64Cu-NOTA-NOC的制備及體內(nèi)生物分布初步研究

趙海龍，李澤全，羅田偉，黃旭虎，王 寧，陳孟毅， 許 林，史旭東，鄧雪松，李洪玉

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasms, NENs)是一類起源于干細(xì)胞且具有神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物、能夠產(chǎn)生生物活性胺和(或)多肽激素的腫瘤[1-2]。在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、垂體瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤等)和一些神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(神經(jīng)母細(xì)胞瘤和腦膜瘤等)的細(xì)胞上常有生長(zhǎng)抑素受體(somatostatin receptor, SSTR)的過(guò)度表達(dá)[3-5]。生長(zhǎng)抑素(somatostatin, SST)類似物能夠特異性地靶向SSTR過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞[6]，這一特性可被用于腫瘤的診斷和治療，放射性藥物的研究主要集中在SST八肽類似物(以下簡(jiǎn)稱八肽)方面。近年來(lái)，F(xiàn)DA先后批準(zhǔn)四種基于SST八肽的放射性藥物(68Ga-DOTATATE、177Lu-DOTATATE、68Ga-DOTATOC及64Cu-DOTATATE)，用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷和治療[4,7]。NOC也是一種SST八肽，2017年，Esposito等[8]對(duì)64Cu-DOTA-NOC進(jìn)行了PET/CT顯像研究，結(jié)果顯示其可以準(zhǔn)確檢測(cè)出胰島素瘤患者的病灶部位。

64Cu為新型醫(yī)用正電子核素，半衰期為12.7 h，通過(guò)電子俘獲、β-和β+方式衰變[4,9]。64Cu發(fā)射低能正電子，端點(diǎn)能量為0.653 MeV，與18F的最大正電子能量(0.634 MeV)相近；由于PET掃描圖像的分辨率取決于核素的正電子能量，以及由此導(dǎo)致的組織穿透范圍(直到電子湮滅)，因此64Cu所得PET圖像的分辨率幾乎可與18F的圖像相媲美[10-11]。因64Cu具有良好的核物理性質(zhì)、優(yōu)良的化學(xué)配位能力以及可通過(guò)回旋加速器獲得高比活度產(chǎn)品的特點(diǎn)，物理半衰期較長(zhǎng)使其在臨床PET顯像的應(yīng)用方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)，已逐漸成為放射性藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。隨著64Cu-DOTATATE的新近獲批[7]，64Cu標(biāo)記藥物必將受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，對(duì)64Cu-八肽的研究主要集中于DOTATATE[3,12]，其標(biāo)記反應(yīng)條件較為劇烈，需95 ℃、反應(yīng)15 min且需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，64Cu與螯合基團(tuán)NOTA能夠在溫和的條件下進(jìn)行反應(yīng)，但64Cu對(duì)NOTA-NOC的標(biāo)記尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文利用正電子核素64Cu對(duì)NOTA-NOC進(jìn)行放射性標(biāo)記，對(duì)64Cu-NOTA-NOC的制備、質(zhì)控分析、穩(wěn)定性研究及生物學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)行初步研究，為開(kāi)發(fā)64Cu標(biāo)記的SST類似物藥物用于SSTR陽(yáng)性腫瘤診斷和治療提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

1.1 主要儀器

CRC-55TW活度計(jì)：美國(guó)Capintec公司；2470全自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)器：美國(guó)Perkin Elmer公司；MiliQ-Reference超純水機(jī)：密理博(中國(guó))有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：Iertsil ODS-SP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，日本島津公司；Bioscan色譜儀伽馬計(jì)數(shù)器：德國(guó)Eckertk Ziegler公司；ME204電子天平：梅特勒-托利多；VORTEX3螺旋振蕩器：德國(guó)IKA公司；干式恒溫金屬?。荷虾粜艑?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；雷磁PHS-3E pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Inveon MM PET/CT：西門(mén)子。

1.2 主要試劑

NOTA-NOC：純度>95%，ABX公司；64CuCl2溶液：64Cu放射性核純度>99.9%，0.01 mol/L HCl溶液，pH 2.0～2.2，原子高科股份有限公司；乙酸(Metals basis)、乙酸鈉(Metals basis)：Alfa Aesar公司；乙腈：色譜純，德國(guó)Merck。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常昆明(KM)小鼠，6～8周，18～22 g，SPF級(jí)，雄性，15只，北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2019-0008；荷BON-1胰腺癌裸鼠，10～12周，18～23 g，腫瘤大小0.5～1 cm3，雄性，18只，大江康泰(北京)生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(京)2017-0023。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 64Cu-NOTA-NOC制備

取NOTA-NOC(結(jié)構(gòu)示于圖1)多肽，使用乙酸/乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)配制成0.68 g/L(摩爾濃度為0.5 mmol/L)溶液。取48 μL(24 μmol)NOTA-NOC溶液置于EP管內(nèi)，加入20 μL64CuCl2溶液(3.7～7.4 MBq/μL)，渦旋混勻后(反應(yīng)液pH為4.5～4.7)，將EP管放置于干式加熱器的加熱孔內(nèi)，在25 ℃條件下孵育(500 轉(zhuǎn)/min)；15 min后，取出EP管；反應(yīng)液用乙酸/醋酸鈉溶液(pH=4.8)稀釋至所需濃度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待用。

圖1 NOTA-NOC的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of NOTA-NOC

2.2 64Cu-NOTA-NOC的質(zhì)控分析

HPLC分析采用Shimadzu LC-20AT system高效液相儀，ODS-SP C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：0.1%TFA/水；流動(dòng)相B：0.1%TFA/乙腈。洗脫梯度：0～10 min,20%～80%流動(dòng)相B；10～13 min,80%～80%流動(dòng)相B；13～15 min,80%～20%流動(dòng)相B，測(cè)定放化純度，觀察放射性峰的保留時(shí)間。

2.3 體外穩(wěn)定性

2.3.1PBS緩沖體系中的穩(wěn)定性 將64Cu-NOTA-NOC(18～28 MBq)經(jīng)PBS(pH=7.4，0.2 mL)緩沖溶液稀釋后，37 ℃溫育，分別于2、12、24 h取反應(yīng)液，采用HPLC測(cè)定其放化純度。

2.3.2胎牛血清中的穩(wěn)定性 取64Cu-NOTA-NOC(30 μL，18～36 MBq)加入到10%胎牛血清溶液(0.5 mL)中，在37 ℃溫育，分別于2、12、24 h取反應(yīng)液，加入乙腈(100 μL)，渦旋混勻，離心，取上清液，采用HPLC測(cè)定其放化純度。

2.4 脂水分配系數(shù)

將相同體積的正辛醇和磷酸緩沖溶液(pH=7.4)(0.5 mL：0.5 mL)加入到1.5 mL EP管中，再將64Cu-NOTA-NOC(約3.7 MBq,3 μL)溶于上述溶液中。蓋好后充分震蕩5 min，在離心機(jī)中離心分層5 min，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min。分別取有機(jī)相和水相各100 μL于放免管中，在井型γ探測(cè)器中分別測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)，采用logP=log(γ正辛醇/γ緩沖液)計(jì)算脂水分配系數(shù)，重復(fù)操作3次，取平均值為該標(biāo)記物的脂水分配系數(shù)。

2.5 正常KM小鼠的生物分布

正常KM小鼠(雄性，18～22 g)15只，實(shí)驗(yàn)前未禁食，隨機(jī)分為3組，每只尾靜脈注射10 μCi/0.1 mL(多肽的量約為4×10-11mol)的64Cu-NOTA-NOC，在注射后1、4、24 h斷頸處死、同時(shí)取血，取不同臟器稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。

2.6 荷瘤動(dòng)物的生物分布

荷BON-1胰腺癌的裸鼠(雄性，18～22 g)16只，實(shí)驗(yàn)前未禁食，隨機(jī)分為4組，每只尾靜脈注射10 μCi/0.1 mL(多肽的量約為4×10-11mol)的64Cu-NOTA-NOC，在注射后1、2、4、24 h斷頸處死、同時(shí)取血，取不同臟器稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。

2.7 動(dòng)物PET/CT顯像

荷BON-1胰腺癌裸鼠分兩組，實(shí)驗(yàn)前未禁食，分別經(jīng)尾靜脈注射64Cu-NOTA-NOC(400-425 μCi/0.1 mL，約1.6×10-9mol)、64Cu-NOTA-NOC+阻斷劑(blocker，DOTATATE,150 μg)，采用混合氣體麻醉法對(duì)裸鼠麻醉，分別在給藥后的1、4和8 h進(jìn)行PET/CT顯像，圖像采集時(shí)間為15 min。掃描結(jié)束后，使用filtered back projection(FBP)算法對(duì)圖像進(jìn)行重建，使用西門(mén)子的Inveon Research Workplace 2.0工作站對(duì)腫瘤和主要器官進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)記與質(zhì)控

64Cu-NOTA-NOC及NOTA-NOC的液相圖示于圖2。64Cu-NOTA-NOC的標(biāo)記率在室溫反應(yīng)15 min時(shí)即可高于95%。標(biāo)記物64Cu-NOTA-NOC為無(wú)色透明溶液，64Cu2+的保留時(shí)間為3.11 min，目標(biāo)化合物64Cu-NOTA-NOC的保留時(shí)間為10.40 min(其前體化合物NOTA-NOC保留時(shí)間為9.98 min)，放化純度大于95%，可不經(jīng)純化直接用于下一步相關(guān)研究。

圖2 NOTA-NOC的HPLC分析圖(a)及64Cu-NOTA-NOC的Radio-HPLC分析圖(b)Fig.2 HPLC chromatography of NOTA-NOC (a) and Radio-HPLC chromatography of 64Cu-NOTA-NOC (b)

3.2 體外穩(wěn)定性

64Cu-NOTA-NOC在PBS緩沖溶液和10%胎牛血清中的穩(wěn)定性結(jié)果示于圖3。37 ℃下，在PBS緩沖溶液和10%胎牛血清中孵育24 h，放化純度均大于95%，均未見(jiàn)有明顯的游離64Cu2+出現(xiàn)，說(shuō)明其在PBS緩沖溶液和10%胎牛血清中具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 64Cu-NOTA-NOC在PBS緩沖溶液 和10%胎牛血清中的穩(wěn)定性結(jié)果Fig.3 Radiochemistry purity of 64Cu-NOTA-NOC in two systems

3.3 脂水分配系數(shù)

對(duì)64Cu-NOTA-NOC的脂水分配系數(shù)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)所測(cè)得的數(shù)據(jù)計(jì)算得64Cu-NOTA-NOC的脂水分配系數(shù)為-1.12±0.005 6(n=3)，表明該配合物具有親水性。

3.4 正常KM小鼠生物分布

64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1可知，64Cu-NOTA-NOC在腎臟中攝取較高，表明該配合物主要經(jīng)腎臟代謝。同時(shí)在胃、胰腺中也具有較高的攝取，這可能與這些組織和器官內(nèi)SSTR2受體表達(dá)水平較高有關(guān)。1 h時(shí)64Cu-NOTA-NOC在腎、胃及胰腺的放射性攝取率為(11.53±0.94) %ID/g、(10.52±1.31) %ID/g和(7.44±1.30) %ID/g。此外，通過(guò)表1可以看出64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠體內(nèi)的代謝較快，相比于1 h時(shí)相，4 h時(shí)，除大腸外其他器官放射性攝取率均明顯下降。

表1 64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠中的 生物分布Table 1 Biodistribution of 64Cu-NOTA-NOC in normal KM mice n=5)

2018年楊志課題組[3]報(bào)道了64Cu-DOTATATE的研究結(jié)果，結(jié)果顯示64Cu-DOTATATE在Balb/c小鼠體內(nèi)腎臟、肝臟攝取較高，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低，說(shuō)明其主要經(jīng)腎臟、肝臟代謝，同時(shí)在胃、小腸、大腸中也具有較高的放射性攝取。本研究中64Cu-NOTA-NOC在正常KM小鼠體內(nèi)的代謝行為與64Cu-DOTATATE相類似。

3.5 荷瘤動(dòng)物的生物分布

64Cu-NOTA-NOC在荷BON-1胰腺癌裸鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表2，由表2可知，64Cu-NOTA-NOC在血液中清除較快，1 h時(shí)(1.87±0.23)%ID/g ，2 h時(shí)(0.89±0.13)%ID/g。64Cu-NOTA-NOC在腎臟中的放射性攝取較高，1、2、4 h的放射性攝取率分別為(22.16±3.65)%ID/g、(16.93±0.81)%ID/g、(3.92±0.48)%ID/g，表明該化合物主要經(jīng)腎臟代謝，與正常KM小鼠體內(nèi)的代謝相一致。在胃、胰腺等器官和組織中也具有較高的放射性攝取，1 h時(shí)64Cu-NOTA-NOC在胃、胰腺的放射射性攝取率為(19.93±6.13)%ID/g和(10.09±2.11)%ID/g。

從表2可以看出，1、4 h時(shí)，荷瘤鼠肺部對(duì)64Cu-NOTA-NOC的放射性攝取率分別為(9.37±2.69)%ID/g、(3.76±0.41)%ID/g，而在正常KM小鼠體內(nèi)，1、4 h時(shí)，64Cu-NOTA-NOC在肺部的放射性攝取率分別為(14.27±2.59)%ID/g和(9.05±1.68)%ID/g(見(jiàn)表1)。荷瘤鼠肺部和正常KM小鼠肺部對(duì)64Cu-NOTA-NOC的放射性攝取表現(xiàn)出較大的差異性，這可能與小鼠的種屬差異有關(guān)。除肺部外，64Cu-NOTA-NOC在荷瘤鼠體內(nèi)的分布和代謝特點(diǎn)基本與正常KM小鼠相一致。64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中也表現(xiàn)出較高的放射性攝取率，1、2 h分別為(3.74±1.23)%ID/g和(4.80±0.92)%ID/g；注射后4 h，64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中的放射性攝取率下降，但腫瘤/血和腫瘤/肌肉的攝取比仍較高。在1、2、4及24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，腫瘤/血和腫瘤/肌肉的攝取比在2 h時(shí)最高，分別為5.36和10.38。該研究中靶與非靶的攝取比高于楊志課題組[3]報(bào)道的64Cu-DOTATATE在荷PANC-1胰腺癌裸鼠中靶與非靶的比(1、10 h的腫瘤/血攝取比分別為(0.80±0.05)、(1.30±0.09)，1、10 h的腫瘤/肌肉攝取比分別為(1.23±0.11)、(1.89±0.09)。

表2 64Cu-NOTA-NOC在荷BON-1胰腺癌裸鼠中的生物分布Table 2 Biodistribution of 64Cu-NOTA-NOC in nude mice bearing BON-1 tumor n=4)

3.6 動(dòng)物PET/CT顯像

64Cu-NOTA-NOC在荷BON-1胰腺癌裸鼠體內(nèi)的PET/CT顯像結(jié)果示于圖4。給藥后1 h，64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中出現(xiàn)放射性濃聚，而加入阻斷劑后，腫瘤攝取明顯降低，提示腫瘤對(duì)64Cu-NOTA-NOC的攝取具有特異性。對(duì)64Cu-NOTA-NOC及64Cu-NOTA-NOC+Block的顯像結(jié)果進(jìn)行定量計(jì)算(見(jiàn)表3)，結(jié)果顯示，64Cu-NOTA-NOC在小鼠體內(nèi)代謝較快；1 h時(shí)64Cu-NOTA-NOC在腫瘤中攝取率最高，為7.7%ID/g，而64Cu-NOTA-NOC+Block在1 h時(shí)腫瘤攝取率為0.94%ID/g，提示64Cu-NOTA-NOC能夠特異性的靶向腫瘤部位。與此同時(shí)64Cu-NOTA-NOC在膀胱、膽囊及胃中的攝取均較高，其中膀胱、膽囊在1 h時(shí)，攝取率最高，分別為28.1%ID/g和7.2%ID/g。

圖4 荷BON-1胰腺癌裸鼠注射 64Cu-NOTA-NOC(a)與64Cu-NOTA-NOC+ Blocker(b)后1 h的PET/CT顯像結(jié)果Fig.4 PET/CT images of nude mice bearing BON-1 tumor injected with 64Cu-NOTA -NOC (a) and 64Cu-NOTA-NOC (b) acquired at 1 h

表3 64Cu-NOTA-NOC及阻斷實(shí)驗(yàn)中荷BON-1胰腺癌裸鼠的各個(gè)器官攝取率Table 3 Organ uptakes of 64Cu-NOTA-NOC in nude mice bearing BON-1 tumor with or without co-injection of blocker DOTATATE (150 μg) at 1 h, 4 h, 8 h

4 小結(jié)

本文對(duì)64Cu-NOTA-NOC的制備、質(zhì)控分析、體外穩(wěn)定性及生物學(xué)分布進(jìn)行了初步研究。64Cu對(duì)NOTA-NOC的標(biāo)記能夠在溫和的反應(yīng)條件下高標(biāo)記率的完成，在室溫條件下，反應(yīng)15 min即可實(shí)現(xiàn)95%以上的標(biāo)記率。64Cu-NOTA-NOC在緩沖溶液及10%胎牛血清中37℃孵育24 h，放化純度均大于95%，表明具有較好的體外穩(wěn)定性；動(dòng)物體內(nèi)主要經(jīng)腎臟代謝，符合八肽類化合物在生物體內(nèi)的代謝行為。64Cu-NOTA-NOC在動(dòng)物體內(nèi)清除較快，在胰腺癌腫瘤組織中有較高攝取，能夠獲得清晰的PET/CT圖像，腫瘤/血和腫瘤/肌肉放射性攝取比于注后1、2和4 h均較高。初步的研究結(jié)果表明，64Cu-NOTA-NOC具有較好的體內(nèi)外性質(zhì)，具有用于胰腺癌診斷的潛質(zhì)，后期將針對(duì)動(dòng)物模型、給藥量等因素開(kāi)展進(jìn)一步研究。