• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的制備及初步生物學(xué)評價(jià)

    2021-08-20 02:33:28董瑞林宋志浩張?zhí)N瀚陳孟毅邱珊珊王成龍成偉華
    核技術(shù) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:荷瘤生長抑素多肽

    高 菲 董瑞林 宋志浩 張?zhí)N瀚 陳孟毅 邱珊珊 王成龍 許 林 成偉華

    (原子高科股份有限公司 北京102413)

    神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(Neuroendocrine Tumors,NETs)是一類起源于不同神經(jīng)內(nèi)分泌器官的一組異質(zhì)性腫瘤,主要以胃、腸和胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤多見,發(fā)病率約為十萬分之七[1-3]。NETs的罕見性和無癥狀的臨床過程使得漏診和誤診率高,近60%的患者在初診時(shí)發(fā)現(xiàn)已處于晚期[4]。生長抑素受體(Somatostatin Receptor,SSTR)為七螺旋G蛋白偶聯(lián)糖蛋白跨膜受體,有5種不同的分子亞型[5],研究表明高達(dá)94%的NETs細(xì)胞表面有SSTR的高表達(dá),甚至一些低分化的腫瘤細(xì)胞中也有SSTR的表達(dá)。SSTR成為診斷和治療NETs并進(jìn)行治療的重要靶點(diǎn)。

    從20世紀(jì)80年代至今,已經(jīng)報(bào)道并評估了許多放射性標(biāo)記的SSTR靶向分子探針[6-9]。其中奧曲肽作為一種人工合成的生長抑素類似物,因其理想的代謝半衰期,使得放射性核素標(biāo)記的奧曲肽及其類似物的研究成為熱點(diǎn)。例如,采用治療核素放射性標(biāo)記的SSTR激動(dòng)劑(如90Y-或177Lu-DOTATOC和177Lu-DOTATATE),可進(jìn)行肽受體放射性核素治療(Peptide Receptor Radionuclide Therapy,PRRT)[10],以及用于正電子發(fā)射斷層顯像(Positron Emission Tomography,PET)的68Ga標(biāo)記的SSTR激動(dòng) 劑68Ga-DOTATOC[11]、68Ga-DOTANOC和68Ga-DOTATATE[12],可對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)行顯像定位。SSTR-PET/CT在檢測原發(fā)性腫瘤、未知原發(fā)性腫瘤、分期、再灌注和評估NETs患者的治療反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用,18F標(biāo)記的多肽類似物也成為熱門的研究方向。

    與其他放射性核素相比,18F核素產(chǎn)生的正電子能量較低,最高只有0.635 MeV,平均為0.25 MeV,其在組織中湮滅距離短(約2.4 mm),具有合適的半衰期(t1/2=109.8 min),可以得到高分辨率的圖像,因此成為臨床應(yīng)用最廣泛、最理想的PET顯像核素。Schottelius等[13]報(bào) 道 的Cel-S-Dpr([18F]FBOA)TOCA展現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)和較高的腫瘤與背景比值,并且首次在患者研究中證實(shí)了PET成像潛力,然而較低標(biāo)記效率限制18F-肽標(biāo)記在臨床上的應(yīng)用。之后,Wester等[14]報(bào)道18F-FP-Gluc-TOCA展現(xiàn)出較高的腫瘤特異性和較好的對比度,成為SSTR陽性腫瘤PET成像示蹤劑,并應(yīng)用于臨床,但由于標(biāo)記過程繁瑣,很大程度上影響臨床使用。William、江大衛(wèi)、李葆元等[15-18]發(fā)表的Al18F復(fù)合物偶聯(lián)雙功能螯合劑(NOTA、DOTA等)標(biāo)記方法的應(yīng)用很大程度上推動(dòng)18F標(biāo)記多肽類正電子藥物的進(jìn)展,該方法標(biāo)記簡單、快速,可在水環(huán)境中實(shí)現(xiàn)18F核素的標(biāo)記。溫凱、郭飛虎等[19-20]研究糖基化奧曲肽衍生物18FTa-Gluc-TOCA以 及n-Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-TOCA探針,水溶性好,體內(nèi)外穩(wěn)定。通過生物分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在生長抑素受體高表達(dá)的胰腺中有一定的攝取,其中18F-Ta-Gluc-TOCA在腫瘤內(nèi)保留時(shí)間較長,有望用于生長抑素受體陽性腫瘤PET顯像劑。近期,美國國立衛(wèi)生研究院生物醫(yī)學(xué)影像與生物工程研究所陳小元教授實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合廈門大學(xué)分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心以RGD2為靶向分子、PEG4為連接基團(tuán)偶聯(lián)NOTA后,通過Al18F標(biāo)記,先后開發(fā)出氟[18F]阿法和18F-阿法肽(18F-AlfatideⅡ)。與世界同類產(chǎn)品相比,氟[18F]阿法肽不僅有親和力高、非靶本底清除速度較快,而且穩(wěn)定性好、標(biāo)記過程簡單易于操作[21]。2018年,中國國家藥品監(jiān)督管理局授予18F-AlfatideⅡ臨床試驗(yàn)批件,成為國內(nèi)首個(gè)獲批的正電子放射性一類新藥。這進(jìn)一步表明Al18F標(biāo)記方法標(biāo)記多肽是具有良好應(yīng)用前景。

    KE108多肽作為生長抑素類似物,具有和奧曲肽相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),并且在對5種不同亞型受體都具有較高的親和力(表1),對于SSTR陽性腫瘤具有廣譜性[23]。研究發(fā)現(xiàn),奧曲肽的糖基化可降低多肽的親脂性和肝膽代謝,優(yōu)化體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)[24]。2016年,張健等采用99Tcm間接標(biāo)記的方法,利用雙功能螯合劑(Hydrazinonicotinamide,HYNIC),分別以Tricine[三(羥甲基)甲基甘氨酸]和乙二胺-N,N-二乙酸為協(xié)同配體對多肽KE108進(jìn)行標(biāo)記99Tcm[25]。優(yōu)化之后的標(biāo)記率90%以上,標(biāo)記物99Tcm-HYNICKE108在腫瘤組織中有較好攝取率,并且給藥后1 h內(nèi)腫瘤顯像較為清晰,說明KE108多肽對生長抑素受體具有一定的靶向性和親和力。

    表1 生長抑素及其類似物對SSTR不同亞型的親和力(IC50/nmol·L-1)Table 1 Binding affinity of somatostatin and its analogues to all sst subtypes(IC50/nmol·L-1)

    本研究通過對KE108多肽進(jìn)行化學(xué)修飾,設(shè)計(jì)并制備了一種新型通過偶聯(lián)雙功能螯合劑NOTA的糖基化生長抑素類似物,通過標(biāo)記18F核素得到Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108以靶向SSTR陽性腫瘤,分別在體內(nèi)外進(jìn)行生物學(xué)評價(jià),評估其用于SSTR陽性腫瘤早期診斷的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    ECLIPSE HP型回旋加速器(德國Siemens公司);PET/CT(比利時(shí)Molecube公司);自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀(Perkinelmer Wallac公司);ESI-MS質(zhì)譜儀(美國Capintec公司);MH-2800加熱模塊;活度計(jì)CRC-15;CBN-20A高效液相儀(日本Shimadzu公司);色譜柱Agilent ZORBAX XDB-C18,5μm,4.6 mm×250 mm;GABI型放射性檢測器(德國Raytest公司)。

    Fmoc-Phe-CTC Resin、O-苯并三氮唑-四甲基脲六 氟 磷 酸 鹽(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate,HBTU)、N-甲基嗎啉(4-Methylmorpholine,NMM)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride,EDC·HCl)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Glucose-Lys(Fmoc)-OH、NOTA(OtBu)、鈀碳(Pd/C)、哌啶(Piperidine,Pip)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、六 氟 異 丙 醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)、二 氯 甲 烷(Dichloromethane,DCM)、甲 醇、乙 二 硫 醇(Ethanedithiol,EDT)、冰 乙 醚、三 氟 乙 酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、1-羥基苯并三唑(NHydroxybenzotrizole,HOBT)、乙腈、六水合三氯化鋁(百靈威科技有限公司);H218O(江蘇華益科技有限公司);龍膽酸(阿拉?。?。

    1.2 多肽合成

    Gluc-Lys(NOTA)-KE108結(jié)構(gòu)及其合成路線見圖1和圖2。稱量0.3 mmol·g-1的Fmoc-Phe-CTC Resin 5 g,20%Pip/DMF脫保護(hù)30 min,之后按當(dāng)量比例(AA:HBTU:NMM=3:2.85:6)投入原料,加入適量DMF,鼓氮?dú)夥磻?yīng)30 min,通過茚三酮檢測反應(yīng)完全,用DMF、DCM、甲醇依次洗滌;重復(fù)上述步驟,得 到Fmoc-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe-CTC Resin(樹脂肽)。將樹脂肽置于30%HFIP/DCM中,搖床控溫1 h,抽濾收集濾液,旋蒸濃縮得到粗品Fmoc-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe-OH(1)。

    圖1 Gluc-Lys(NOTA)-KE108的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    圖2 Gluc-Lys(NOTA)-KE108的合成路線Fig.2 Synthetic route of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    將1溶解于DCM中,分別加入EDC·HCl、HOBT(1.2當(dāng)量)和NMM(2當(dāng)量),攪拌反應(yīng)過夜,旋蒸濃縮得到環(huán)化后的粗品Cyclo(Fmoc-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(2)。

    將2溶解于20%Pip/DMF中,攪拌反應(yīng)1 h,濃縮,然后依次加入1.1當(dāng)量的Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶解于DMF中,之后添加EDC·HCl、HOBT(1.2當(dāng)量)和NMM(2當(dāng)量),之后用20%Pip/DMF處理1 h,濃縮后得到粗品Tyr(tBu)-Cyclo(H-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(3)。

    重復(fù)上述步驟,連接Glucose-Lys(Fmoc)-OH得到粗產(chǎn)品Gluc-Lys-H-Tyr(tBu)-Cyclo(H-Dab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-LysThr(tBu)-Phe)(4)。

    重復(fù)上述步驟,繼續(xù)連接NOTA(OtBu)得到粗品Gluc-Lys-(NOTA(OtBu))-H-Tyr(tBu)-Cyclo(HDab-Arg(NO2)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(5)。

    將5溶解于甲醇中,加入Pd/C氫化后得到粗品Gluc-Lys(NOTA(OtBu))-H-Tyr(tBu)-Cyclo(H-Dab-Arg-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys-Thr(tBu)-Phe)(6)。

    將6溶解于TFA/EDT/H2O=95/2.5/2.5切割液,搖床控溫3 h,抽濾,收集濾液后加入6倍體積冰乙醚,離心沉淀收集固體,將沉淀的粗品用乙醚洗三遍,干燥后用反相高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)純化,得到最終的產(chǎn)品Gluc-Lys(NOTA)-KE108。

    1.3 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108制備

    向西林瓶中依次加入0.1 mol·L-1醋酸緩沖液(100μL,pH=4.0),AlCl3的0.1 mol·L-1醋酸緩沖液(3μL,2 mmol·L-1),10μL 1 mg·mL-1的龍膽酸,100μL[18F]F-生理鹽水溶液,200μL無水乙腈,加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108(50μL,1 mg·mL-1),95℃反應(yīng)10 min,冷卻至常溫。用1 mL去離子水稀釋,取其中20μL用HPLC測定標(biāo)記率。然后標(biāo)記物緩慢上Sep-pak C-18 light柱(預(yù)先活化,用10 mL無水乙醇、10 mL純化水活化后吹干),用5 mL純化水洗去未反應(yīng)的18F氟離子等水溶性雜質(zhì),用1 mL的75%乙醇淋洗下產(chǎn)品,通過氮吹除去乙醇,并加入適量生理鹽水稀釋。

    利用高效液相色譜儀對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記率、比活度、放射性化學(xué)純度的測定,液相條件如表2所示。

    表2 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108高效液相色譜條件Table 2 HPLC conditions of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108

    1.4 理化性質(zhì)研究

    1.4.1 脂水分配系數(shù)

    取500μL正辛醇、400μL磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline,PBS)溶液置于2 mL離心管內(nèi),之后加入100μL Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108注射液。將混合液劇烈旋渦充分混合1 min,并以10 000 min-1的速度離心5 min。從上述溶液中提取100μL有機(jī)相,添加到含有400μL正辛醇和500μL PBS的新離心管中,重復(fù)上述步驟三次。分別取100μL有機(jī)相和水相(n=5)溶液,使用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀測定,計(jì)算脂水分配系數(shù)(lgP值)。

    1.4.2 體外穩(wěn)定性

    在體外分別進(jìn)行標(biāo)記物在生理鹽水和10%小牛血清中的穩(wěn)定性測定。檢測在生理鹽水中的穩(wěn)定性:將37 MBq Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108溶于生理鹽水中,在室溫下放置2 h,通過HPLC測定標(biāo)記物在0.5 h、1 h和2 h的放射性化學(xué)純度。檢測在血清中的穩(wěn)定性:將37 MBq Gluc-Lys([18F]NOTA)-KE108溶于1 mL小牛血清中,37℃孵育,分別在0.5 h、1 h和2 h取300μL上述血清,加入相同體積的乙腈渦旋、離心,取上清液通過0.22μm過濾器,用HPLC進(jìn)行檢測。

    1.5 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及荷瘤鼠構(gòu)建

    所有細(xì)胞株均培養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,SSTR陽性腫瘤AR42J和BON1細(xì)胞株用DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將AR42J細(xì)胞種于BALB/c小鼠(20 g左右)右上肢腋下(腫瘤直徑為0.5~1.0 cm)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

    1.5.2 細(xì)胞飽和實(shí)驗(yàn)

    將生長狀態(tài)良好的AR42J和BON1細(xì)胞分別鋪于24孔板,細(xì)胞數(shù)量約為1×105,培養(yǎng)24 h。向每孔內(nèi)加入Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108(放射性濃度范圍1~250 nmol·L-1),抑制組加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108(每孔10μL,100μg·mL-1)阻斷細(xì)胞攝取,在37℃孵育1 h。然后用1 mL PBS(pH=7.4)洗滌兩次細(xì)胞,最后使用1 mL NaOH(1 mol·L-1)消化5 min裂解細(xì)胞。采用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀測量收集的放射性活度。采用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算Bmax和Kd值。

    1.5.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    向生長狀態(tài)良好的每孔AR42J和BON1細(xì)胞內(nèi)加 入37 kBq Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在37℃培養(yǎng)15 min、0.5 h、1 h、2 h后,抑制組加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108(每孔10μL,100μg·mL-1)阻斷細(xì)胞攝取,之后用1 mL PBS(pH=7.4)洗滌兩次細(xì)胞,使用1 mL NaOH(1 mol·L-1)消化5 min裂解細(xì)胞,最后計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的攝取率。攝取率=細(xì)胞中的放射性計(jì)數(shù)/總放射性計(jì)數(shù)×100%。

    1.6 PET顯像研究

    取AR42J荷瘤鼠,正常組經(jīng)尾靜脈給藥(3.7 MBq(100μL·只)),分別在給藥后0.5 h、1 h、2 h和3 h進(jìn)行PET顯像,小鼠呈俯臥位,使用異氟烷和氧氣混合全身麻醉下掃描。抑制組在Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108給藥前0.5 h注射Gluc-Lys(NOTA)-KE108前體(100μg/125μL),使用異氟烷和氧氣混合全身麻醉下掃描小鼠。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行衰減校正。勾畫腫瘤感興趣區(qū)(Region of interest,ROI),記錄ROI內(nèi)的平均計(jì)數(shù)[(%ID·g-1,-x±s)]。使用Prism軟件計(jì)算各主要部位的Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108富集以及靶與非靶比值。

    1.7 生物分布研究

    取8只AR42J荷瘤鼠隨機(jī)分為兩組,每組4只。正 常 組 靜 脈 注 射0.18 MBq Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108后,觀察探針在AR42J荷瘤鼠體內(nèi)的分布情況。抑制組將Gluc-Lys(NOTA)-KE108(100μg)和Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108共注射(n=4),小鼠在注射后1 h處死并解剖,取心、肝、脾、肺、骨、腫瘤等組織和臟器,稱取重量,用自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀計(jì)算放射性計(jì)數(shù),計(jì)算各組織%ID·g-1。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 多肽合成

    采用Fmoc固相合成法,通過氨基酸縮合,樹脂上多肽的切除,多肽的環(huán)化,反相HPLC分離純化,得到最終的產(chǎn)品Gluc-Lys(NOTA)-KE108。由質(zhì)譜圖(圖3)可知,ESI-MS(+)m/z:1 852.8,說明制備得到的多肽分子量與Gluc-Lys(NOTA)-KE108理論分子量(1 852.1)相符合。通過HPLC分析(圖4)可知,其純度大于95%,保留時(shí)間為9.09 min。

    圖3 Gluc-Lys(NOTA)-KE108多肽質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    2.2 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108制備

    通過HPLC分析,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108保留時(shí)間為9.69 min(圖4),與Gluc-Lys(NOTA)-KE108多肽的HPLC保留一致(9.09 min),由此確定標(biāo)記化合物制備完成。Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108標(biāo)記率為(30±5)%(n=6),放射化產(chǎn)率為(20±5)%(n=6),經(jīng)HPLC檢測放射性純度大于95%,比活度大于1.37 GBq·μmol-1。

    圖4 Gluc-Lys(NOTA)-KE108與Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的HPLC分析圖譜Fig.4 HPLC analysis of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 and non-radioactive compound Gluc-Lys(NOTA)-KE108

    2.3 理化性質(zhì)研究

    測得Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在正辛醇和PBS中的脂水分配系數(shù)lgP=-2.172±0.03(n=3),說明該探針呈水溶性,利于腎臟代謝。通過HPLC分析可知,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在生理鹽水和小牛血清中都很穩(wěn)定(圖5),放置2 h放化純均大于95%。

    圖5 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在生理鹽水(a)和血清中(b)的體外穩(wěn)定性分析圖譜Fig.5 In vitro stability of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in saline(a)and serum(b)

    2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    2.4.1 細(xì)胞飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J和BON1細(xì)胞中的飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在AR42J細(xì)胞中Kd值為(152.3±49.1)nmol·L-1(n=4),Bmax為7.8×104min-1/105細(xì)胞。在BON1細(xì)胞中的Kd值 為(45.5±13.6)nmol·L-1(n=4),Bmax為1.9×104min-1/105細(xì)胞。Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108展現(xiàn)了較高的SSTR靶向能力。

    圖6 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J(a)和BON1(b)細(xì)胞中飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig.6 Saturation binding experimental results of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J(a)and BON1(b)cells

    2.4.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J和BON1細(xì)胞中攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J細(xì)胞中攝取率隨時(shí)間延長不斷增加,在1.5 h達(dá)最大值為(5.31±0.37)%,明顯高于抑制組(2.84±0.09)%。在BON1細(xì)胞中攝取率在30 min達(dá)最大,為(4.83±0.53)%,同樣探針能夠被特異性抑制((2.12±0.53)%)。

    圖7 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J(a)和BON1(b)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的攝取Fig.7 Uptake of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J(a)and BON1(b)cells at the indicated time points

    2.5 PET顯像研究

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J和BON1腫瘤細(xì)胞均具有良好的細(xì)胞親和力和特異性,我們選擇在AR42J腫瘤鼠中進(jìn)行PET顯像。結(jié)果顯示:Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在肝臟和腎臟攝取值高,說明可通過腎臟和肝膽進(jìn)行清除,AR42J腫瘤攝取在注射后0.5 h達(dá)到峰值((2.25±0.44)%ID·g-1),之后稍微降低并逐漸趨于平穩(wěn)(圖8(a)),但由于周圍器官攝取值較高,對比度較低(圖8(b)),注射后1~2 h為顯像最佳時(shí)間。

    圖8 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的PET顯像(a)及定量分析(b)Fig.8 PET imaging(a)and quantitative analysis(b)of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J tumor-bearing mice at the indicated time points

    采用Gluc-Lys(NOTA)-KE108進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn),評價(jià)Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J腫瘤中的結(jié)合特異性和選擇性(圖9)。將Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108與Gluc-Lys(NOTA)-KE108共注射后1 h進(jìn)行PET顯像。結(jié)果顯示:腫瘤部位的放射性攝取顯著降低,攝取值(1.65±0.33)%ID·g-1和(0.82±0.17)%ID·g-1。其腫瘤部位的攝取與肌肉攝取基本一致,顯示Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108的攝取機(jī)制是以SSTR介導(dǎo)。

    圖9 有無添加抑制劑注射Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 1 h后AR42J荷瘤鼠體內(nèi)的PET顯像(a)及定量分析(b)Fig.9 PET imaging(a)and quantitative analysis(b)of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in AR42J tumor-bearing mice with or without adding inhibitor after 1-h injection

    2.6 生物分布研究

    Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中生物分布數(shù)據(jù)如表3所示。由表3可知,在給藥后1 h,探針在腎臟的放射性攝取最高,同時(shí)肝臟對該探針的攝取也相對較高。當(dāng)然,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在骨中也有少量的攝取,說明探針在體內(nèi)未發(fā)生明顯的分解,在血液中的攝取較低,說明探針可以快速地分布在組織器官中,在SSTR表達(dá)較多的腎上腺中具有一定的攝取,表明其與SSTR具有親和力。在腫瘤中放射性攝取值為(2.04±0.40)%ID·g-1,并且加入Gluc-Lys(NOTA)-KE108以被明顯抑制,攝取值為(1.15±0.08)%ID·g-1,同樣的在腎上腺組織也表現(xiàn)出相同的放射性攝取抑制,表明探針具有SSTR靶向性和特異性。

    表3 Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108在AR42J荷瘤鼠中注射后1 h生物分布(n=4)Table 3 Biodistribution results of Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108 in SSTR-positive AR42J tumor-bearing mice for 1 h(n=4)

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用Fmoc固相合成法,合成得到Gluc-Lys(NOTA)-KE108生長抑素類似物。Al18F復(fù)合物和Gluc-Lys(NOTA)-KE108通過螯合反應(yīng)制備了Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108,經(jīng)過Sep-pak C-18 light柱純化之后放化純大于95%,總合成時(shí)間為20 min。水溶性較好,在生理鹽水和小牛血清中放置2 h后,放化純大于95%,體現(xiàn)出良好的體外穩(wěn)定性。而采用協(xié)同配體進(jìn)行間接標(biāo)記的99Tcm-HYNICKE108[25],兩步法標(biāo)記工藝復(fù)雜,耗費(fèi)時(shí)間。多個(gè)協(xié)同配體的加入給產(chǎn)物的純化也帶來了一定的困難。Al18F標(biāo)記方法雖然標(biāo)記率較低,但是制備工藝簡單易于操作,并且穩(wěn)定可靠重復(fù)性高。而且Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108采用了糖基化修飾的KE108多肽作為標(biāo)記前體,可增加在腫瘤部位的攝取。與18F-Ta-Gluc-TOCA[19]相比,腫瘤的攝取相當(dāng)。通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該探針在PET顯像中展現(xiàn)了良好的SSTR靶向性和特異性,在AR42J和BON1細(xì)胞上的受體表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力和特異性。但是,在生物分布實(shí)驗(yàn)中,Gluc-Lys([Al18F]NOTA)-KE108少量的骨攝取,表明探針在體內(nèi)具有輕微的不穩(wěn)定性,下一步將準(zhǔn)備添加穩(wěn)定劑進(jìn)行進(jìn)一步探索。

    猜你喜歡
    荷瘤生長抑素多肽
    奧美拉唑、血凝酶聯(lián)合生長抑素治療上消化道出血的效果
    奧美拉唑聯(lián)合生長抑素治療急性上消化道出血的效果及對止血成功率的影響
    智慧健康(2021年33期)2021-03-16 05:47:56
    除痰解毒方聯(lián)合吉非替尼對肺腺癌H1975荷瘤小鼠Twist、Fibronectin表達(dá)的影響
    綠蘿花及其多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤免疫相關(guān)因子的影響
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:35
    高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號”的選育
    生長抑素治療上消化道出血的臨床分析
    獨(dú)角蓮軟膠囊抗人肝癌Hep-2荷瘤裸鼠移植瘤作用及對p53表達(dá)的影響
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    石見穿多糖對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用
    生長抑素治療腸梗阻的臨床研究
    9191精品国产免费久久| 中文欧美无线码| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品久久电影中文字幕| av电影中文网址| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久99一区二区三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品久久久久成人av| 午夜视频精品福利| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 免费在线观看影片大全网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲色图av天堂| av中文乱码字幕在线| 男女床上黄色一级片免费看| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品高清国产在线一区| 久久精品91蜜桃| 亚洲国产看品久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲美女黄片视频| 51午夜福利影视在线观看| 三级毛片av免费| 黄色怎么调成土黄色| 久热爱精品视频在线9| 美女大奶头视频| 亚洲av电影在线进入| 制服诱惑二区| 黄色怎么调成土黄色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产99久久九九免费精品| 亚洲欧美激情在线| 久热这里只有精品99| 男女之事视频高清在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 香蕉久久夜色| 丁香欧美五月| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产97色在线日韩免费| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 神马国产精品三级电影在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 波多野结衣高清无吗| 亚洲av成人av| 精品熟女少妇八av免费久了| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 激情视频va一区二区三区| av视频免费观看在线观看| 91av网站免费观看| 少妇的丰满在线观看| 久久精品国产综合久久久| 精品电影一区二区在线| 免费高清视频大片| 99热国产这里只有精品6| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 少妇粗大呻吟视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 69精品国产乱码久久久| 中文字幕高清在线视频| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜亚洲福利在线播放| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成人系列免费观看| 欧美成人性av电影在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品免费视频内射| 国产精品一区二区三区四区久久 | 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 色婷婷av一区二区三区视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人精品在线电影| 成人国语在线视频| 曰老女人黄片| 国产精品免费一区二区三区在线| 香蕉国产在线看| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费 | 18禁美女被吸乳视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 高清欧美精品videossex| 午夜影院日韩av| 99国产综合亚洲精品| 精品久久久久久电影网| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产av精品麻豆| 99精品久久久久人妻精品| 一级毛片女人18水好多| 韩国精品一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看 | 可以在线观看毛片的网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 成年人免费黄色播放视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美在线黄色| 电影成人av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线观看66精品国产| 他把我摸到了高潮在线观看| 制服诱惑二区| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩成人在线观看一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 不卡一级毛片| 一二三四社区在线视频社区8| 99香蕉大伊视频| 99精品在免费线老司机午夜| 在线观看一区二区三区激情| 一级片免费观看大全| 国产精品永久免费网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 色综合站精品国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 久久亚洲精品不卡| tocl精华| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 男女午夜视频在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| www.精华液| 又紧又爽又黄一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲在线自拍视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产黄色免费在线视频| xxxhd国产人妻xxx| 欧美在线黄色| 青草久久国产| 91在线观看av| 在线观看一区二区三区激情| 国产av又大| 看片在线看免费视频| 村上凉子中文字幕在线| 又大又爽又粗| 色综合婷婷激情| 波多野结衣av一区二区av| 久久99一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 天堂√8在线中文| 99热国产这里只有精品6| 国产亚洲精品一区二区www| 香蕉久久夜色| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美激情极品国产一区二区三区| 高清av免费在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 伦理电影免费视频| 国产av在哪里看| av超薄肉色丝袜交足视频| 免费在线观看日本一区| 两个人免费观看高清视频| 午夜精品在线福利| 老司机在亚洲福利影院| 国产免费现黄频在线看| 正在播放国产对白刺激| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美日韩精品网址| 午夜福利在线免费观看网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线观看午夜福利视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 天堂√8在线中文| 欧美一级毛片孕妇| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 十八禁网站免费在线| 欧美丝袜亚洲另类 | av在线播放免费不卡| 波多野结衣一区麻豆| 香蕉久久夜色| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中文字幕色久视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产伦人伦偷精品视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 大陆偷拍与自拍| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 天堂影院成人在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 黄色视频,在线免费观看| 日韩有码中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产av在哪里看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 中文字幕av电影在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久人人97超碰香蕉20202| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久草成人影院| 欧美性长视频在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 精品一品国产午夜福利视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩国内少妇激情av| 免费少妇av软件| 免费看十八禁软件| 日日夜夜操网爽| 在线观看一区二区三区| 国产av又大| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久热这里只有精品99| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人18禁在线播放| 亚洲专区中文字幕在线| 成年人黄色毛片网站| 国产精品野战在线观看 | 日本vs欧美在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲激情在线av| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品国产国语对白av| 最好的美女福利视频网| 欧美成狂野欧美在线观看| av国产精品久久久久影院| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 1024视频免费在线观看| 一级毛片女人18水好多| 他把我摸到了高潮在线观看| 男人操女人黄网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品国产av在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99国产精品99久久久久| 美女午夜性视频免费| av福利片在线| 一区二区三区国产精品乱码| 免费在线观看完整版高清| 欧美日韩一级在线毛片| 99国产精品99久久久久| 日韩欧美三级三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久香蕉国产精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜免费鲁丝| 一级a爱片免费观看的视频| 99热国产这里只有精品6| 美国免费a级毛片| 亚洲av成人av| 99久久国产精品久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av有码第一页| 欧美成人免费av一区二区三区| 嫩草影视91久久| 国产成人精品在线电影| 久久久久久久久免费视频了| 精品国产亚洲在线| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 少妇粗大呻吟视频| 五月开心婷婷网| aaaaa片日本免费| 激情视频va一区二区三区| 久久久久久大精品| 欧美久久黑人一区二区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 美女 人体艺术 gogo| av电影中文网址| 好男人电影高清在线观看| 久久久久国内视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产一区二区激情短视频| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲伊人色综图| 久久99一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久久国产欧美日韩av| 久久午夜亚洲精品久久| 女同久久另类99精品国产91| 91成年电影在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成人系列免费观看| 国产黄色免费在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 久久精品影院6| 久久人妻av系列| 老司机亚洲免费影院| 99国产综合亚洲精品| 女人精品久久久久毛片| 久久人人精品亚洲av| 在线观看午夜福利视频| 女同久久另类99精品国产91| 91av网站免费观看| 午夜福利影视在线免费观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品一区二区三区av网在线观看| 丁香欧美五月| 亚洲成a人片在线一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 成在线人永久免费视频| 正在播放国产对白刺激| 亚洲精品一二三| aaaaa片日本免费| 亚洲成人久久性| a级毛片在线看网站| av国产精品久久久久影院| 亚洲男人天堂网一区| 性少妇av在线| 亚洲精品在线观看二区| 久久久久九九精品影院| 女同久久另类99精品国产91| 天堂中文最新版在线下载| 脱女人内裤的视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 麻豆成人av在线观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 搡老熟女国产l中国老女人| 五月开心婷婷网| 日韩欧美在线二视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久大精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一区高清亚洲精品| 日本欧美视频一区| 一区在线观看完整版| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 两个人看的免费小视频| 国产在线观看jvid| 色综合欧美亚洲国产小说| 丝袜在线中文字幕| 男女下面插进去视频免费观看| www日本在线高清视频| 午夜福利免费观看在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91国产中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美日韩乱码在线| 日日爽夜夜爽网站| 久久久国产精品麻豆| av天堂久久9| 亚洲,欧美精品.| 国产单亲对白刺激| 国产一区在线观看成人免费| 在线av久久热| 欧美av亚洲av综合av国产av| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产野战对白在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 日韩免费av在线播放| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美激情在线| 午夜福利在线观看吧| 九色亚洲精品在线播放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 9热在线视频观看99| 天天添夜夜摸| 多毛熟女@视频| 亚洲精品在线观看二区| 日本vs欧美在线观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲中文av在线| 亚洲国产欧美网| 天堂动漫精品| 在线观看免费高清a一片| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲成人国产一区在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线观看一区二区三区| 欧美大码av| 亚洲成人免费av在线播放| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久国产成人精品二区 | 很黄的视频免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一级作爱视频免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜精品久久久久久毛片777| 不卡一级毛片| 午夜免费激情av| 在线观看舔阴道视频| 日本a在线网址| 日日夜夜操网爽| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜免费鲁丝| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久国产欧美日韩av| 国产成人影院久久av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久这里只有精品19| 村上凉子中文字幕在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 在线永久观看黄色视频| 精品欧美一区二区三区在线| 91字幕亚洲| 色婷婷av一区二区三区视频| 女性被躁到高潮视频| 国产精品 国内视频| 老司机亚洲免费影院| 久久亚洲真实| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久热在线av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日本三级黄在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美久久黑人一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 看黄色毛片网站| 18禁美女被吸乳视频| 美国免费a级毛片| 老鸭窝网址在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 一级黄色大片毛片| 精品久久久精品久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久久久久久久大奶| 色婷婷久久久亚洲欧美| 两性夫妻黄色片| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩高清综合在线| av免费在线观看网站| 亚洲人成电影观看| av免费在线观看网站| 麻豆国产av国片精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级,二级,三级黄色视频| 一二三四在线观看免费中文在| 69av精品久久久久久| 手机成人av网站| 69av精品久久久久久| 国产99白浆流出| 国产精品成人在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 操出白浆在线播放| 国产不卡一卡二| 黄色丝袜av网址大全| 他把我摸到了高潮在线观看| 91精品国产国语对白视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 夜夜爽天天搞| 久久久久久人人人人人| 香蕉国产在线看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜福利欧美成人| 人人澡人人妻人| 久久天堂一区二区三区四区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成年版毛片免费区| 69av精品久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲成人免费av在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av美国av| 又黄又粗又硬又大视频| 久久人妻熟女aⅴ| 热re99久久精品国产66热6| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品偷伦视频观看了| 妹子高潮喷水视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 欧美乱妇无乱码| 男女午夜视频在线观看| 国产区一区二久久| 免费在线观看完整版高清| 国产人伦9x9x在线观看| 99国产综合亚洲精品| 一级黄色大片毛片| 欧美日韩视频精品一区| 天天影视国产精品| 久久久国产一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 国产激情欧美一区二区| av网站免费在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线永久观看黄色视频| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲av第一区精品v没综合| 一本综合久久免费| 国产精品成人在线| 波多野结衣av一区二区av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 看黄色毛片网站| 久久久久国内视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲免费av在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线观看一区二区三区激情| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久久久午夜电影 | 精品免费久久久久久久清纯| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线观看免费日韩欧美大片| 色在线成人网| 亚洲avbb在线观看| 午夜免费观看网址| 窝窝影院91人妻| 色综合站精品国产| 超碰成人久久| 最近最新免费中文字幕在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| www.www免费av| 日韩免费av在线播放| 中文欧美无线码| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人影院久久av| 亚洲国产精品999在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲成人免费电影在线观看| 一区二区三区精品91| 国产又爽黄色视频| 一级毛片高清免费大全| 叶爱在线成人免费视频播放| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人影院久久av| 国产精品久久久av美女十八| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费高清在线观看日韩| 妹子高潮喷水视频| 一级片'在线观看视频| 亚洲av美国av| 激情在线观看视频在线高清| 免费看十八禁软件| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产97色在线日韩免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 色播在线永久视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲在线自拍视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 深夜精品福利| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线观看午夜福利视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日本wwww免费看| 在线免费观看的www视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲 国产 在线| 99久久综合精品五月天人人| 午夜福利免费观看在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交|