肝細胞癌組織中Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞表達水平及其與腫瘤免疫相關(guān)性研究

劉冬宇，白 劼，白紅艷

(榆林市星元醫(yī)院檢驗科，陜西 榆林 719000)

隨著社會的發(fā)展與環(huán)境污染，原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅患者生命健康[1]。因大多數(shù)肝癌患者確診時已到中晚期，且病灶出現(xiàn)轉(zhuǎn)移與擴散，因此應(yīng)用手術(shù)切除治療的難度比較大。當前肝癌的發(fā)病機制尚不明確，可能與環(huán)境因素、長期肝硬化、病毒性肝炎及黃曲霉素等致癌物相關(guān)[2-3]。調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Regulatory T lymphocyte cell,Treg)調(diào)控抑制在自身炎癥障礙、急慢性感染、過敏、代謝炎癥、癌癥和自身免疫中發(fā)揮著重要的作用，是當前免疫介導炎癥負調(diào)節(jié)的一種重要機制。有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，Treg能夠誘導局部的免疫耐受，浸潤性的Treg對保護性抗腫瘤免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制，Treg介導抑制可能是當前免疫干預的一個重要靶點，能夠阻斷Treg介導免疫抑制增強抗腫瘤作用。為了探究肝細胞癌的發(fā)病機制，并為肝癌的治療提供參考，本文選取40例原發(fā)性肝細胞癌組織和40例癌旁組織，探討肝細胞癌中Foxp3+Treg及其與腫瘤免疫的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 40例HCC選自我院經(jīng)手術(shù)切除且病理證實的組織(肝細胞癌組織)，40例HCC患者中男34例，女6例，年齡46～73歲，平均(61.54±2.47)歲。40例癌旁組織選擇距離病灶3 cm以外的非癌組織，注意避開壞死區(qū)域。病例納入標準：經(jīng)病理確診為肝細胞癌；臨床資料完整；術(shù)前未經(jīng)過放化療等治療方案。排除標準：合并自身免疫類疾病者；合并其他肝炎病毒感染者；合并酒精性肝病者等。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化實驗：取 2 ml 肝素抗凝血，加磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至4 ml，然后緩慢加至2 ml Ficoll淋巴分離液上層，2000 r/min 離心 20 min 后吸取單個核細胞。PBS 洗滌后將細胞重懸于 100 μl PBS，與抗體異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4 孵育30 min，PBS 洗滌 2 遍后重懸于 500 μl PBS，放入到流式細胞儀中檢測其相關(guān)數(shù)值[6-7]。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定：Foxp3+細胞陽性染色鏡下觀察到細胞核棕黃色或者棕褐色，CD8+T 淋巴細胞陽性染色表現(xiàn)為細胞膜和細胞漿棕黃色或棕褐色著色；先低倍鏡下選取 5 個淋巴細胞最豐富的視野，再高倍鏡視野下計各細胞的陽性細胞數(shù)，結(jié)果取5個視野的平均值。同時分別計算同一視野內(nèi)Foxp3+Treg細胞與CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CD8+CTL)值[8]。

2 結(jié) 果

2.1 40例患者臨床病理特征與Foxp3+Treg水平的關(guān)系 不同性別、腫瘤位置、術(shù)前AFP水平、腫瘤病理分級的肝癌患者Foxp3+Treg水平對比無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)；不同腫瘤大小的Foxp3+Treg水平對比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 40例患者臨床病理特征與Foxp3+Treg水平的關(guān)系(%)

2.2 肝細胞癌組織與癌旁組織CD8+CTL和Foxp3+Treg表達對比 肝細胞癌組織、癌旁組織的Foxp3+Treg、CD8+CTL表達和Foxp3+Treg/ CD8+CTL比值對比差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見表2。

表2 肝細胞癌組織與癌旁組織CD8+CTL和Foxp3+Treg表達對比(%)

2.3 肝細胞癌組織中Foxp3+Treg與CD8+CTL的相關(guān)性 見圖1。肝癌組織中Foxp3+Treg與CD8+CTL水平呈負相關(guān)(r=0.425，P=0.024)，F(xiàn)oxp3+Treg越多，CD8+CTL越少。

圖1 肝癌組織中Foxp3+Treg與CD8+CTL比值關(guān)系

2.4 腫瘤切除術(shù)后Foxp3+Treg水平變化 見圖2。術(shù)后3個月跟蹤監(jiān)測Foxp3+Treg水平，結(jié)果顯示，手術(shù)后患者外周血中的Foxp3+Treg水平為(5.98±1.34)%，手術(shù)前為(9.67±2.25)%，手術(shù)后明顯低于手術(shù)前，差異具有統(tǒng)計學意義(t=5.080，P=0.001)。

圖2 腫瘤切除術(shù)后外周血Foxp3+Treg比值變化

3 討 論

人體抗腫瘤免疫效應(yīng)機制主要包含體液免疫和細胞免疫，而細胞免疫在機體內(nèi)對抗腫瘤免疫中具有重要作用，而T淋巴細胞是參與其中的主要細胞之一[9]。Treg細胞是抗腫瘤免疫抑制的細胞群體，在正常機體內(nèi)部各種免疫細胞數(shù)量上占有一定比率，如果這個比率失調(diào)就會導致免疫耐受或者免疫功能低下，導致腫瘤細胞逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊。T細胞有兩個主要亞群，分別為CD8+、CD4+T細胞，CD4+T細胞能夠依照分泌細胞因子與介導功能分為Th2細胞和Th1細胞，其中Th2細胞分泌IL-10和IL-4等，進而介導體液免疫[10]；Th1主要分泌IFN-γ，對于抗腫瘤免疫具有重要效果。Th2細胞和Th1細胞屬于互相調(diào)節(jié)細胞，IFN-γ會對Th2細胞的功能和分化產(chǎn)生抑制，而IL-10會抑制Th1的功能和分化[11-12]。這種相互平衡的關(guān)系會直接對機體免疫功能產(chǎn)生影響，和疾病的發(fā)展有著密切關(guān)系。相關(guān)研究[13]發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤患者的體內(nèi)Th2細胞與Th1細胞平衡會出現(xiàn)偏離，多為IL-4上調(diào)或IFN-γ下調(diào)。還有研究[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+Treg在腫瘤免疫之中發(fā)揮了重要作用。因此，為了有效防治肝細胞癌，本文針對于肝細胞癌組織中Foxp3+Treg及其與腫瘤免疫的相關(guān)性展開研究。

本研究結(jié)果表明，肝癌組織、癌旁組織的Foxp3+Treg、CD8+CTL表達和Foxp3+Treg/ CD8+CTL比值對比差異有統(tǒng)計學意義，由此證明不同組織中Foxp3+Treg、CD8+CTL表達存在統(tǒng)計學差異。有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+Treg調(diào)控腫瘤免疫主要有兩個途徑：①通過分泌細胞移植因子，例如IL-10等移植細胞毒性的T細胞(CD8+)與自然殺傷細胞(NK)增殖、活化而發(fā)揮出負性免疫調(diào)控的作用；②通過細胞和細胞之間的接觸直接發(fā)揮出細胞的抑制作用。而CD8+CTL細胞在腫瘤的反應(yīng)之中發(fā)揮著巨大作用，局部抗腫瘤的免疫之中處于腫瘤相互作用和機體免疫系統(tǒng)的最前沿，它的功能和數(shù)量在一定程度上能夠反應(yīng)機體抗腫瘤的水平和強度，與本研究具有一定相似性[17]；不同性別、腫瘤位置、術(shù)前AFP水平、腫瘤病理分級的肝癌患者Foxp3+Treg水平對比無統(tǒng)計學差異，不同腫瘤大小的Foxp3+Treg水平對比有統(tǒng)計學差異，由此證明肝癌患者外周血Foxp3+Treg數(shù)量變化和腫瘤大小相關(guān)，但是這是否表明Treg和肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)，還有待增加樣本量深入研究。相關(guān)研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+Treg水平和肝癌的TNM病理分期相關(guān)，并且晚期肝癌患者的外周血中Treg水平會高于早期患者，導致這種差異可能是因為其他小組病例選擇的時候標準有所不同，可能一些患者已經(jīng)接受了一部分治療，導致其免疫功能受到了影響；本研究發(fā)現(xiàn)癌組織中Foxp3+Treg與CD8+CTL呈負相關(guān)，F(xiàn)oxp3+Treg越多，CD8+CTL越少。相關(guān)研究[21]發(fā)現(xiàn)，食管癌微環(huán)境之中表達活化標志NKG2D的CTL數(shù)量和Treg數(shù)量呈明顯的負相關(guān)狀態(tài)，與本研究結(jié)果相同。提示Foxp3+Treg細胞能抑制CD8+CTL細胞的增殖，從而抑制其抗腫瘤作用。而肝癌患者細胞免疫功能較低，可能是因為肝癌患者體內(nèi)的癌細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等可溶性因子，導致Foxp3+Treg比值升高，抑制CD8+CTL活化，所以機體殺傷腫瘤細胞能力下降，并且免疫抑制增強，兩者聯(lián)合作用之下導致肝癌患者免疫功能降低，促進肝癌發(fā)展[22-23]。術(shù)后進行3個月跟蹤監(jiān)測Foxp3+Treg水平，結(jié)果顯示，手術(shù)后患者外周血中的Treg細胞水平為(5.98±1.34)%，手術(shù)前為(9.67±2.25)%，手術(shù)后明顯低于手術(shù)前，差異具有統(tǒng)計學意義，由此證明肝癌患者進行根治手術(shù)之后，能夠清除免疫抑制現(xiàn)象，使患者的免疫功能出現(xiàn)不同程度的恢復，但是這個結(jié)論還需要日后增加病例數(shù)進行深入研究，從而應(yīng)用到臨床中[24]。

綜上所述，肝細胞癌組織中Foxp3+Treg通過抑制CD8+CTL的增殖，可抑制其抗腫瘤作用；通過手術(shù)可在一定程度上清除免疫抑制，F(xiàn)oxp3+Treg升高與CD8+CTL降低可能參與肝腫瘤細胞免疫逃逸，因此可以考慮檢測Foxp3+Treg與CD8+CTL來評價肝癌患者的細胞免疫功能。