最佳時(shí)間。

    圖8 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的PET顯像(a)及定量分析(b)Fig.8 PET imaging(a)and quantitative analysis(b)of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J tumor-bearing mice at the indicated time points

    采用Gluc-Lys(NOTA)-KE108進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn),評價(jià)Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J腫瘤中的結(jié)合特異性和選擇性(圖9)。將Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108與Gluc-Lys(NOTA)-KE108共注射后1 h進(jìn)行PET顯像。結(jié)果顯示:腫瘤部位的放射性攝取顯著降低,攝取值(1.65±0.33)%ID·g-1和(0.82±0.17)%ID·g-1。其腫瘤部位的攝取與肌肉攝取基本一致,顯示Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的攝取機(jī)制是以SSTR介導(dǎo)。

    圖9 有無添加抑制劑注射Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 1 h后AR42J荷瘤鼠體內(nèi)的PET顯像(a)及定量分析(b)Fig.9 PET imaging(a)and quantitative analysis(b)of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J tumor-bearing mice with or without adding inhibitor after 1-h injection

    2.6 生物分布研究

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中生物分布數(shù)據(jù)如表3所示。由表3可知,在給藥后1 h,探針在腎臟的放射性攝取最高,同時(shí)肝臟對該探針的攝取也相對較高。當(dāng)然,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在骨中也有少量的攝取,說明探針在體內(nèi)未發(fā)生明顯的分解,在血液中的攝取較低,說明探針可以快速地分布在組織器官中,在SSTR表達(dá)較多的腎上腺中具有一定的攝取,表明其與SSTR具有親和力。在腫瘤中放射性攝取值為(2.04±0.40)%ID·g-1,并且加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108以被明顯抑制,攝取值為(1.15±0.08)%ID·g-1,同樣的在腎上腺組織也表現(xiàn)出相同的放射性攝取抑制,表明探針具有SSTR靶向性和特異性。

    表3 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中注射后1 h生物分布(n=4)Table 3 Biodistribution results of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in SSTR-positive AR42J tumor-bearing mice for 1 h(n=4)

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用Fmoc固相合成法,合成得到Gluc-Lys(NOTA)-KE108生長抑素類似物。Al18F復(fù)合物和Gluc-Lys(NOTA)-KE108通過螯合反應(yīng)制備了Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108,經(jīng)過Sep-pak C-18 light柱純化之后放化純大于95%,總合成時(shí)間為20 min。水溶性較好,在生理鹽水和小牛血清中放置2 h后,放化純大于95%,體現(xiàn)出良好的體外穩(wěn)定性。而采用協(xié)同配體進(jìn)行間接標(biāo)記的99Tcm-HYNICKE108[25],兩步法標(biāo)記工藝復(fù)雜,耗費(fèi)時(shí)間。多個(gè)協(xié)同配體的加入給產(chǎn)物的純化也帶來了一定的困難。Al18F標(biāo)記方法雖然標(biāo)記率較低,但是制備工藝簡單易于操作,并且穩(wěn)定可靠重復(fù)性高。而且Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108采用了糖基化修飾的KE108多肽作為標(biāo)記前體,可增加在腫瘤部位的攝取。與18F-Ta-Gluc-TOCA[19]相比,腫瘤的攝取相當(dāng)。通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該探針在PET顯像中展現(xiàn)了良好的SSTR靶向性和特異性,在AR42J和BON1細(xì)胞上的受體表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力和特異性。但是,在生物分布實(shí)驗(yàn)中,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108少量的骨攝取,表明探針在體內(nèi)具有輕微的不穩(wěn)定性,下一步將準(zhǔn)備添加穩(wěn)定劑進(jìn)行進(jìn)一步探索。

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