何立江,黃杰苗,吳俊哲,柯呈輝,吳文華
(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院脊柱骨科,福建泉州 362046)
隨著我國(guó)逐漸步入老年化社會(huì),老年性骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥越來(lái)越受到重視。國(guó)外權(quán)威機(jī)構(gòu)調(diào)查顯示全球大約有2 億人患有輕重不一的骨質(zhì)疏松癥,該病現(xiàn)已成為全球多發(fā)病、常見(jiàn)病的第6 位[1]。由于骨礦物質(zhì)含量減少、骨骼強(qiáng)度降低和骨的脆性增加,患者極易發(fā)生骨折,具有極高的致殘率和致死率,盡快提高患者骨密度和骨礦物質(zhì)含量,促進(jìn)骨折愈合避免出現(xiàn)二次骨折顯得尤為重要,因此骨質(zhì)疏松癥性骨折的治療已成為當(dāng)今研究的熱門(mén)課題[2,3]。
二膦酸鹽類(lèi)藥物(bisphosphonates,BPs)是當(dāng)前治療骨質(zhì)疏松的重要手段,也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn),利塞膦酸鈉是其中的代表藥物,其主要通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性對(duì)骨骼代謝產(chǎn)生作用,雖有學(xué)者擔(dān)心此類(lèi)藥物會(huì)影響骨的重建,進(jìn)而對(duì)骨折的愈合過(guò)程造成影響[4],但多數(shù)研究表明骨質(zhì)疏松骨折術(shù)后應(yīng)用該類(lèi)藥物可以提升患者骨折處的骨骼骨量,降低再骨折的發(fā)生率,可作為沒(méi)有禁忌證的老年骨質(zhì)疏松患者的首選藥物[5]。
目前對(duì)于骨折術(shù)后應(yīng)用二膦酸鹽類(lèi)藥物的最佳時(shí)間尚無(wú)定論,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討術(shù)后不同時(shí)間應(yīng)用利塞膦酸鈉對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨骨折愈合的影響,為臨床應(yīng)用二膦酸鹽類(lèi)藥物時(shí)機(jī)選擇提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
90 只健康6 個(gè)月齡雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠,體重(232.07±16.25)g,由閩侯吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第910 醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分組籠養(yǎng),室溫控制在(24±2)°C,專人喂養(yǎng),自由飲水。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周稱重并記錄,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 使用原則給予照護(hù)。隨機(jī)分為3 組,每組30 只。
大鼠按300 mg/kg 的10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉,由背側(cè)入路,于脊柱旁開(kāi)1 ㎝、髂骨脊上2 ㎝處為手術(shù)切口,切口長(zhǎng)1 ㎝,分離肌層顯露卵巢,切除卵巢并縫扎殘端,逐層關(guān)閉切口。術(shù)后3 d 肌注青霉素80 萬(wàn)單位,2 次/d。卵巢切除術(shù)后第4 周,各組分別處死10 只,檢測(cè)股骨骨密度確定制備骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型成功,并測(cè)量骨折建模前股骨力學(xué)指標(biāo)。
卵巢切除去勢(shì)手術(shù)4 周后,對(duì)3 組大鼠同樣麻醉狀態(tài)下,選取左股骨中段為手術(shù)切口,切口長(zhǎng)1 cm,顯露出股骨并截?cái)喙晒?,以直?.5 mm 鋼針經(jīng)髓腔固定斷端,逐層縫合各層組織。嚴(yán)格無(wú)菌手術(shù)操作,術(shù)后3 d 肌注青霉素80 萬(wàn)單位,2 次/d。
3 組動(dòng)物分別于骨折模型建立術(shù)后1 d、10 d 和20 d 開(kāi)始給予利塞膦酸鈉灌胃,0.1 mg/(kg·d),持續(xù)至處死動(dòng)物。于骨折建模術(shù)后3 周和6 周,分別處死3 組各10 只動(dòng)物,取出左側(cè)股骨,行以下檢測(cè)。
1.4.1 骨礦檢測(cè)
所有股骨標(biāo)本置入雙能X 線吸收儀,測(cè)量各標(biāo)本骨密度值(bone mineral density,BMD)的變化。
1.4.2 影像學(xué)檢查與測(cè)量
將處死后所有大鼠股骨標(biāo)本于標(biāo)準(zhǔn)位拍攝X 線片,攝片參數(shù)41 kV,2.80 mAs,在PACS 系統(tǒng)分別觀察骨折閉合間隙,測(cè)量斷端骨皮質(zhì)厚度,觀察骨折愈合和內(nèi)固定改變等情況。
1.4.3 組織學(xué)檢查與評(píng)分
3 組各10 個(gè)股骨標(biāo)本,經(jīng)固定、脫鈣、脫水、浸蠟制備蠟塊,切制3 μm 的切片,行HE 染色。4×10 倍光鏡視野下,計(jì)數(shù)軟骨細(xì)胞數(shù),觀察骨痂處骨小梁、骨樣組織等。
1.4.4 生物力學(xué)檢查3 組各10 個(gè)股骨標(biāo)本行力學(xué)測(cè)試。采用4 點(diǎn)彎曲力學(xué)檢測(cè)方法,標(biāo)本底端固定,固定支點(diǎn)跨距20 mm,頂端加壓支點(diǎn)跨距8 mm,保持標(biāo)本濕潤(rùn)狀態(tài)下單軸側(cè)向加壓至標(biāo)本斷裂,加載速度1 mm/min,繪制載荷-位移曲線,記錄股骨骨痂處最大抗折彎載荷。
采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示,資料呈正態(tài)分布時(shí),采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 法。資料呈非正態(tài)分布時(shí),采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
三組動(dòng)物骨密度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。隨時(shí)間推移,1 d 組BMD 均持續(xù)顯著增加(P<0.05);相比之下,10 d 組和20 d 組的BMD 呈曲線改變,骨折后3 周時(shí)下降至谷底,骨折后6 周時(shí)再次升高,不同時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨折前,三組間的BMD 的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),骨折3 周時(shí),1 d 組和10 d 組BMD 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但兩組均高于20 d 組(P<0.05);骨折6 周時(shí),BMD由高至低依次為:1 d 組>10 d 組>20 d 組,三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表1 三組大鼠骨折前后骨密度檢測(cè)結(jié)果(±s)與比較
表1 三組大鼠骨折前后骨密度檢測(cè)結(jié)果(±s)與比較
指標(biāo)BMD 值(g/cm2)P 值0.376<0.001<0.001時(shí)間點(diǎn)骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組(n=10)0.119±0.007 0.124±0.006 0.280±0.030<0.001 10 d 組(n=10)0.122±0.005 0.119±0.004 0.213±0.020<0.001 20 d 組(n=10)0.121±0.004 0.114±0.006 0.123±0.005<0.001
三組骨折后6 周典型影像改變見(jiàn)圖1,可見(jiàn)1 d組內(nèi)固定物無(wú)移位松動(dòng),骨折愈合良好(圖1a);10 d 組骨折愈合,骨痂生長(zhǎng)良好(圖1b);20 d 組骨折處骨痂生長(zhǎng),但骨皮質(zhì)較顯單?。▓D1c)。
圖1 骨折后6 周三組大鼠股骨X 線檢查所見(jiàn) 1a: 1 d 組骨折愈合良好 1b: 10 d 組骨折愈合,骨痂生長(zhǎng)良好 1c: 20 d 組斷端骨痂生長(zhǎng),但骨皮質(zhì)較顯單薄
三組骨折后6 周骨折端典型組織學(xué)改變見(jiàn)圖2, 可見(jiàn)1 d 組的骨小梁較豐富,骨細(xì)胞數(shù)量多(圖2a);10 d 組骨小梁結(jié)構(gòu)清晰,骨細(xì)胞數(shù)較多(圖2b);20 d 組骨小梁較稀疏,連續(xù)性較差,相比前兩組骨細(xì)胞數(shù)目少(圖2c)。
圖2 骨折后6 周三組大鼠股骨骨折端組織學(xué)所見(jiàn)(HE,4×10) 2a: 1 d 組可見(jiàn)骨小梁較密集,骨細(xì)胞數(shù)量多 2b: 10 d組骨小梁連續(xù)性較好,骨細(xì)胞數(shù)較多 2c: 20 d 組骨小梁稀疏,連續(xù)性較差,骨細(xì)胞數(shù)目較少
兩組形態(tài)計(jì)量結(jié)果見(jiàn)表2。與骨折后3 周相比,骨折后6 周時(shí),3 組大鼠骨折端骨皮質(zhì)厚度均有增厚,骨折后3 周、6 周時(shí),1 d 組、10 d 組兩組間骨皮質(zhì)厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但兩組骨皮質(zhì)厚度較20d 組有顯著增加(P<0.05);此外與骨折后3 周相比,骨折后6 周時(shí),3 組大鼠標(biāo)本40 倍視野下骨細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),3周、6 周時(shí),1 d 組、10 d 組兩組間細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但均較20 d 組有顯著增加(P<0.05)。
表2 三組大鼠骨折端形態(tài)計(jì)量結(jié)果(±s)與比較
表2 三組大鼠骨折端形態(tài)計(jì)量結(jié)果(±s)與比較
指標(biāo)影像測(cè)量骨皮質(zhì)厚度(mm,n=10)骨折后3 周骨折后6 周P 值4×10 視野骨細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè),n=10)骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組10 d 組20 d 組P 值<0.001 0.033 0.35±0.04 0.53±0.06<0.001 0.32±0.03 0.52±0.07<0.001 0.24±0.03 0.46±0.04<0.001<0.001 0.046 350.30±39.19 326.60±39.03 0.192 340.9±38.23 323.50±39.96 0.333 275.4±37.11 285.70±36.88 0.541
三組力學(xué)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。隨時(shí)間推移,三組股骨標(biāo)本的最大載荷均顯著下降(P<0.05);骨折前,三組間最大載荷的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,骨折后3 周、6 周,1 d 組、10 d 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),10 d 組、20 d 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但1 d 組最大載荷高于20 d 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表3 三組股骨標(biāo)本最大載荷測(cè)量結(jié)果(N,±s)與比較
表3 三組股骨標(biāo)本最大載荷測(cè)量結(jié)果(N,±s)與比較
時(shí)間點(diǎn)骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組(n=5)38.10±3.51 34.10±3.51 26.10±4.15<0.001 10 d 組(n=5)37.60±3.47 31.90±3.41 23.10±3.73<0.001 20 d 組(n=5)38.70±3.30 30.10±3.03 21.50±3.17<0.001 P 值0.774 0.040 0.031
本次實(shí)驗(yàn)三組大鼠均實(shí)現(xiàn)骨折愈合,表明在骨轉(zhuǎn)換中利塞膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞活性未造成明顯干擾,不會(huì)造成骨折不愈合的不利影響,這與其他學(xué)者的觀點(diǎn)是相似的[6,7]。骨折術(shù)后第3 周時(shí),1 d、10 d 兩組大鼠骨密度含量均高于尚且未使用利塞膦酸鈉的20 d 組,表明在骨折愈合早期利塞膦酸鈉有助于快速提升骨密度,其機(jī)理可能主要通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用、干擾成熟破骨細(xì)胞的功能等方面發(fā)揮作用[8]。1 d、10 d 兩組大鼠分別相差10 d 后應(yīng)用利塞膦酸鈉,但具有相近的中短期療效,考慮為利塞膦酸鈉起效較快,短時(shí)間內(nèi)即能有效提高骨密度,故早期和偏早期使用該藥物具有較近似的效果,有對(duì)比研究亦表明利塞膦酸鈉能縮短骨質(zhì)疏松患者的骨折愈合時(shí)間[9]。
在骨折術(shù)后第6 周時(shí),三組大鼠均實(shí)現(xiàn)股骨骨折愈合,未發(fā)生內(nèi)固定松動(dòng)和再骨折,相比其他種類(lèi)抗骨質(zhì)疏松藥物具有較高的安全性[10]。但X 線影像顯示1 d、10 d 兩組大鼠骨折愈合處的骨痂總體來(lái)說(shuō)相對(duì)更加厚實(shí),骨皮質(zhì)也更顯粗厚,骨小梁數(shù)量較高也較密集,骨小梁相互之間連續(xù)性更好。病理切片顯示出相類(lèi)似的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),分別從骨折早期和偏早期開(kāi)始應(yīng)用利塞膦酸鈉,在骨折愈合過(guò)程的中期時(shí),其增加骨密度的效果是相近的,但在骨折愈合晚期則表現(xiàn)出不同的療效,數(shù)據(jù)顯示三組大鼠股骨骨密度遠(yuǎn)期療效指標(biāo)間亦存在差異,較早使用利塞膦酸鈉也能更大程度提升骨折愈合時(shí)股骨最大載荷值等生物力學(xué)指標(biāo)。從另一個(gè)角度思考,是否利塞膦酸鈉在骨折愈合后期的作用隨著時(shí)間的推移而效果逐漸降低?結(jié)合本實(shí)驗(yàn),作者認(rèn)為利塞膦酸鈉對(duì)骨密度的提升趨勢(shì)是具有一定程度的時(shí)間依賴性的,即隨著時(shí)間的進(jìn)展其提升趨勢(shì)逐漸放緩。
做為具有較強(qiáng)藥物活性的二膦酸鹽類(lèi)藥物,利塞膦酸鈉在本次骨質(zhì)疏松骨折術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的應(yīng)用研究中,并未對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成骨折不愈合的不利影響,而且盡早應(yīng)用二膦酸鹽類(lèi)藥物能夠更快促進(jìn)骨折處鈣鹽的沉積,增加骨密度改善骨質(zhì)量,增強(qiáng)骨折愈合強(qiáng)度,能夠達(dá)到預(yù)防內(nèi)固定松動(dòng)和二次骨折發(fā)生的作用。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處:首先本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)樣本不夠大,未能更細(xì)分時(shí)間點(diǎn)來(lái)對(duì)骨愈合指標(biāo)的提升曲線變化做更細(xì)致的相關(guān)性分析,其次,鑒于有報(bào)道長(zhǎng)時(shí)間使用二膦酸鹽類(lèi)藥物會(huì)增加非典型性股骨骨折風(fēng)險(xiǎn)[11],因此對(duì)該類(lèi)藥物的安全有效用藥時(shí)間及對(duì)骨折愈合的遠(yuǎn)期效果,需要更長(zhǎng)時(shí)間跨度的進(jìn)一步研究。