三七總皂苷對脂多糖(LPS)誘導小鼠急性肺損傷的保護作用

閆旭，苗芳，徐淑建，魏勤庚，魏新明，方圓，祁藝新，孫柯嘉，董素淼，婁志國，隋宏書

(1.山東第一醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，山東 泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理教研室，山東 泰安 271000；3.山東第一醫(yī)科大學通識教育部，山東 泰安 271000；4.山東第一醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室， 山東 泰安 271000)

0 引言

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全。以肺容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征，臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，肺部影像學上表現(xiàn)為非均一性的滲出性病變，最終發(fā)展為更為嚴重的致命性急性呼吸窘迫綜合征ARDS[1]。經(jīng)過不斷研究，人們對ALI 的發(fā)病機制有了一定的認識，患者由于肺部損傷引起全身過度的炎癥反應，加速肺部炎癥反應過程并促進ALI 的發(fā)展。盡管我們對ALI 有了一定的了解，但是ALI/ARDS 的致死率仍然高達30%～50%[2]。現(xiàn)階段主要通過控制原發(fā)病、對癥處理和支持治療等以改善肺通氣和組織氧供，但均未取得理想效果。因此，開發(fā)高效的治療藥物是治愈ALI 的當務之急。

自噬是一種高度保守的細胞降解和再循環(huán)過程。在哺乳動物細胞中有3種主要類型的自噬：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬(CMA)[3]。這3種自噬方式最終都是將細胞質(zhì)(受損的細胞器或蛋白質(zhì))運送到溶酶體進行降解和再循環(huán)。自噬通常被認為是細胞的保護機制[4]。越來越多的證據(jù)表明自噬在各種條件下的ALI發(fā)病機理中[5]。一方面適度的自噬能抑制炎性因子的釋放；另一方面，過度的自噬能加重細胞損傷。大量研究結果表明自噬在ALI的炎癥發(fā)生、發(fā)展以及發(fā)病機制中起關鍵作用，但其調(diào)控ALI炎癥的最終結果與不同的細胞類型有關。比如，自噬缺陷小鼠體內(nèi)巨噬細胞自噬受到抑制，誘導炎癥發(fā)生，小鼠死亡率上升[6]。在LPS誘導的小鼠ALI中，中性粒細胞的自噬為中性粒細胞的活化及顆粒內(nèi)容物的釋放所必須的；在ALI期間中性粒細胞自噬增加，導致顆粒內(nèi)容物釋放增加[7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，抑制肺上皮細胞自噬，可以緩解ALI[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在LPS誘導的ALI小鼠模型中出現(xiàn)過度自噬[9]。PI3K/AKT/mTOR途徑被認為是調(diào)節(jié)自噬的必要信號途徑[10]。經(jīng)了解，有實驗成功通過激活PI3K/AKT/mTOR途徑來抑制LPS誘導的小鼠ALI模型的細胞自噬[11]。這證明，PI3K/AKT/mTOR途徑與自噬是治療ALI的一個潛在靶點。但目前仍未見有將該通路和自噬與ALI聯(lián)系在一起的文章。

三七又名田七，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有散瘀止血、消腫定痛等功效。三七總皂苷(PNS)是三七的有效活性成分，含有人參皂苷Rh、人參皂苷Rg、三七皂苷R。等主要成分，隨著研制成血塞通、血栓通等中藥制劑后，三七總皂苷廣泛應用于腦梗死的臨床治療[12]。近期有研究證明，三七總皂苷可以通過激活PI3K/AKT/mTOR途徑來促進細胞再生，抑制自噬[13]。這證明三七總皂苷有通過該通路來治療ALI的可能性。但目前尚未出現(xiàn)用三七總皂苷治療ALI的相關研究。

三七總皂苷，作為早已被廣泛應用的臨床藥物，其安全性是公認的，鑒于其抗炎作用和調(diào)節(jié)自噬的作用，三七總皂苷很有可能成為治療ALI的高效藥物。但最終三七總皂苷是否可以有效治愈ALI以及使用的最佳藥量，我們?nèi)孕柰ㄟ^實驗去求證和探索。本實驗擬對此進行研究，為三七總皂苷在治療ALI的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性BALB/C小鼠(8～10周，25～30g)購于山東省朋悅實驗動物繁育有限公司；LPS(5mg/kg，Sigma-Aldrich)；三七總皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)，購自廣西梧州制藥股份有限公司；SOD測試盒(Solarbio Science and Technology Corporation，Beijing，China)；MDA(丙二醛)檢測試劑盒(Sigma-Aldrich)。

1.2 動物分組及模型制備

實驗小鼠采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為4組，每組6只：LPS組(LPS處理)，對照組(50μL生理鹽水處理)，LPS+低劑量PNS組，LPS+高劑量PNS組。LPS組：通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉小鼠，然后氣管內(nèi)滴注50μLLPs(5mg/kg)刺激小鼠，6h后處死小鼠。對照組：通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉小鼠，然后氣管內(nèi)滴注50μL生理鹽水，6h后處死小鼠。LPS+低劑量PNS組與LPS+高劑量PNS組：通過尾靜脈向小鼠注射低劑量(5mg/kg)或高劑量PNS(20mg/kg)，每日一次，連續(xù)給藥3天。3天給藥結束后，進行LPS處理，6h后腹腔注射10%水合氯醛0.5mL處死小鼠。保存各組小鼠肺組織樣本以進行進一步分析。

1.3 檢測指標

1.3.1 蘇木素-伊紅染色(H＆E染色)

分離右肺組織，并在4℃的4%多聚甲醛中固定24h，然后用10%，20%，30%的梯度蔗糖脫水。將組織的表面干燥并且將組織包埋在石蠟中以制備厚度為8μm的切片。切片用伊紅和蘇木素染色。

1.3.2 肺干重(W/D)比值

為評估小鼠肺水腫程度，切除小鼠的肺組織并立即稱重以獲得濕重(W)。然后將肺組織置于60℃的干燥箱中加熱5天以獲取干燥重量(D)。通過評估W/D比來評估肺組織中的水腫。

1.3.3 肺組織SOD活性和MDA含量測定

收集小鼠右肺組織制備組織勻漿，以300g離心5min后收集上清液。分別使用SOD測定試劑盒和MDA檢測試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。嚴格按照試劑盒說明測定SOD活性和MDA含量。

1.4 統(tǒng)計分析

每次實驗至少重復進行3次，實驗數(shù)據(jù)的處理均由SPSS 17.0 軟件分析，作圖軟件選用 GraphPadPrism 5.0；計量資料以 (mean±SD)表示。3組或3組以上的多樣本間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多重比較使用LSD方法。如果數(shù)據(jù)不符合單因素方差分析的條件，則采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織形態(tài)學損傷的比較

對照組肺組織結構形態(tài)正常；LPS組小鼠肺組織損傷嚴重，伴有大量炎性細胞浸潤，血管充血和支氣管壁增厚；LPS+低劑量PNS組小鼠肺組織損傷嚴重，同LPS組并無明顯差異；LPS+高劑量PNS組小鼠肺組織僅部分受損，輕度炎性細胞浸潤(見圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖

2.2 肺組織濕干重比的比較

圖2所示，與對照組相比，LPS組、LPS+低劑量PNS組和LPS+高劑量PNS組濕干重比升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+低劑量PNS組濕干重比降低但差異較小，LPS+高劑量PNS組濕干重比降低(P<0.05)；與LPS+低劑量PNS組相比，LPS+高劑量PNS組濕干重比降低(P<0.05)。

圖2 各組小鼠肺組織濕/干重（W/D）

2.3 肺組織氧化應激水平的比較

圖3所示，與對照組相比，LPS組、LPS+低劑量PNS組和LPS+高劑量PNS組SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+低劑量PNS組SOD活性降低，MDA含量降低，但差異較小，LPS+高劑量PNS組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)；與LPS+低劑量PNS組相比，LPS+高劑量PNS組SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。

圖3 各組小鼠肺組織SOD和MDA的活力水平

3 討論

急性肺損傷是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全。其病死率高達68%，發(fā)病機理和治療策略有待深入研究。目前在活體水平上尚無合適手段來研究ALI的發(fā)病機制、治療策略和預后評估；臨床上患者對治療反應也存在很大差異，至今尚無明確的治療靶點和合理的治療方案。研究表明，在ALI 早期，細胞自噬被認為是ALI 發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。三七總皂苷可以通過激活PI3K/Akt/mTOR 通路提高細胞存活率并誘導細胞再生。為了探究三七總皂苷對ALI的保護作用，本研究通過氣管滴注LPS構建ALI模型。本研究發(fā)現(xiàn)，氣管滴注LPS后，肺組織濕干重比明顯增加，肺組織損傷和水腫加重，這表明ALI模型建立成功。

ALI的發(fā)病機制涉及氧化和抗氧化之間的失衡[14]，因此，我們確定了SOD的活性以及MDA的表達。MDA為氧自由基脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，其含量與自由基損傷細胞程度成正比。而SOD為體內(nèi)的一種自由基清除劑，SOD活性的高低反映體內(nèi)自由基是否過剩[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，氣管滴注LPS后，肺組織SOD活性降低，MDA含量升高。而高劑量三七總皂苷預處理則明顯的改善了這種變化，這表明三七總皂苷可以通過減輕氧化應激反應對ALI產(chǎn)生保護作用。這與三七總皂苷減輕細胞損傷，減弱細胞過度自噬，抑制細胞凋亡的功能是一致的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以通過發(fā)揮其抗氧化應激，減輕細胞過度自噬抑制細胞凋亡的作用來對LPS引起的小鼠ALI起到一定的保護作用。