無特定病原體級雌性昆明小鼠宮頸癌發(fā)生與陰道菌群紊亂相關(guān)性研究

張云清，李繼斌，韓慧慧

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,陜西 延安 716000;2.神木市醫(yī)院病理科,陜西 神木 719300;3.延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西 延安 716000)

當(dāng)前宮頸癌發(fā)病率和病死率均居女性生殖道惡性腫瘤的首位，在發(fā)展中國家的發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國家，農(nóng)村高于城市[1]。宮頸癌的發(fā)生機制還不明確，但是高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papilloma virus，HR-HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要病因[2]。HR-HPV感染可導(dǎo)致陰道菌群紊亂，陰道菌群紊亂也會增加宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險[3]，但是具體的作用機制還不明確。女性的陰道系統(tǒng)比較復(fù)雜，包括陰道正常解剖結(jié)構(gòu)、周期性內(nèi)分泌變化、陰道微生物菌群、陰道宮頸局部免疫等。正常情況下，陰道微生物菌群相互適應(yīng)、相互制約、相互協(xié)調(diào)，處于動態(tài)的平衡中，以乳桿菌為絕對優(yōu)勢菌，也共同構(gòu)成陰道的生物膜[4-5]。當(dāng)陰道菌群發(fā)生紊亂時，可導(dǎo)致陰道pH值、乳桿菌數(shù)量發(fā)生變化，從而導(dǎo)致陰道微生態(tài)失調(diào)狀態(tài)。并且已有研究[6-7]認(rèn)為乳桿菌是正常女性陰道內(nèi)重要的生理性益生菌，對許多病原菌具有拮抗作用，而且還能有效地抑制相關(guān)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。并且異常陰道微生物群落和生殖道感染也會增加HR-HPV感染發(fā)生的幾率，正常陰道微生物生態(tài)系統(tǒng)在降低HR-HPV感染發(fā)生率發(fā)生也發(fā)揮重要作用[8-9]。本文通過動物模型分析，探討了無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級雌性昆明小鼠宮頸癌的發(fā)生與陰道菌群紊亂的相關(guān)性，希望為宮頸癌的治療與管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級雌性昆明小鼠(n=48)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，6～8周齡，體重(20±2)g，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心，許可證號SCXK2132922。宮頸癌細(xì)胞株U14購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，各種生化試劑購自國藥集團，F(xiàn)ITC anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4購自美國Sigma公司。

1.2 動物分組與建模 將U14細(xì)胞株2 ml注入小鼠腹腔，經(jīng)二代小鼠腹水培養(yǎng)后得到腹水細(xì)胞懸液，經(jīng)2次生理鹽水洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/ml。將小鼠隨機平分為宮頸癌組與對照組，每組24只。在正常狀態(tài)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，宮頸癌組在右側(cè)背皮下注射0.2 ml細(xì)胞懸液建立宮頸癌模型，種植后7 d局部可形成直徑為0.7～1.0 cm的腫塊，所有小鼠均接種成功。對照組注射等劑量的生理鹽水，實驗觀察21 d。

1.3 觀察指標(biāo) ①每天記錄進(jìn)食量并觀察記錄小鼠的腫瘤生長與行為情況，宮頸癌組小鼠平均第7天成瘤，成模率為100.0%。②在建模第7、14天取小鼠的陰道分泌物進(jìn)行涂片與染色，然后進(jìn)行陰道菌群密集度與乳桿菌半定量評分；陰道菌群密集度評分：1分，能辨別1～3 種細(xì)菌；2分，能辨別4～6 種細(xì)菌；3分，能辨別7～9 種細(xì)菌；4分，能辨別≥10 種細(xì)菌；乳桿菌半定量評分：1分，每視野細(xì)菌數(shù)平均1～9 個；2分，每視野細(xì)菌數(shù)平均10～99 個；3分，每視野細(xì)菌數(shù)平均≥100個。③提取陰道分泌物的細(xì)菌DNA，針對16S rRNA區(qū)域進(jìn)行PCR擴增，判定陰道菌群分型情況。④在建模第14、21天兩組分別處死12只小鼠，取小鼠的腹腔主動脈血液1 ml，分離單個核細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞含量分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般情況及每日進(jìn)食量對比 對照組小鼠無任何異常表現(xiàn)。宮頸癌組小鼠皮毛失去光澤，糞便逐漸變軟，精神萎靡，活動減少。宮頸癌組建模第7、14天的每日進(jìn)食量均低于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組小鼠不同時間點每日進(jìn)食量對比(g)

2.2 兩組陰道菌群密集度與乳桿菌半定量評分對比 對照組的陰道優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬，占7.2%；宮頸癌組陰道優(yōu)勢菌屬為巴斯德菌屬和螺桿菌屬，分別占26.3%和18.8%。宮頸癌組建模第7、14天的陰道菌群密集度評分高于對照組(P<0.05)，乳桿菌半定量評分低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組建模不同時間點陰道菌群密集度與乳桿菌半定量評分對比(分)

2.3 兩組腹主動脈血T淋巴細(xì)胞分布情況對比 宮頸癌組建模第14、21天的腹腔主動脈血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例均低于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組建模不同時間點腹腔主動脈血T淋巴細(xì)胞分布情況對比(%)

2.4 相關(guān)性分析 在建模第14天，Spearman相關(guān)性分析顯示宮頸癌與陰道菌群密集度評分、乳桿菌半定量評分均存在相關(guān)性(均P<0.05)，見表4。

表4 SPF級雌性昆明小鼠宮頸癌發(fā)生與陰道菌群紊亂相關(guān)性

3 討 論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均高居全球女性腫瘤前列，也是嚴(yán)重威脅我國婦女身體健康的重大疾病之一[10]。HR-HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要原因，但不是唯一原因，在其發(fā)病過程中可能還存在其它致癌因素或者協(xié)同HR-HPV發(fā)揮作用的因素，致使宮頸上皮細(xì)胞對HR-HPV的易感性增加，HR-HPV感染得以持續(xù)存在，從而誘發(fā)宮頸癌的發(fā)生[11-12]。

健康婦女陰道內(nèi)存在多種微生物，包括細(xì)菌、真菌、原蟲、病毒等，一些微生物執(zhí)行生理功能的狀況以直接影響女性的健康狀況[13]。這些寄居在陰道內(nèi)的微生物伴隨著陰道局部環(huán)境的變化而不斷發(fā)生演替，在維持陰道微生態(tài)平衡上發(fā)揮了重要作用。部分定植微生物可抵御病原菌的過量增殖，而或抑制在正常菌群中過度增長的潛在病原菌可導(dǎo)致機體致病[14]。陰道菌群密集度評分與乳桿菌半定量評分是臨床常用的陰道微生態(tài)評價體系，兩者相結(jié)合可共同評估陰道微生態(tài)平衡狀態(tài)[15]。本研究顯示宮頸癌組建模第7、14天的陰道菌群密集度評分高于對照組，乳桿菌半定量評分低于對照組。對照組的陰道優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬，占比7.2%，宮頸癌組陰道優(yōu)勢菌屬為巴斯德菌屬和螺桿菌屬，分別占比26.3%和18.8%。乳桿菌是人體的正常菌群，具有抗腫瘤、抗衰老、抗感染、抗突變等多種活性，其可對機體的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，乳桿菌介導(dǎo)的對機體免疫系統(tǒng)的激活可能是機體保持抗腫瘤活性的重要途徑之一。乳桿菌能夠通過黏附素，與陰道上皮細(xì)胞表面特異性的黏附素受體結(jié)合，同時分泌大量細(xì)胞外多聚糖，從而拮抗其他致病菌的黏附和侵襲[16-17]。且乳桿菌可以利用陰道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的糖原產(chǎn)生乳酸等有機酸，使陰道保持酸性環(huán)境，有利于防止病原菌的入侵。而巴斯德菌屬和螺桿菌屬增加，可使陰道黏膜局部的免疫防御功能降低，可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長及宮頸癌病情的發(fā)展[18-19]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能密切相關(guān)，細(xì)胞免疫介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)是機體抗腫瘤的重要機制之一[20]。本研究顯示宮頸癌組建模第14、21天的腹腔主動脈血液CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例都低于對照組。從機制上分析，對照組小鼠陰道菌群處于平衡狀態(tài)時，CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例比較高，可維持機體正常的免疫功能，保障機體對腫瘤抗原的及時識別和清除。宮頸癌模型組小鼠伴隨著CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例降低，使T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攻擊、殺傷作用效果降低，導(dǎo)致機體出現(xiàn)腫瘤易感性[21]。

本研究顯示Spearman相關(guān)性分析顯示宮頸癌與陰道菌群密集度評分、乳桿菌半定量評分都存在相關(guān)性。從機制上分析，陰道菌群的紊亂促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長及宮頸癌病情的發(fā)展；宮頸癌也引起陰道菌群的紊亂[22-23]。并且陰道菌群的紊亂破壞了宮頸局部免疫功能，增加了病原體感染的風(fēng)險；而病原體感染時又進(jìn)一步加劇陰道局部免疫微環(huán)境生物屏障的破壞，導(dǎo)致陰道微生態(tài)系統(tǒng)失衡加重，最終導(dǎo)致宮頸癌[24]。本研究也存在一定的不足，沒有設(shè)置宮頸良性病變組，沒有對其他菌群進(jìn)行分型分析，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

總之，SPF級雌性昆明小鼠宮頸癌伴隨有陰道菌群紊亂，可影響小鼠的免疫功能，陰道菌群的紊亂介導(dǎo)的免疫逃逸作用可能促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。