含多糖類中藥玉竹飲片標準湯劑質(zhì)量研究

畢霄鶴，呂慧芳，倪鳳燕，章軍，劉艷，李建恒

(1.河北大學 藥學院，河北 保定 071002；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，中藥鑒定與安全性檢測評估重點實驗室，北京 100700；3.河北中石油中心醫(yī)院 藥學部，河北 廊坊 065000；4.江西中醫(yī)藥大學 藥學院，江西 南昌 330004)

玉竹，又名尾參、地管子、鈴鐺菜、葳蕤，為百合科多年生草本植物玉竹Polygonatumodoratum(Mill.)Druce的干燥根莖，分布很廣.《本草經(jīng)集注》云：“莖干強直，似竹箭桿，有節(jié)”，故有玉竹之名[1-2].玉竹所含化學成分主要有多糖類、甾體皂苷類、高異黃酮類等化合物，其中多糖含量最高，也被視為其藥效成分.該藥材應用十分廣泛，且是藥食兩用品種，廣泛應用于保健品及食療中.研究表明，玉竹多糖是玉竹的主要有效成分，其具有滋陰補氣、生津止咳、延緩衰老、降低血糖、抑制腫瘤、增強免疫力等功效[3-4].

糖類是中藥材中普遍存在的成分，如黃芪、枸杞、麥冬、靈芝、人參、桑葉、金櫻子等都存在具有生物活性的多糖成分[5].中藥多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，藥效顯著且不良反應少[6].但多糖相對分子質(zhì)量大，結構復雜，穩(wěn)定性差，且含多糖類藥材在儲存過程中更易發(fā)生霉變、蟲蛀等變質(zhì)現(xiàn)象，使其質(zhì)量難以控制，藥效難以保障，造成“古方雖效，今卻無用”的遺憾.欲提高藥材質(zhì)量，除加強藥材在道地產(chǎn)區(qū)的規(guī)范化種植管理外，還可將其單味飲片經(jīng)提取濃縮制成單味配方顆粒.單味中藥配方顆粒是以傳統(tǒng)中藥飲片為原料，經(jīng)規(guī)范化的提取、分離、濃縮、干燥、制粒等一系列工藝，制成的新型中藥飲片劑型，具有方便沖服、劑量精準、性質(zhì)穩(wěn)定、易于攜帶與儲存等優(yōu)點，是國家對中醫(yī)藥行業(yè)大力發(fā)展與扶持的新型項目[7].如何保障配方顆粒的質(zhì)量，確定多糖有效成分群劑量以確保準確用藥呢？

解決上述問題，需建立中藥標準湯劑質(zhì)量標準來進一步科學規(guī)范量化藥材質(zhì)量，保障臨床療效.中藥標準湯劑是指按照一定的現(xiàn)代化工藝，采用準確、規(guī)范、可靠的試劑和方法制備的現(xiàn)代化中藥[8].它具有不同于藥材和配方顆粒獨特的質(zhì)量控制優(yōu)勢，與藥材相比，標準湯劑能表明制備工藝的影響；與配方顆粒相比，標準湯劑不存在輔料的干擾，更接近傳統(tǒng)用藥形式.既保留了傳統(tǒng)的水煎湯劑形式，又具有用于量化標準的參數(shù)，如指標成分的轉移率、得膏率等.它可作為一種化學基準，用于指導不同飲片用藥形式和臨床用藥，為中藥配方顆粒質(zhì)量標準提供參比[9].

本文研究的玉竹具有豐富的藥理作用，美容養(yǎng)顏且易于獲取，其多糖具有多靶向無毒性等優(yōu)勢，對玉竹的研究終將會越來越重視，因此需加強對玉竹的質(zhì)量評價及質(zhì)量控制[10].本實驗運用科學現(xiàn)代化的技術制備不同產(chǎn)地的12批玉竹飲片標準湯劑，考察多糖組分群的含量、轉移率和得膏率范圍，并建立其特征指紋圖譜，進一步實現(xiàn)質(zhì)量控制，為玉竹在食品、藥品及化妝品領域的發(fā)展提供參考標準，為玉竹飲片配方顆粒及其他含有多糖的藥材質(zhì)控提供更多的參考價值.

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司，T6新世紀)；BS224S-型1/10萬電子分析天平(德國賽多利斯公司)；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；XW-80A型漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)KQ；PB-10型pH計(Sartorius公司).

無水葡萄糖對照品來自中國食品藥品檢定研究院，批號為：3D4D-GV52，w(葡萄糖)≥99.5%；甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher)；水為娃哈哈純凈水；硫酸、苯酚等其他試劑為分析純.從3個產(chǎn)地收集了共12批玉竹樣品，經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所孫偉副研究員鑒定為百合科植物玉竹Polygonatumodoratum(Mill.)Druce的干燥根莖，其信息見表1.

表1 玉竹樣品信息Tab.1 Information of polygonatum odoratum samples

2 方法與結果

2.1 玉竹飲片多糖含量測定

據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》方法進行測定，得到12批玉竹飲片中多糖的含量，以無水葡萄糖(C6H12O6)計，質(zhì)量分數(shù)為 8.1%～14.8%(表2).結果表明，所收集12批玉竹樣品均滿足2015版藥典中玉竹項下規(guī)定.

表2 玉竹飲片標準湯劑測定Tab.2 Results of standard decoction of Polygonatum odoratum pieces

2.2 玉竹飲片標準湯劑的制備與測定

2.2.1 標準湯劑的制備

按《中藥飲片標準湯劑研究策略》中原則，建立玉竹標準湯劑制備方法.稱取玉竹飲片100 g置圓底燒瓶中，煎煮回流2次.一煎先加7倍水浸泡0.5 h，后加熱回流1 h，立即過200目(75 μm)篩.二煎加6倍水不浸泡，立即加熱回流40 min，趁熱過200目(75 μm)篩.合并2次煎煮回流得到的濾液，40 ℃溫水浴條件下進行減壓濃縮至500 mL，即得.

2.2.2 標準湯劑pH值的測定

取各批次玉竹飲片標準湯劑，測定pH值，平行2次，結果見表2.

2.2.3 出膏率測定

取各批玉竹標準湯劑，搖勻后用移液管精密吸取10 mL，放入恒重蒸發(fā)皿中，用水浴蒸干，再在105 ℃烘箱中干燥3 h，干燥完畢立刻取出放入干燥器中冷卻0.5 h，然后稱重.平行2次，測得出膏率為45.4%～70.1%，計算得到平均出膏率為55.6%，結果如表2.

2.3 玉竹標準湯劑多糖含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱定D-無水葡萄糖30.64 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至接近刻度線，超聲，放冷，加水定容，制成每1 mL含0.612 8 mg D-無水葡萄糖的溶液.

2.3.2 40 g/L苯酚的配制

準確稱取苯酚4.0 g，用純凈水溶解并定容于100 mL的棕色容量瓶內(nèi)，避光保存，臨用時配制.

2.3.3 供試品溶液的制備

2.3.4 線性關系考察

精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液1.5、2.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL，分別置于50 mL量瓶中，各加水至50 mL刻度，搖勻.分別精密量取上述溶液2 mL，置具塞試管中，分別加入40 g/L苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7 mL，搖勻，置40 ℃水浴中保溫30 min，取出，置冰水浴中放置5 min，取出，以相應試劑為空白，在490 nm波長下測得吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到D-無水葡萄糖的回歸方程：Y=10.05X+0.011，R2=0.998.結果表明，D-無水葡萄糖在0.018 4～0.085 8 mg/mL內(nèi)與其吸光度呈良好線性關系.

2.3.5 精密度實驗

取已顯色的玉竹標準湯劑供試品溶液，在490 nm下重復測定6次吸光度，計算其RSD為0.1%(n=6)，表明該方法精密度良好.

2.3.6 重復性實驗

取同一批的玉竹標準湯劑，平行制備成6份玉竹供試品溶液，按2.3.4項下操作方法，測量吸光度.計算得到玉竹飲片標準湯劑中D-無水葡萄糖的平均質(zhì)量濃度為4.72 mg/mL，RSD 為2.7%，表明該方法的重復性良好.

2.3.7 穩(wěn)定性實驗

取已顯色的玉竹標準湯劑供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h在490 nm下測定吸光度.結果表明，顯色后的溶液隨著放置時間的延長，吸光度逐步下降，應當在顯色后4 h內(nèi)測定.

人力資源管理工作主要的工作內(nèi)容，首先企業(yè)所有人員的檔案管理工作，按照部門將所有的公司員工檔案進行合理的儲存；其次，是企業(yè)員工動態(tài)流動的相應人事記錄；最后，是對整個企業(yè)的工作人員的綜合管理及分析應用。在整個人力資源管理工作之中，由于工作內(nèi)容繁多，企業(yè)相應的人力資源管理人員業(yè)務水平存在缺陷等情況，都會導致整個企業(yè)的人力資源管理體系存在漏洞，從而給整個企業(yè)的正常發(fā)展帶來隱患，對于企業(yè)的員工而言，企業(yè)的人事工作效率低下，無法迅速為企業(yè)的人事運轉工作提供高效支撐，從而影響到企業(yè)的運行效率。

2.3.8 加樣回收實驗

取已知多糖質(zhì)量濃度4.72 mg/mL的玉竹飲片標準湯劑，以多糖含量計按質(zhì)量比1∶1添加D-無水葡萄糖對照品(1.225 mg)，并平行制備6 份供試品溶液，2.3.4項下操作方法，計算得多糖回收率為 98.3%，RSD 為 2.8%，表明該方法準確度較好.

2.3.9 樣品測定

取12批玉竹標準湯劑，按2.3.4項下操作方法，測量吸光度.每個批次平行2 份，結果見表2.

2.4 玉竹飲片標準湯劑轉移率

玉竹飲片標準湯劑轉移率為

其中，W為玉竹飲片標準湯劑中目標成分的質(zhì)量(mg)，M為玉竹飲片中目標成分的質(zhì)量(mg).以D-無水葡萄糖計，計算得多糖的轉移率為10.9%～31.7%，平均轉移率為21.25%，結果如表2.

2.5 玉竹標準湯劑特征圖譜的建立

2.5.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相(體積分數(shù))：A-乙腈，B-0.25% 磷酸水溶液，梯度洗脫(0～30 min，5%～23% A;30～40 min，23% ～38% A)；柱溫為35 ℃;流速為1 mL/min；檢測波長為220 nm，進樣量 10 μL.在此條件下，特征圖譜能顯示較多的信息，見圖1.

圖1 玉竹飲片標準湯劑特征圖譜Fig.1 HPLC specific chromatograms of standard decotion of Polygonatum odoratum pieces

2.5.2 供試品溶液的制備

精密量取玉竹飲片標準湯劑10 mL搖勻，置20 mL量瓶中，加10 mL甲醇，超聲處理10 min，用水定容后搖勻，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得.

2.5.3 樣品測定與分析

取各批玉竹標準湯劑，按2.5.2項下方法制備供試品溶液，再按2.5.1項下色譜條件分別進行測定，得到HPLC 圖，如圖2.共標定5個共有峰，以2號峰為參照.利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A)，時間窗設為0.2，采用中位數(shù)法，對各批供試品色譜圖進行相似度計算，如表3.結果得到各批玉竹標準湯劑與對照圖譜的相似度均大于0.9，表明各批玉竹標準湯劑一致性較好.

圖2 12 批玉竹飲片標準湯劑特征圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches Polygonatum odoratum pieces

表3 12批玉竹飲片標準湯劑指紋圖譜的相似度Tab.3 Fingerprint similarities of 12 batches of standard decoction of Polygonatum odoratum pieces

3 討論

本文研究的12批玉竹，盡量遵循多產(chǎn)地、多規(guī)格、多批次、多等級的要求，使研究樣品的代表性決定標準湯劑的代表性.本文研究的樣本其中7批來自于主產(chǎn)區(qū)湖南，4批產(chǎn)于河北，1批產(chǎn)于遼寧.湖南是玉竹的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū),栽培面積大，歷史悠久，主產(chǎn)于湖南的玉竹又被稱做“湘玉竹”，因而本研究選擇了較多來自湖南的樣品，以期具有更好的代表性.所有樣品其質(zhì)量均符合《中華人民共和國藥典》中規(guī)定，滿足研究的需要.

玉竹飲片中多糖的轉移率為10.9%～31.7%，批次間轉移率差異較大，造成這種結果的原因可能是玉竹飲片的厚度不同造成的.2015版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定，玉竹的炮制方法為切厚片或段，在制備標準湯劑過程中，薄的玉竹飲片中多糖含量比厚的玉竹飲片提取的更完全，進而導致轉移率偏高.經(jīng)測量與觀察，玉竹S2、S9、S10飲片厚度明顯較其他批次薄.玉竹飲片的出膏率為45.4%～70.1%，批次間得膏率差異也較大，且得膏率與轉移率基本呈正相關，因此推斷造成這種結果的原因可能是批次間玉竹飲片的厚度不同造成的，與轉移率差異較大的原因相同.在制備標準湯劑過程中，薄的玉竹飲片中多糖比厚的玉竹飲片中提取的更完全，進而得膏率偏高.

在12批玉竹指紋圖譜中選取了5個分離度和峰形較好的峰作為共有峰對玉竹進行鑒別和質(zhì)量控制，后期會對共有峰所代表的成分通過質(zhì)譜進行進一步明確.

多糖是中藥中含量最高的一類成分，其具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗突變、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和美容養(yǎng)顏等方面的作用.比如黃芪多糖調(diào)節(jié)免疫功能作用明顯；何首烏多糖降血脂作用顯著；忍冬藤多糖可以抗氧化并延緩衰老等[11].多糖藥效高且毒副作用小，具有很大的開發(fā)潛力.標準湯劑質(zhì)量標準的制定為多糖的開發(fā)利用提供參考標準，規(guī)避了因提取不規(guī)范造成的藥效差異，提供了中藥材使用水準.

雖然有關飲片標準湯劑的研究已經(jīng)有較多的報道，理清了很多關鍵問題.然而這些研究均是以單體成分為含測指標，主要關注某個或某幾個單體成分，忽略了對某一類或幾類有效成分群的含量測定.雖然單體成分的含量測定更為準確、方便，但是有效成分群的含量具有更廣泛的代表性，與藥效的關系也更為密切.因此在標準湯劑的質(zhì)量標準制定中，不應該忽略有效成分群的含量測定.以玉竹標準湯劑為示范性研究對象，明確其制備方法，建立其質(zhì)量標準，為玉竹及其他含多糖藥材的配方顆粒制備及其質(zhì)量標準的建立提供了參考.

4 總結

12批玉竹標準湯劑的相似度均大于0.9，均一性較好，質(zhì)量穩(wěn)定，本研究采用的苯酚-硫酸法測多糖含量，操作簡單，快速，靈敏.方法學考察結果表明，儀器精密度、樣品穩(wěn)定性、重復性的RSD均小于3%.因此，該方法能為玉竹標準湯劑的質(zhì)量研究及其配方顆粒質(zhì)量評價提供參考，同時也為含有多糖成分的黃芪、枸杞、麥冬、靈芝等飲片標準湯劑的質(zhì)量標準研究及其配方顆粒質(zhì)量評價提供參考.