青海省大通縣犢牛糞樣中隱孢子蟲的鑒定及分子特征

李國平

(大通縣畜牧獸醫(yī)站,青海 大通,810100)

青海省大通縣是青海省西寧市下轄縣，地處青海東部河湟谷地，祁連山南麓，湟水河上游，是西寧地區(qū)水源之一，也是青藏高原和黃土高原的過渡地帶。大通縣屬高原大陸性氣候， 海拔 2 280～4 622 m，地勢西北高東南低。養(yǎng)殖畜禽種類為牛、羊、豬、禽等，近年來該縣畜牧業(yè)生產(chǎn)能力不斷增強，成為社會經(jīng)濟發(fā)展新的增長點。

隱孢子蟲是重要的人獸共患腸道原蟲病，傳播范圍廣公共危害大，在環(huán)境中一般以卵囊/包囊形式存在，人和家畜感染后有 80%表現(xiàn)出持續(xù)腹瀉的臨床癥狀，其程度與機體的免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫功能異常或免疫功能缺陷者往往表現(xiàn)為嚴重腹瀉，遷延難愈，?？稍斐蓜游锼劳?。由于缺乏相應(yīng)的檢測手段和流行病學調(diào)查，長期以來獸醫(yī)對于隱孢子蟲一般都會當作細菌病進行治療，結(jié)果造成抗生素的濫用和大量耐藥菌株的產(chǎn)生。因此，開展動物源性隱孢子蟲病的調(diào)查、病原基因型的鑒定和分子特征研究，對于這種原蟲病的預(yù)防、公共衛(wèi)生風險的評估以及追蹤感染源都具有重要的意義。

為了掌握青海省大通縣部分地區(qū)奶牛犢隱孢子蟲病的流行情況，采集 大通縣域地區(qū)200份奶牛犢糞樣用于隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲檢測。所有樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心法處理后用免疫熒光試驗(IFT)和巢式 PCR(nPCR)方法進行檢測，研究結(jié)果將為這種疾病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞樣采集 2017 年 8～10 月，以青海省大通縣寶庫鄉(xiāng)和良教鄉(xiāng)奶牛養(yǎng)殖戶為調(diào)查對象， 采集奶牛犢(3-5 月齡)新鮮糞樣共計 200 份，其中寶庫鄉(xiāng) 178 份，良教鄉(xiāng) 22 份，分別編號為 QHDT2017001～QHDT2017200，每個采樣管按等比例分別加入 25 g/L 的重鉻酸鉀溶液， 送實驗室 4℃冰箱待檢。糞樣中的隱孢子蟲的卵囊/包囊采用文獻中推薦的蔗糖密度梯度離心法進行純化。

1.1.2 主要試劑與儀器 QIAGEN 糞樣 DNA 提取試劑盒、HotstarDNA 聚合酶等購自凱杰公司； PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖、電泳緩沖液和 DNA 標準 DL2000 等試劑購自上海生工生物工程有限公司；隱孢子蟲熒光標記單克隆抗體檢測試劑盒購自Cellabs 公司；酵母提取物和胰蛋白胨為英國 OXOID 公司產(chǎn)品，其它化學試劑藥品均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光試驗(IFT) 將 200 份樣品純化后，每份取 25 μL 涂于載玻片上，用于隱孢子蟲卵囊和包囊的檢測。樣品涂勻后用甲醇固定，然后在樣品上滴加熒光素標記的抗隱孢子蟲單克隆抗體，樣品置于濕盒中并在 37℃溫箱孵育 30 min，之后用磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)沖洗 2 次，樣品上滴加 15μL甘油，用蓋玻片覆蓋后使用免疫熒光顯微鏡觀察卵囊/包囊的存在情況，通過隱孢子蟲大小、形狀、熒光等特征判定陰陽性結(jié)果。

1.2.2 樣品DNA 的提取 所有樣品經(jīng)純化后采用 QIAGEN 糞樣DNA 提取試劑盒提取樣品DNA， 提取的DNA 保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 隱孢子蟲的PCR 擴增 參照文獻引物和方法對所有樣品采用 18S rRNA 基因擴增引物檢測隱孢子蟲的存在情況，擴增引物見表 1。PCR 產(chǎn)物純化后送蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司采用 Sanger 法測序。測序結(jié)果與 GenBank 中的參考序列進行 BLSAT 比對分析，確定隱孢子蟲種屬；用 MegAlign 分析不同分離株和參考株之間序列的同源性，用 MEGA5.2 軟件中的鄰近法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，計算各序列之間的遺傳距離，確定隱孢子蟲的基因型。

表1 本研究中用于隱孢子蟲鑒定引物信息

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光試驗結(jié)果

樣品與隱孢子蟲熒光單抗反應(yīng)后，用熒光顯微鏡觀察涂片，共有 3 份樣品發(fā)現(xiàn)具有隱孢子蟲特征的卵囊(圖 1)，大小約為 4.5μm×5.0μm，判定為隱孢子蟲陽性。

圖1 免疫熒光抗體法檢測奶牛犢隱孢子蟲卵囊(1000×)

2.2 PCR鑒定結(jié)果

將純化的 200 份樣品分別采用基于隱孢子蟲 18S rRNA 基因引物的巢式 PCR 進行擴增，共有 2 份樣品擴增出了大小約為 500 bp 左右的條帶。PCR 產(chǎn)物測序后，經(jīng) BLAST 比對，結(jié)果均為隱孢子蟲序列。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將隱孢子蟲 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果與 GenBank 中下載的其它相關(guān)序列用進行多序列比對，用 MEGA5.0 軟件構(gòu)建遺傳進化樹，從遺傳凈化關(guān)系中可以看出本次檢測出的犢牛隱孢子蟲有 Cryptosporidium andersoni 和 Cryptosporidium bovis(圖 2)。

表2 奶牛犢糞樣間接免疫熒光和巢式 PCR 檢測結(jié)果

圖2 基于 18S rRNA 基因的隱孢子蟲遺傳進化分析

3 討論

隱孢子蟲是引起人和動物腹瀉的重要原因病原體，主要通過水源感染動物和人類。青海省大通縣位于湟水河上游，是西寧市水源地之一，因此檢測該地區(qū)動物及河流中的隱孢子蟲對于公共衛(wèi)生學具有重要意義。在本次研究中通過巢式 PCR確定出隱孢子蟲在奶牛犢中的感染率為 1%，這可能與采集的糞樣大多數(shù)來自于健康犢牛以及犢牛的的年齡大于 2 月齡有關(guān)。之前 Wang GP 等采用 PCR方法研究青海省果洛地區(qū)犢牦牛腹瀉原因時發(fā)現(xiàn)，隱孢子蟲的感染率為 11.3%，該研究所有糞樣均采自有腹瀉癥狀和年齡小于 2 個月的犢牦牛。本研究采用 18SrRNA基因序列鑒定隱孢子蟲蟲種，結(jié)果表明大通縣寶庫鄉(xiāng)和良教鄉(xiāng)分離的蟲株分別為 C.andersoni和 C. bovis，這與之前青海、河南和黑龍江報道的牛源隱孢子蟲種基本一致。

本研究中采用 IFT顯微鏡檢查和巢式 PCR檢測了大通部分地區(qū)奶牛犢中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的流行情況，檢測結(jié)果表明調(diào)查動物中賈第鞭毛蟲的感染率高于隱孢子蟲的感染率，這也對該地區(qū)奶牛腹瀉病因的研究提供了重要的理論依據(jù)。由于在檢測方法上，每種方法都有自己的優(yōu)缺點，所以本研究中采用了兩種方法平行檢測。從檢測結(jié)果可知，200份樣品中只有 3份樣品為隱孢子蟲陽性，其中 2份為巢式 PCR檢測陽性。不同檢測方法產(chǎn)生的結(jié)果差異可能是由于樣品中存在 PCR擴增抑制物，這種原因可能造成 PCR方法不能檢出。此外， 樣品 DNA濃度過低或模板 DNA分布不均勻以及 IFT的交叉反應(yīng)現(xiàn)象也可能造成這種結(jié)果差異現(xiàn)象的發(fā)生。雖然 IFT方法在樣品檢測中比巢式 PCR敏感性強，但是 PCR方法特異性強，不會發(fā)生交叉反映，并且能夠確定分離蟲種的種屬及其基因型，因此，該方法目前廣泛應(yīng)用各種病原體的鑒定及分子特征分析。另外，研究中還發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲為陽性的犢牛都有不同程度的腹瀉癥狀，因此，有必要在該地區(qū)開展隱孢子蟲病的預(yù)防措施，以避免人和其它動物的進一步感染。