轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析高爾基體蛋白73參與調(diào)控肝癌的作用機(jī)制

葉佩靈， 嘉紅云， 彭 亮

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 廣州 510260； 2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 廣州 510700

在我國(guó)，肝癌是僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤，中國(guó)占全球發(fā)病人數(shù)的47%[1]。肝癌的發(fā)病原因尚未明確，以發(fā)展快、療效差和復(fù)發(fā)率高為特征，極易發(fā)生肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，5年生存率不足30%。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)高爾基體磷蛋白2/高爾基體蛋白73(golgi phosphoprotein 2，GOLPH2/GP73)的高表達(dá)與肝臟疾病有一定的關(guān)系[2-3]，尤其與原發(fā)性肝癌關(guān)系密切，人們逐漸認(rèn)識(shí)到GP73有可能成為肝癌早期診斷的標(biāo)志物[4-5]，血清GP73可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者肝切除術(shù)后的預(yù)后[6]。研究[7]還發(fā)現(xiàn)，有效干擾GP73基因表達(dá)后，可明顯抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，GP73的表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。目前關(guān)于GP73通過(guò)何種信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)生發(fā)展的研究較少，為進(jìn)一步闡明GP73對(duì)肝癌的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立了干擾和過(guò)表達(dá)GP73的Hep3B肝癌細(xì)胞模型，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)不同GP73表達(dá)量的肝癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)譜的差異，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在篩選出GP73參與調(diào)控肝癌相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)而為肝癌發(fā)病機(jī)制的探索提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 Hep3B細(xì)胞株購(gòu)于廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司；GP73、GAPDH一抗購(gòu)于Proteintech公司；PI3K、p-AKT和AKT抗體購(gòu)于CST公司；pcDNA3.1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒由安徽通用生物科技有限公司提供；干擾片段引物設(shè)計(jì)、合成和測(cè)序由吉瑪生物公司完成；文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(NGS00-2013，中國(guó)依科賽)；Trizol(TR118-500，MRC)；qRT-PCR試劑盒(Q341-03，Vazyme)，GP73、內(nèi)參GAPDH引物、實(shí)時(shí)定量PCR引物由捷瑞生物公司合成。PCR儀(StepOne Plus，美國(guó)ABI公司)；Illumina 測(cè)序平臺(tái)(HiSeqTM2000)；生物分析儀(Agilent2100，中國(guó)Agilent公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 肝癌細(xì)胞Hep3B分為4組進(jìn)行培養(yǎng)，分別是GP73干擾組:Hep3B+si-GP73；干擾對(duì)照組:Hep3B+siRNA NC；GP73過(guò)表達(dá)組:Hep3B+pcDNA3.1-GP73；過(guò)表達(dá)對(duì)照組:Hep3B+pcDNA3.1。

1.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 細(xì)胞消化后，接種至6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。把轉(zhuǎn)染試劑分別與干擾片段siRNA-GP73、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-GP73混勻，形成DNA脂復(fù)合物，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，干擾片段和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總RNA, 進(jìn)行cDNA 逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR和Western Blot驗(yàn)證GP73mRNA的量，干擾組和過(guò)表達(dá)組GP73 mRNA的量與對(duì)照組比較有顯著差異，轉(zhuǎn)染成功。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 120 s熱變性；變性95 ℃ 15 s、退火延伸60 ℃ 30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；溶解曲線60～95 ℃。GP73、內(nèi)參GAPDH引物由捷瑞生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.4 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析由永諾生物科技有限公司完成。從樣本中提取總RNA，以磁珠富集真核生物mRNA；mRNA經(jīng)打斷后以隨機(jī)引物

合成一鏈cDNA，再合成二鏈cDNA。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)末端修復(fù)，再連接接頭。以磁珠對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇并進(jìn)行PCR擴(kuò)增純化回收。cDNA文庫(kù)經(jīng)Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)，qPCR定量后以Illumina HiSeqTM2000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理和功能富集分析 測(cè)序所得的數(shù)據(jù)，根據(jù)篩選條件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)從不同組別中篩選差異表達(dá)的mRNA，得到受GP73調(diào)控的基因。應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，GO分析通過(guò)與Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)比較，得到顯著富集的GO條目，從而推斷GP73參與的生物學(xué)功能。KEGG分析通過(guò)與全基因組比較，獲得受GP73調(diào)控的信號(hào)通路。

1.6 Western Blot驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果 采用Western Blot驗(yàn)證不同組別GP73和信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的變化。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜2次，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1～2 h，TBST洗膜3次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。使用圖像處理軟件Image J分析目標(biāo)條帶的光密度值。以GAPDH作為內(nèi)參照，對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同實(shí)驗(yàn)組間進(jìn)行差異分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料2組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估 為保證信息分析質(zhì)量，對(duì)Hep3B4組細(xì)胞的cDNA文庫(kù)基因測(cè)序得到原始序列(Raw Reads，總計(jì)18.3×107個(gè))，經(jīng)過(guò)濾和質(zhì)控，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean Reads，18.0×107個(gè)，占原始序列的98.36%)。4組樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)差異較小，堿基質(zhì)量值大于20和30的堿基占總體堿基比例分別為Q20≥97.54%，Q30≥93.26%，表明測(cè)序結(jié)果較好。

2.2 根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因 cDNA文庫(kù)測(cè)序分析顯示GP73干擾組、過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組測(cè)到的共同基因有15 147個(gè)(圖1)。運(yùn)用軟件SOAP根據(jù)篩選條件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)對(duì) mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示：干擾GP73后，差異表達(dá)基因一共有1508個(gè)，其中表達(dá)升高的有327個(gè)，表達(dá)下降的有1181個(gè)；過(guò)表達(dá)GP73后，差異表達(dá)基因一共有731個(gè)，其中表達(dá)升高的有361個(gè)，表達(dá)下降的有370個(gè)(圖2、3)。在GP73干擾組和過(guò)表達(dá)組相同的差異表達(dá)基因一共有60個(gè)，在干擾組中表達(dá)下降以及在過(guò)表達(dá)組中表達(dá)升高的有46個(gè)；在干擾組中表達(dá)升高以及在過(guò)表達(dá)組中表達(dá)下降的有14個(gè)(圖4)。

圖1 干擾和過(guò)表達(dá)GP73后4個(gè)組的差異表達(dá)基因交叉分布情況

圖2 干擾和過(guò)表達(dá)GP73后干擾組與過(guò)表達(dá)組差異表達(dá)

注：橫坐標(biāo)表示對(duì)照組樣品基因表達(dá)量(取對(duì)數(shù))，縱坐標(biāo)表示實(shí)驗(yàn)組樣品基因表達(dá)量(取對(duì)數(shù))。實(shí)驗(yàn)組樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品，紅點(diǎn)表示基因表達(dá)量上調(diào)的基因，綠點(diǎn)表示基因表達(dá)量下調(diào)的基因，藍(lán)點(diǎn)表示基因表達(dá)量沒(méi)有顯著變化的基因。

圖4 干擾和過(guò)表達(dá)GP73后共同差異表達(dá)基因的熱圖

2.3 差異表達(dá)基因mRNA功能分析和通路預(yù)測(cè)

2.3.1 GO功能富集分析 GO功能分析描述基因的3個(gè)部分：分子功能、細(xì)胞位置、生物過(guò)程。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)篩選滿足條件的差異表達(dá)基因與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，顯著富集的 GO條目一共有586條(P<0.05)，其中生物過(guò)程429條、分子功能88條、細(xì)胞位置69條。生物過(guò)程顯著差異的前10個(gè)條目分別是：細(xì)胞過(guò)程、單個(gè)組織的過(guò)程、生物調(diào)節(jié)等條目(圖5)，提示GP73可能通過(guò)這些生物學(xué)功能參與調(diào)控肝癌。

圖5 差異表達(dá)mRNA排名前10位的GO分析富集條目

2.3.2 KEGG富集分析 將差異表達(dá)基因和全基因組進(jìn)行比對(duì)，使用超幾何檢驗(yàn)，獲得Hep3B干擾GP73和過(guò)表達(dá)GP73后差異表達(dá)基因顯著富集的代謝通路。KEGG富集分析顯示：在干擾組，266條信號(hào)通路被顯著富集；在過(guò)表達(dá)組，227條信號(hào)通路被顯著富集。在排名前17位的信號(hào)通路中有4個(gè)與肝癌密切相關(guān)，包括PI3K-AKT、細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體相互作用、TNF、JAK-STAT信號(hào)通路(圖6)。結(jié)果提示GP73可能通過(guò)這些信號(hào)通路參與肝癌的調(diào)控。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了既往報(bào)道與肝癌相關(guān)的其他重要通路，例如Rap1、NF-κB等信號(hào)通路。

2.4 Western Blot驗(yàn)證PI3K-AKT信號(hào)通路 隨機(jī)選取KEGG分析排名前10位的與肝癌密切相關(guān)的PI3K-AKT信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)Western Blot檢測(cè)PI3K-AKT的3個(gè)蛋白PI3K、p-AKT和AKT的表達(dá)，比較干擾和過(guò)表達(dá)GP73后3個(gè)蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果顯示，干擾組蛋白PI3K、p-AKT表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)；過(guò)表達(dá)組蛋白PI3K、p-AKT表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)(圖7)。Western Blot結(jié)果證實(shí)了KEGG分析對(duì)信號(hào)通路的預(yù)測(cè)，GP73可能是通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路的相關(guān)信號(hào)分子PI3K、p-AKT蛋白參與肝癌的調(diào)控過(guò)程。

3 討論

肝癌以病情進(jìn)展快、療效差和復(fù)發(fā)率高為特征，發(fā)病機(jī)制和病因尚不明確。尋找新的藥物治療靶點(diǎn)，成為研究的動(dòng)力和方向。GP73是Kladney等[7]在2000年發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型高爾基體膜蛋白，是定位于高爾基體順面膜囊上的磷酸化跨膜蛋白。GP73在健康人肝細(xì)胞中很少表達(dá)，主要表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞的多項(xiàng)病理及生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。作者過(guò)往研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，GP73在肝癌患者的血清和肝組織中表達(dá)異常升高。也有研究[11]發(fā)現(xiàn)，GP73可通過(guò)上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的侵襲性。另外，GP73在轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中也有異常表達(dá)，有可能成為肝癌轉(zhuǎn)移治療的一個(gè)新的分子靶點(diǎn)[12]。目前，GP73如何參與肝癌發(fā)病過(guò)程的具體機(jī)制尚不明確，值得去探究。

注：縱坐標(biāo)表示KEGG分析的條目，橫坐標(biāo)表示顯著差異表達(dá)基因的比例，點(diǎn)的大小表示顯著差異表達(dá)基因的數(shù)目，點(diǎn)的顏色代表顯著性，表示不同的P值(0～1)。

注：*,P<0.05。

本文借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為揭示GP73對(duì)肝癌的作用機(jī)制以及作為治療肝癌的作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究。在本研究中，對(duì)肝癌細(xì)胞株Hep3B進(jìn)行干擾和過(guò)表達(dá)GP73的處理，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到18.3×107個(gè)原始序列，分析顯示4組樣本共同檢測(cè)到的基因有15 147個(gè)，根據(jù)篩選條件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)，對(duì)4組樣本的mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示：干擾GP73后，差異表達(dá)基因一共有1508個(gè)，過(guò)表達(dá)GP73后，差異表達(dá)基因一共有731個(gè)，在干擾組和過(guò)表達(dá)組相同的差異表達(dá)基因一共有60個(gè)，其中在干擾組中表達(dá)下降以及在過(guò)表達(dá)組中表達(dá)升高的有46個(gè)；在干擾組中表達(dá)升高以及在過(guò)表達(dá)組中表達(dá)下降的有14個(gè)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析顯示：顯著富集的GO條目有586條，其中生物過(guò)程429條、分子功能88條、細(xì)胞位置69條。生物過(guò)程顯著差異的前10個(gè)條目分別是：細(xì)胞過(guò)程、單個(gè)組織的過(guò)程、生物調(diào)節(jié)等條目，提示GP73可能通過(guò)參與這些生物學(xué)功能調(diào)控肝癌的發(fā)病過(guò)程。KEGG富集分析顯示：在干擾組，266條信號(hào)通路被顯著富集，在過(guò)表達(dá)組，227條信號(hào)通路被顯著富集。其中，在排名前17位的信號(hào)通路中有4個(gè)與肝癌密切相關(guān)，包括PI3K-AKT、細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體相互作用、TNF、JAK-STAT信號(hào)通路，提示GP73可能通過(guò)這些潛在的信號(hào)通路參與肝癌的調(diào)控。隨機(jī)選取KEGG分析排名前10位的與肝癌密切相關(guān)的PI3K-AKT信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)Western Blot檢測(cè)PI3K-AKT的3個(gè)關(guān)鍵蛋白PI3K、p-AKT和AKT的表達(dá)。結(jié)果顯示，干擾組PI3K、p-AKT的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)；過(guò)表達(dá)組PI3K、p-AKT的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)。Western Blot結(jié)果證實(shí)了KEGG分析對(duì)信號(hào)通路的預(yù)測(cè)，GP73可能是通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路的相關(guān)信號(hào)分子PI3K、p-AKT蛋白參與肝癌的調(diào)控過(guò)程。

綜上所述，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)GP73對(duì)肝癌發(fā)展的調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)PI3K-AKT、細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體相互作用、TNF、JAK-STAT等信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，提示GP73有可能成為肝癌治療的新的分子靶點(diǎn)，筆者后續(xù)將繼續(xù)在更多肝癌細(xì)胞系深入研究，驗(yàn)證其作用機(jī)制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：葉佩靈負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；嘉紅云、彭亮負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),指導(dǎo)文章撰寫。