外源施硒對(duì)小白菜硒富集與土壤生物活性的影響

唐俊杰，肖孔操，段鵬鵬，李德軍，劉永賢

（1. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 中國(guó)科學(xué)院環(huán)江喀斯特生態(tài)系統(tǒng)觀測(cè)研究站，廣西 環(huán)江 547100；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007）

硒是人和動(dòng)物必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，其在提高機(jī)體免疫力、延緩細(xì)胞老化及防癌抗癌等方面都具有非常重要的作用[1]。人體對(duì)硒的攝取主要來(lái)自于日常飲食，因而提高食物中的硒含量對(duì)于改善人體硒營(yíng)養(yǎng)狀況具有重要意義。植物從土壤中吸收硒是硒進(jìn)入食物鏈的第一步。鑒于全球大部分地區(qū)土壤含硒量低或生物有效性低，導(dǎo)致進(jìn)入食物鏈中的硒水平整體較低，國(guó)際上普遍通過(guò)外源施硒等措施來(lái)提高作物硒含量，即生物強(qiáng)化（biofortification）[2-5]。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同化學(xué)價(jià)態(tài)（如硒酸鹽SeO42-和亞硒酸鹽SeO32-）[6-8]、不同添加濃度[9-11]及不同施用方式（如葉施和土施）[12-13]等方面就外源施硒對(duì)作物生長(zhǎng)、產(chǎn)量與品質(zhì)、硒吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響開(kāi)展了大量的研究。另一方面，硒具有生物毒性，過(guò)量攝取會(huì)導(dǎo)致硒中毒，不同價(jià)態(tài)和形態(tài)硒的毒性也存在明顯差異。迄今為止，外源施硒是否以及如何影響土壤生物活性這方面的關(guān)注嚴(yán)重不足。以往在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的硒肥多為無(wú)機(jī)形態(tài)硒，包括亞硒酸鈉和硒酸鈉，但存在毒性強(qiáng)、肥料利用率低等問(wèn)題。近年來(lái)，有機(jī)態(tài)硒肥憑借其低毒、環(huán)保等方面的優(yōu)勢(shì)在生產(chǎn)應(yīng)用中逐漸受到重視[14-16]。不同形態(tài)的硒肥施用對(duì)土壤生物活性的影響是否存在差異目前尚不明確。

外源施硒會(huì)對(duì)土壤生物活性（如微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)、代謝等）產(chǎn)生何種影響，目前相關(guān)認(rèn)識(shí)十分缺乏。土壤微生物是土壤的重要組成部分，其在有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)等方面起著關(guān)鍵性的作用，也是表征土壤肥力水平與生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[17-18]。樊俊等[19]發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉和硒酸鈉在施用水平為5～10 mg/kg時(shí)可促進(jìn)植煙土壤微生物數(shù)量增加，而施用水平達(dá)到30 mg/kg時(shí)，可導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量下降。戴志華與涂書(shū)新[20]指出，外源硒高量施用時(shí)（20 mg/kg）可抑制水稻土微生物多樣性和豐度。程勤等[21]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，施用亞硒酸鈉顯著影響油菜根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，但對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)影響不明顯。由此可見(jiàn)，低量的外源硒施用對(duì)土壤微生物生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，而高量外源硒施用則可能會(huì)抑制土壤微生物。然而，以往研究均采用無(wú)機(jī)硒，而有機(jī)態(tài)硒對(duì)土壤微生物的影響尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道，有機(jī)態(tài)硒施用與傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)硒施用效果是否存在差異尚未可知。

為此，本研究選擇兩種硒肥類(lèi)型（亞硒酸鈉和氨基酸螯合態(tài)硒），并設(shè)置兩種不同濃度水平（土壤硒含量3 mg/kg和6 mg/kg），以常見(jiàn)蔬菜小白菜作為栽培作物，在研究不同形態(tài)與水平硒肥施用對(duì)小白菜硒富集影響的同時(shí)，探討了土壤生物活性的響應(yīng)特征，以期為富硒蔬菜生產(chǎn)實(shí)踐與科學(xué)施硒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小白菜（Brassica chinensisL.）選擇當(dāng)?shù)刂髟云贩N“早熟5號(hào)”。供試土壤為石灰土，采自廣西環(huán)江縣中國(guó)科學(xué)院環(huán)江喀斯特農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站試驗(yàn)田。采用多點(diǎn)取樣法采集表層0～20 cm土壤，自然風(fēng)干后研磨過(guò)2 mm篩。土壤pH值7.63，有機(jī)碳含量34.15 g/kg，全氮含量3.23 g/kg，有效磷含量15.2 mg/kg，粘粒19.7%，粉粒72.7%，沙粒7.6%，全硒含量0.89 mg/kg。亞硒酸鈉（Na2SeO3）（分析純，純度＞98%），購(gòu)自于Sigma-Aldrich公司。氨基酸螯合態(tài)硒（以下簡(jiǎn)稱“螯合硒”）由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所提供，是將亞硒酸鈉與氨基酸溶液經(jīng)一定配比和工序螯合而成，硒含量為2 088.1 mg/L，有機(jī)硒含量占94.8%[22]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用盆栽試驗(yàn)，在廣西河池市環(huán)江縣中國(guó)科學(xué)院環(huán)江喀斯特農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)硒添加處理，包括加清水（對(duì)照）、亞硒酸鈉L1（土壤硒含量3 mg/kg）、螯合硒L1（土壤硒含量3 mg/kg）、亞硒酸鈉L2（土壤硒含量6 mg/kg）、 螯合硒L2（土壤硒含量6 mg/kg），以上硒添加水平均指純硒濃度，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。本試驗(yàn)中硒肥施用量參考杜振宇等[23]研究以及當(dāng)?shù)馗晃卟松a(chǎn)中的實(shí)際用量確定。具體試驗(yàn)方法為：選擇直徑22 cm、深度為25 cm的塑料盆，每盆裝土5.7 kg，施入底肥（10 g復(fù)合肥+ 500 g腐熟牛糞）混勻。將亞硒酸鈉用去離子水配成溶液，氨基酸螯合態(tài)硒則按相應(yīng)比例稀釋以后加入土壤中拌勻。土壤裝盆平衡72 h后，將提前育苗的5株小白菜幼苗移栽至花盆中。待幼苗長(zhǎng)出第三片葉后，再間苗至每盆1株。整個(gè)試驗(yàn)期間植株均在自然光照條件下生長(zhǎng)，其他管理措施按當(dāng)?shù)亓?xí)慣進(jìn)行。間苗40 d后，將小白菜按地上和根系分別收獲，用去離子水洗凈表面附著泥土后，烘干稱重，記錄干物質(zhì)量，然后用球磨儀粉碎過(guò)0.15 mm篩，分析其中的硒含量。將各處理盆栽土壤過(guò)2 mm篩，剔除細(xì)根與石子后混勻，經(jīng)冷凍干燥的8 g土壤用于測(cè)定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)（PLFA法），其余鮮土于4 ℃冰箱中保存，用于測(cè)定土壤酶活性。

1.3 測(cè)定方法

土壤pH采用pH計(jì)測(cè)定（土水比1∶2.5）；有機(jī)碳（SOC）含量用重鉻酸鉀容量法；全氮采用凱氏定氮法；土壤顆粒組成用激光粒度儀測(cè)定；植物硒用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法（北京吉天HGAFS830原子熒光分光光度計(jì)）測(cè)定；土壤PLFA測(cè)定方法如下：用經(jīng)冷凍干燥的8 g土壤，進(jìn)行樣品的浸提、分離、酯化、萃取，再用N2吹干，最后用加內(nèi)標(biāo)的正已烷溶解。以19∶0甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，在氣相色譜儀上采用MIDI軟件識(shí)別各種PLFA組分，并測(cè)定含量[24]。最后將各類(lèi)PLFA劃分為細(xì)菌、真菌、放線菌、原生動(dòng)物與綠藻。土壤β-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）與堿性磷酸酶（ALP）活性使用酶標(biāo)儀測(cè)定，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[25]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行作圖；用SPSS 16.0軟件（SPSS Inc.， Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在統(tǒng)計(jì)分析前檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的正態(tài)性與同質(zhì)性。采用方差分析（ANOVA）確定不同硒添加處理間小白菜生物量、硒濃度、富集轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、土壤微生物量、群落結(jié)構(gòu)和土壤酶活性的差異是否顯著，并在P＜ 0.05水平下檢驗(yàn)差異顯著性。采用皮爾森相關(guān)性分析確定土壤微生物群落PLFA含量、土壤酶活性與小白菜硒濃度之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小白菜生物量

如圖1所示，不同形態(tài)與水平硒添加對(duì)小白菜地上和根系生物量的影響不一。與對(duì)照相比，3 mg/kg 亞硒酸鈉處理對(duì)小白菜地上生物量沒(méi)有顯著影響，而6 mg/kg亞硒酸鈉處理小白菜地上部分生物量顯著降低，降幅達(dá)30%（圖1A）。兩個(gè)水平的螯合硒添加均未對(duì)小白菜地上部分生物量產(chǎn)生顯著影響（圖1A）。另一方面，兩個(gè)水平亞硒酸鈉添加對(duì)小白菜根系生物量均沒(méi)有顯著影響，而3 mg/kg螯合硒處理小白菜根系生物量顯著高于對(duì)照（圖1B）。這與吳雄平等[26]的研究結(jié)果有所不同，其用西北紅油土（pH=7.75）進(jìn)行盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉添加量在＜10 mg/kg時(shí)，其對(duì)小白菜生長(zhǎng)均表現(xiàn)出促進(jìn)效果；當(dāng)亞硒酸鈉添加量達(dá)到60 mg/kg時(shí)，對(duì)小白菜根系生長(zhǎng)才有明顯抑制。可見(jiàn)小白菜在西北紅油土中生長(zhǎng)時(shí)對(duì)亞硒酸鈉毒性的耐受能力要遠(yuǎn)高于在西南石灰土中。此外，Cartes等[27]用火山灰土（pH=5.75）進(jìn)行盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉添加量在10 mg/kg以內(nèi)，其對(duì)黑麥草生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。以上表明，不同的植物種類(lèi)以及外界環(huán)境（如土壤性質(zhì)）可對(duì)外源施硒效應(yīng)造成極大的影響。

2.2 小白菜硒富集與轉(zhuǎn)運(yùn)

不同形態(tài)與水平外源施硒對(duì)小白菜硒富集的影響也有所差異（圖2）。與對(duì)照相比，亞硒酸鈉處理小白菜地上硒濃度有顯著提升，而螯合硒處理地上部分硒濃度雖然也有一定程度的增加，但并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)差異顯著水平（P＞ 0.05，圖2A）。相同施用水平條件下，亞硒酸鈉處理小白菜地上硒濃度顯著高于螯合硒處理（圖2A），表明亞硒酸鈉施用后對(duì)小白菜的生物可利用性更高。此外，外源施硒處理下小白菜根系硒濃度均顯著高于對(duì)照（圖2B）。相同施用水平條件下，亞硒酸鈉和螯合硒處理小白菜根系硒濃度無(wú)顯著差異（圖2B）。從整株角度來(lái)看，兩個(gè)水平亞硒酸鈉處理均顯著提升小白菜硒濃度，螯合硒處理則僅在施用水平達(dá)到6 mg/kg時(shí)才可顯著促進(jìn)小白菜硒富集（P＜ 0.05，圖2C）。杜振宇等[23]利用棕壤進(jìn)行的一項(xiàng)盆栽研究結(jié)果表明，當(dāng)亞硒酸鈉施用量為3 mg/kg和6 mg/kg時(shí)，整株小白菜硒平均濃度可分別達(dá)到4.34 mg/kg和8.02 mg/kg。而本試驗(yàn)中，3 mg/kg與6 mg/kg亞硒酸鈉施用處理整株小白菜平均硒濃度分別僅為0.40 ± 0.05 mg/kg與0.67 ± 0.15 mg/kg（圖2C）。造成如此差異的原因一方面可能與所采用土壤的理化性質(zhì)有關(guān)。如本研究所采用的石灰土有機(jī)碳含量（34.15 g/kg）遠(yuǎn)高于杜振宇等[23]所采用的棕壤（5.28 g/kg）。以往研究證實(shí)，土壤有機(jī)碳對(duì)硒具有較強(qiáng)的固定作用[28]，因而高量的土壤有機(jī)碳可導(dǎo)致硒的植物可利用性大幅降低。另一方面可能與不同小白菜品種之間本身對(duì)硒的富集能力存在巨大差異有關(guān)。如有前人研究發(fā)現(xiàn)，不同品種大豆之間的硒累積能力可相差達(dá)數(shù)十倍[29]。

本研究進(jìn)一步計(jì)算了生物富集系數(shù)（BCF，小白菜硒濃度與土壤硒濃度的比值）與轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF，小白菜地上部分硒濃度與根系硒濃度的比值）。BCF和TF可分別用來(lái)表征小白菜從土壤中吸收富集硒能力的強(qiáng)弱和硒從根系向地上部分遷移的能力[30-31]。如表1所示，亞硒酸鈉處理BCF地上部/土壤值要顯著高于螯合硒和對(duì)照處理。不同水平亞硒酸鈉處理之間BCF地上部/土壤值無(wú)顯著差異，這與Li等[31]的研究發(fā)現(xiàn)一致。本研究中小白菜硒轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）值平均在0.08～0.20之間，處于較低水平[30]，這表明亞硒酸鹽和螯合態(tài)硒被小白菜根系吸收后極易在根部固定以致向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)不足[32]。

表1 不同形態(tài)與水平硒添加處理的小白菜生物富集系數(shù)（BCF）與轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）Table1 The bioconcentration factors and translocation factors of pakchoi as affected by applying exogenous Se fertilizers with different forms and levels

2.3 土壤微生物生物量與群落結(jié)構(gòu)

如圖3所示，與對(duì)照相比，3 mg/kg亞硒酸鈉與3 mg/kg螯合硒兩個(gè)處理土壤總PLFA含量沒(méi)有顯著變化，而6 mg/kg亞硒酸鈉和6 mg/kg螯合硒兩個(gè)處理土壤總PLFA含量均顯著降低，降幅分別達(dá)到22%和16%（圖3A）。土壤細(xì)菌PLFA含量變化趨勢(shì)與總PLFA含量類(lèi)似，6 mg/kg亞硒酸鈉和6 mg/kg螯合硒兩個(gè)處理相比對(duì)照細(xì)菌PLFA含量降幅分別達(dá)到22%和17%（圖3B）。土壤真菌PLFA含量?jī)H在6 mg/kg亞硒酸鈉處理下有顯著下降，降幅達(dá)30%，而其余三個(gè)硒添加處理與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（圖3C），這表明高濃度亞硒酸鈉可對(duì)真菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。土壤放線菌PLFA含量在兩個(gè)水平亞硒酸鈉處理下均顯著低于對(duì)照，降幅分別為11%和19%，而螯合硒僅在6 mg/kg添加條件下顯著降低放線菌PLFA含量，降幅15%（圖3D）。土壤原生動(dòng)物PLFA含量?jī)H在6 mg/kg亞硒酸鈉處理下顯著低于對(duì)照，降幅高達(dá)36%，其余三個(gè)施硒處理與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（圖3E）。當(dāng)兩種形態(tài)硒施用量為3 mg/kg時(shí)，土壤綠藻PLFA含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，但在施用水平達(dá)到6 mg/kg時(shí)，土壤綠藻PLFA含量均顯著低于對(duì)照（圖3F）。

不同形態(tài)與水平外源硒施用下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成也發(fā)生一定變化（表2）。與對(duì)照相比，6 mg/kg螯合硒處理顯著降低細(xì)菌在微生物群落中的占比，而6 mg/kg亞硒酸鈉處理顯著降低綠藻在微生物群落中的占比。相比3 mg/kg亞硒酸鈉處理，6 mg/kg亞硒酸鈉處理顯著降低土壤真菌占比而提高放線菌占比。兩個(gè)不同水平的螯合硒添加處理之間土壤微生物群落組成則未見(jiàn)明顯差異。原生動(dòng)物在微生物群落中的占比在不同硒處理之間未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

表2 不同形態(tài)與水平硒添加處理下土壤微生物各類(lèi)群占比（%）Table 2 The effects of applying exogenous Se fertilizers with different forms and levels on the proportion of soil microbial groups

2.4 土壤酶活性

NAG酶和ALP酶是參與土壤關(guān)鍵養(yǎng)分氮和磷轉(zhuǎn)化的主要酶類(lèi)[33-34]。如圖4所示，與對(duì)照相比，兩個(gè)水平亞硒酸鈉施用對(duì)土壤NAG與ALP酶活性均未產(chǎn)生顯著影響。這與Nowak等[35]的結(jié)果相符合，其發(fā)現(xiàn)外源硒施用水平在3.95～39.5 mg/kg時(shí)，對(duì)土壤磷酸酶活性都沒(méi)有顯著影響。此外，吳雄平等[36]的盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，0～20 mg/kg亞硒酸鈉與硒酸鈉對(duì)小白菜土壤磷酸酶活性無(wú)顯著影響。另一方面，3 mg/kg螯合硒處理對(duì)土壤NAG、ALP酶活性也沒(méi)有顯著影響，而6 mg/kg螯合硒處理土壤NAG、ALP酶活性均有顯著增加（圖4），可見(jiàn)無(wú)機(jī)態(tài)硒和螯合態(tài)硒對(duì)土壤酶活性存在不同影響。與本研究結(jié)果類(lèi)似，史雅靜等[37]通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉添加量＜ 30 mg/kg時(shí)，土壤磷酸酶活性與對(duì)照相比沒(méi)有顯著變化；而施用有機(jī)態(tài)硒（硒代蛋氨酸）＜ 30 mg/kg時(shí)，對(duì)土壤磷酸酶有不同程度的激活作用。高量的螯合硒處理之所以顯著增加土壤NAG酶和ALP酶活性，可能是因?yàn)轵衔芤汉休^高濃度的游離氨基酸，在高量添加的情況下刺激土壤微生物分泌大量分解氨基酸的酶（即NAG酶）。微生物在氮供應(yīng)充足的情況下，對(duì)磷的需求也隨之增加，進(jìn)而大量分泌磷酸酶以便從土壤中獲取磷。

2.5 土壤生物活性與小白菜硒吸收的相互關(guān)系

如表3所示，小白菜根系硒濃度與土壤微生物群落總PLFA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05），具體到各土壤微生物群落，小白菜根系硒濃度與土壤細(xì)菌、放線菌、綠藻PLFA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.05）。小白菜地上硒濃度與土壤微生物各群落PLFA含量均無(wú)顯著相關(guān)性。這一方面可能與微生物與小白菜在硒吸收上形成直接競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)[38]。另一方面則可能是因?yàn)槲⑸锘顒?dòng)一定程度上促進(jìn)了硒揮發(fā)損失[39]，使得土壤中硒的有效性降低，進(jìn)而引起植物吸收減少。土壤NAG與ALP酶活性與小白菜硒濃度之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。

表3 土壤生物活性與小白菜硒濃度間的相關(guān)性Table 3 Correlationships between soil biological activities and selenium concentration in pakchoi.

3 討論

3.1 外源硒添加對(duì)小白菜硒富集的影響

植物對(duì)硒的吸收、運(yùn)移與代謝機(jī)制等方面的認(rèn)識(shí)迄今尚不完全明晰[32,40-42]。一般認(rèn)為，植物根系可以吸收利用的硒形態(tài)主要有硒酸鹽、亞硒酸鹽以及部分有機(jī)硒復(fù)合物，如硒代蛋氨酸（SeMet）等[30]。硒酸鹽主要是通過(guò)根系細(xì)胞膜中的硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)通道[43-44]，而亞硒酸鹽則更有可能是通過(guò)磷轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入到植物體內(nèi)[43]。亞硒酸鹽進(jìn)入根系細(xì)胞后，能夠迅速轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒并在根部累積；而硒酸鹽進(jìn)入根系細(xì)胞后，很少會(huì)被轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒而大多轉(zhuǎn)移到植物地上部分[27,45-46]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源施硒不同程度提高了小白菜植株硒濃度（圖2），這與以往的研究發(fā)現(xiàn)一致[6,47-48]。小白菜根系硒濃度總體上要高出其地上部分硒濃度一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，說(shuō)明小白菜從土壤中吸收的硒絕大部分被固定在根系而不是向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)《GH/T 1135-2017富硒農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》：蔬菜類(lèi)富硒食品的總硒含量應(yīng)在0.10～1.00 mg/kg之間，本研究4個(gè)外源硒添加處理下小白菜地上部分硒濃度在0.15～0.53 mg/kg范圍內(nèi)，達(dá)到富硒蔬菜標(biāo)準(zhǔn)。按照中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)疾控局在《中國(guó)居民膳食指南（2016）》中建議每天蔬菜食用不超過(guò)500 g，本研究中小白菜地上部分濃度最高0.53 mg/kg，折算日均硒攝入量為265 μg，處于我國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)在《WST578.3-2017中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量》中規(guī)定的40～400 μg/d安全閾值范圍內(nèi)，表明本研究所涉處理下生產(chǎn)的富硒小白菜不會(huì)造成硒攝入過(guò)量中毒風(fēng)險(xiǎn)。

本研究結(jié)果表明，亞硒酸鈉處理下小白菜硒富集效果要顯著優(yōu)于螯合硒處理（圖2），這可能是因?yàn)轵衔怯晌嘏c氨基酸螯合而成一種大分子物質(zhì)，其施入土壤后有效性不如亞硒酸鈉所致。通過(guò)對(duì)兩種不同形態(tài)硒肥處理土壤中可提取態(tài)有效硒含量進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)3 mg/kg與6 mg/kg螯合硒處理土壤中可提取態(tài)有效硒平均含量分別為0.16 mg/kg和0.49 mg/kg，而相應(yīng)亞硒酸鈉處理則分別達(dá)到0.68 mg/kg和0.82 mg/kg?？梢?jiàn)，亞硒酸鈉處理土壤中硒的生物有效性遠(yuǎn)大于螯合硒處理。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，不同形態(tài)的硒肥其施用量增加后對(duì)小白菜地上部分與根系硒富集的影響不一（圖2）。例如，高量亞硒酸鈉處理相比其低量處理明顯促進(jìn)地上部分硒累積，而對(duì)根部硒累積無(wú)顯著影響；高量螯合硒處理相比其低量處理則顯著促進(jìn)小白菜根部硒累積，而對(duì)地上部分硒累積無(wú)明顯影響?？梢?jiàn)，僅從提高小白菜可食部分硒濃度的角度來(lái)看，施用亞硒酸鈉效果要明顯優(yōu)于施用螯合硒。

3.2 外源硒添加對(duì)土壤微生物的影響

目前關(guān)于外源施硒對(duì)土壤微生物群落影響的認(rèn)識(shí)十分不足。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照，添加3 mg/kg 的亞硒酸鈉或螯合硒均未對(duì)土壤總PLFA含量造成顯著影響，而添加6 mg/kg亞硒酸鈉或螯合硒則都導(dǎo)致土壤總PLFA含量顯著降低（圖3A），說(shuō)明硒施用水平達(dá)到6 mg/kg時(shí)可對(duì)土壤微生物群落生長(zhǎng)造成顯著抑制作用，這與前人的研究認(rèn)識(shí)具有一致性[19-20]。此外，不同微生物類(lèi)群對(duì)外源硒的敏感性也存在差異。本研究中，土壤細(xì)菌PLFA含量在3 mg/kg硒施用水平時(shí)響應(yīng)不明顯，而在6 mg/kg硒施用水平時(shí)則顯著降低（圖3B），說(shuō)明外源硒對(duì)細(xì)菌的影響更取決于用量水平，而非形態(tài)；土壤真菌PLFA含量在6 mg/kg螯合硒處理下與對(duì)照差異不明顯，而在6 mg/kg亞硒酸鈉處理下則顯著下降（圖3C），說(shuō)明真菌對(duì)高濃度螯合硒的耐受能力要強(qiáng)于其對(duì)高濃度亞硒酸鈉的耐受能力；此外，土壤放線菌PLFA含量在亞硒酸鈉3 mg/kg水平施用時(shí)即顯著降低，而螯合硒處理僅在施用水平達(dá)到6 mg/kg時(shí)才有明顯減少（圖3D），說(shuō)明土壤放線菌群落對(duì)亞硒酸鈉比螯合態(tài)硒敏感性高。然而，雖然本研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落對(duì)不同形態(tài)與水平外源硒施用存在差異化響應(yīng)，但對(duì)這種差異形成的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的探討。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，外源施硒對(duì)小白菜生物量、硒富集以及土壤微生物群落和酶活性的影響與硒形態(tài)和用量密切相關(guān)。

1）與不施硒相比，施硒處理均顯著促進(jìn)小白菜植株硒富集。其中，施用亞硒酸鈉對(duì)小白菜可食用部分硒富集的促進(jìn)效果優(yōu)于施用螯合硒。

2）土壤微生物群落對(duì)外源施硒的響應(yīng)主要由施用水平?jīng)Q定，而不是形態(tài)。高量的外源硒肥施用通常會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生抑制作用。未來(lái)可進(jìn)一步研究以明確土壤微生物對(duì)不同形態(tài)硒的響應(yīng)閾值。

3）亞硒酸鈉施用，無(wú)論是3 mg/kg還是6 mg/kg 水平，對(duì)土壤NAG、ALP酶活性均未觀察到顯著影響。螯合硒在3 mg/kg水平施用時(shí)對(duì)土壤NAG、ALP酶活性無(wú)顯著影響，而在6 mg/kg水平施用時(shí)顯著刺激土壤NAG、ALP酶活性?？梢?jiàn)，高水平的螯合硒施用會(huì)對(duì)土壤生物活性造成深刻影響，進(jìn)而潛在影響其他養(yǎng)分元素如氮磷等的循環(huán)，應(yīng)予以重視。