S-烯丙基-L-半胱氨酸減弱LPS誘導(dǎo)的肺纖維化

熊越，張暉，周艷君

（江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

0 引言

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種以刺激性干咳和進(jìn)行性呼吸困難為突出表現(xiàn)的慢性疾病，患者生存期較短，預(yù)后差，由于其發(fā)病機(jī)制不清，治療方法十分有限[1]。2014年研制出了針對(duì)IPF治療的兩種新藥，即吡非尼酮和尼達(dá)尼布[2]，但鑒于其不良反應(yīng)及費(fèi)用，一般推薦輕、中度患者使用，且治療效果有限，所以探討其他候選改善肺纖維化的藥物意義重大。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）是一種從大蒜中提取的單體化合物，已有研究表明SAC具有抗氧化、抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡的活性[3]，并且可降低海馬中乙酰膽堿酯酶的活性，下調(diào)NF-κB、白細(xì)胞介素-1β等的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[4]，但是否具有抗纖維化活性還未明確，本文旨在研究SAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化及炎癥的影響，從而為IPF的治療提供新策略。

1 材料和方法

1.1 試劑

S-烯丙基-L-半胱氨酸（CHNOS,CAS 21593-77-1,純度>99%）購(gòu)自Target Molecule公司（中國(guó)上海）,脂多糖購(gòu)自sigma。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠購(gòu)自南京模型動(dòng)物研究中心，在江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)別條件下飼養(yǎng)，小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程得到了江南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 LPS誘導(dǎo)肺纖維化

小鼠隨機(jī)分為三組，分別為對(duì)照組、LPS組、LPS+SAC組（5mg/kg）,將LPS溶于生理鹽水中，SAC溶于水、乙醇和聚氧乙烯氫化蓖麻油的比例為8：1:1的溶劑中，小鼠麻醉后氣管注射生理鹽水或者LPS(5mg/kg)，24h后腹腔內(nèi)注射SAC(5mg/kg),于LPS給藥后第7收集肺泡灌洗液及肺組織標(biāo)本，以便進(jìn)行后續(xù)的灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白濃度測(cè)定及定量RT-PCR等。

1.4 蘇木素-伊紅（HE）染色

用4%多聚甲醛固定LPS或生理鹽水氣管給藥后第21天收集的肺組織，再經(jīng)過(guò)脫水、浸蠟、包埋、切片（4mm），貼片、脫蠟后，進(jìn)行HE染色，染色完成后封片，于顯微鏡下觀察，評(píng)估肺損傷程度。

1.5 支氣管肺泡灌洗液

進(jìn)行肺組織取材時(shí)，在心尖取血后，用1mLPBS（pH=7.4）洗肺2次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），500g離心5min，使用紅細(xì)胞裂解液裂解灌洗液中的紅細(xì)胞，使用PBS清洗兩次后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

1.6 RNA提取和定量PCR

使用TRlzol試劑從保存于-80℃條件下的肺組織中提取RNA，再使用ReverTra Ace qPCR RT 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，然后進(jìn)行定量 PCR，檢測(cè) iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12p35表達(dá)水平。

1.7 體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)

培 養(yǎng) Raw264.7細(xì) 胞，按 DMSO、DMSO+LPS、DMSO+10μM+LPS、DMSO+30μM+LPS、DMSO+50μM+LPS 分組進(jìn)行給藥刺激，收集細(xì)胞樣本后進(jìn)行RNA提取和定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè) iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12p35表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±SEM表示，采用Graph Prism8.0進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，單個(gè)比較的所有統(tǒng)計(jì)分析均通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAC可以改善LPS誘導(dǎo)的肺纖維化

為了研究SAC對(duì)肺纖維化的影響，我們建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，取材后對(duì)肺組織切片進(jìn)行HE染色，鏡下觀察結(jié)果顯示LPS組表現(xiàn)出明顯的纖維化和大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺損傷程度高。與LPS組相比，LPS+SAC組結(jié)果顯示SAC顯著降低了纖維化及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度（圖1）。

圖1 HE染色

2.2 SAC可減輕LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥

SAC具有較高的抗炎活性，而肺纖維化進(jìn)展中往往伴隨著炎癥的發(fā)生，為研究SAC能否減輕肺纖維化伴隨的炎癥，我們還進(jìn)行了BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白濃度測(cè)定。HE染色結(jié)果顯示經(jīng)腹腔注射SAC的小鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少（圖1），此外，BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白分析結(jié)果顯示，與LPS組相比，經(jīng)SAC處理的小鼠BALF總細(xì)胞減少，蛋白濃度下降（圖2和圖3），綜上說(shuō)明SAC可減輕LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥。

圖2

圖3

2.3 SAC可降低LPS誘導(dǎo)的肺纖維化相關(guān)炎癥因子表達(dá)

為研究SAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥因子表達(dá)是否有影響，我們通過(guò)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了肺組織炎癥因子的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示與LPS 組相比，SAC組的iNOS、TNF-α、IL-6、IL-12p35等相關(guān)炎癥因子的mRNA表達(dá)水平明顯降低（圖4A-D）。另外，體外刺激Raw264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，與LPS組相比，SAC可降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)（圖5A-D）。

圖4

圖5

3 討論

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是臨床上較常見的疾病，該疾病往往導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性喪失[5]，會(huì)嚴(yán)重影響人體呼吸功能，死亡率高，生存期短[6]。但其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，發(fā)病原因至今未明，因此臨床上有效的藥物也很少，同時(shí)氧療、機(jī)械通氣等非治療手段效果亦不佳[7]，肺移植不能適用于所有患者，所以尋找能夠改善、治療IPF的新型藥物具有重要的臨床意義。

S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）是大蒜素的主要成分之一，它所具有的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性已經(jīng)得到了廣泛的研究，其在肝臟和心血管疾病方面也被證實(shí)有較好的預(yù)防與治療效用[8]。但在其是否具有抗纖維化活性方面的研究還比較少，如果能證明SAC在抗纖維化方面有一定作用，將為特發(fā)性肺纖維化的治療帶來(lái)新思路。

脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌內(nèi)毒素的主要成分[9]，也是肺纖維化的重要致病因素，LPS誘導(dǎo)肺纖維化的關(guān)鍵是促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化與異常增殖[10]。肺成纖維細(xì)胞表面有一種由糖磷脂酰肌醇（GPI）錨定的糖蛋白，即胸腺細(xì)胞分化抗原-1（Thy-1）[11]，肺纖維化組織中大量的成纖維細(xì)胞表面Thy-1表達(dá)減少[Thy-1（-）]，已有研究表明[Thy-1（-）]的成纖維細(xì)胞有較強(qiáng)活化增殖能力，其在各種炎癥因子如iNOS、IL-6等的刺激下表現(xiàn)出更強(qiáng)的反應(yīng)能力[12]。

我們構(gòu)造了LPS誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、LPS+SAC組，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們可以看到LPS組中，小鼠肺泡內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，加重肺損傷程度，肺組織的iNOS、IL-6、TNF-α和IL-12p35mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，而LPS+SAC組中，SAC處理使得炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，降低了纖維化因子的表達(dá)，從而降低了肺成纖維細(xì)胞的活化增殖能力，減輕了LPS誘導(dǎo)的纖維化和炎癥增強(qiáng)狀態(tài)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)SAC可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的肺纖維化和炎癥，同時(shí)降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá),我們的研究證明了SAC有潛在的抗纖維化及抗炎作用，這為IPF治療提供了一個(gè)有效的依據(jù)。