大別山野菊花揮發(fā)油的成分及抗菌活性

余科義，薄新黨，王文輝

河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院（鄭州 450042）

野菊（Chrysanthemum indicumL.）是菊科多年生草本植物，常生長(zhǎng)在原野、田邊，在中國(guó)的東北部及西南地區(qū)最為常見(jiàn)，資源豐富。野菊花是野菊的球形頭狀花序，呈棕黃色，其性味苦辛，微寒，具有疏風(fēng)散熱、瀉火平肝、清熱解毒的功效[1]，可用作中藥、清涼飲品、藥枕等，夏桑菊顆粒、感冒靈顆粒等復(fù)方藥物中均含有野菊花成分。野菊花含有黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、甾醇類(lèi)、蒽醌類(lèi)等多種化學(xué)成分[2-7]，其中黃酮類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)和萜類(lèi)含量較高，也是起藥效作用的主要成分。野菊花的提取物還具有抑菌[8-9]、消炎鎮(zhèn)痛[10-11]、解毒[12]、抗氧化[13-15]、抗腫瘤[16-17]等多種生物活性。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中野菊花可以用于預(yù)防治療感冒，治療肝炎、高血壓、高血脂、濕疹、呼吸道感染等癥狀[18-20]。野菊花揮發(fā)油通常采用水蒸氣蒸餾法提取，提取率在2.0%左右[21]，有160余種化合物從揮發(fā)油中分離出來(lái)[22]，以倍半萜類(lèi)、單萜類(lèi)及其含氧衍生物為主要成分[23-24]。α-姜黃素、β-半水芹烯和樟腦是中國(guó)產(chǎn)野菊花揮發(fā)油的主要成分[25]，菊酮、1,8-桉油醇和α-蒎烯是韓國(guó)產(chǎn)野菊花的主要成分[23]。國(guó)產(chǎn)野菊花因產(chǎn)地不同，主要成分和含量也有所不同，活性也存在一定差別。試驗(yàn)對(duì)大別山地區(qū)產(chǎn)野菊花的揮發(fā)油開(kāi)展研究，并初步探究其對(duì)4種常見(jiàn)致病菌的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

野菊花采（摘自河南省信陽(yáng)市大別山山區(qū)，為野菊的頭狀花序）。

吐溫-80（食品級(jí)）；瓊脂（食品級(jí)）；阿莫西林（分析純）；其余試劑為化學(xué)純。

1.2 菌株

菌種（菌種批號(hào)20190918，分別為大腸埃希菌（Escherichia coli），菌種編號(hào)CMCC（B）44102，青島日水生物技術(shù)有限公司）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，菌種編號(hào)CMCC（B）26003）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，菌種編號(hào)CMCC（B）10104）；糞腸球菌（Enterococcus faecalis，菌種編號(hào)CMCC（B）29212）。

1.3 儀器與設(shè)備

QP-2010PLUS型島津氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津儀器設(shè)備有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；CS-700型超帥高速多功能粉碎機(jī)（武義海納電器有限公司）；KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HT-350B型恒溫培養(yǎng)箱（常州市金城春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）；XFS-280A型壓力蒸汽滅菌鍋（紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)（河南貝亞生物科技有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（鄭州鑫爾瑞化驗(yàn)用品有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 野菊花揮發(fā)油的提取

利用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取野菊花的揮發(fā)油。將干燥的野菊花用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)0.300 mm孔徑篩，稱(chēng)取40 g粉末，按固液比1∶8（g/mL）的比例加入一定量的去離子水于500 mL單頸燒瓶中，封口，充分浸泡16 h，在100 W功率下超聲破碎處理30 min，將燒瓶放入120 ℃恒溫油浴鍋中，在磁子攪拌下蒸餾提取8 h。停止加熱，自然冷卻一段時(shí)間，收集揮發(fā)油，加入少量無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，將干燥后的揮發(fā)油用移液管轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的錐形瓶中，貼上標(biāo)簽，用保鮮膜封口，置于4 ℃冷藏室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 野菊花揮發(fā)油成分GC-MS分析

1.4.2.1 氣相色譜（GC）條件

色譜柱RXI-SiL-MS（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣采用高純氦氣（99.999%），進(jìn)樣口溫度250 ℃，載流量2 mL/min，分流比2∶1，進(jìn)樣量1 μL。

1.4.2.2 程序升溫

升溫程序：柱溫45 ℃，保持1 min，以3 ℃/min速率升溫至120 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持10 min。

1.4.2.3 質(zhì)譜（MS）條件

電子轟擊EI為電離源，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為m/z35～500，間隔0.2 s。

1.4.3 野菊花揮發(fā)油抗菌活性檢測(cè)

1.4.3.1 培養(yǎng)基的制備

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入吐溫-80，制成含1%吐溫-80的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，于121 ℃滅菌30 min，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3.2 固體平板的制備

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入凝固劑瓊脂（瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%），制成固體培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中制成平板，冷卻至常溫，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3.3 菌懸液的制備

將菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，于37±1 ℃培養(yǎng)18～24 h，取出后加入無(wú)菌生理鹽水，用接種環(huán)刮下菌苔，制成菌懸液，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3.4 野菊花揮發(fā)油乳濁液的配制

將野菊花揮發(fā)油用含1%吐溫-80的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基溶解，制成質(zhì)量濃度32 mg/mL的待檢樣品溶液，滅菌后于4 ℃冷藏，作為待測(cè)樣品備用。

1.4.3.5 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用連續(xù)稀釋法測(cè)試野菊花揮發(fā)油的抑菌效果。取11支無(wú)菌試管（20 mm×300 mm），編號(hào)分別為1～8、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。1～8號(hào)管分別加入4 mL肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，取4 mL的待檢樣品加入1號(hào)管中，混勻后從中取出4 mL加入2號(hào)管中，混勻后從中取出4 mL加入3號(hào)管中，以此類(lèi)推稀釋至8號(hào)管，從8號(hào)管取出4 mL溶液。1～8號(hào)管中都是4 mL待檢樣品溶液，濃度依次為C0×（1/21），C0×（1/22），…，C0×（1/28）（C0=16 mg/mL），用無(wú)菌微量移液器分別移取0.1 mL菌懸液于1～8號(hào)管中。用液體培養(yǎng)基配制4 mL 0.85 mg/mL阿莫西林（AM）溶液，加入0.1 mL菌懸液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。以加有0.1 mL菌懸液的4 mL培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組。以4 mL培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。將11支試管共同放入37±1 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，根據(jù)文獻(xiàn)[26]報(bào)道的方法，肉眼觀察濁度以確定樣品的抑菌效果，MIC值是不顯示濁度的藥液濃度。開(kāi)展4次平行試驗(yàn)，取平均值。試驗(yàn)過(guò)程如表1所示。

表1 野菊花揮發(fā)油抑菌試驗(yàn)測(cè)定過(guò)程

1.4.3.6 最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

根據(jù)MIC的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)有抑制作用的菌組采用平板涂布法進(jìn)行MBC的測(cè)定。采取上述1.4.3.5相同的方法，用培養(yǎng)基配制6組4 mL不同濃度的待測(cè)樣品溶液（編號(hào)為Ⅰ～Ⅵ），加入0.1 mL菌懸液（有抑菌效果的菌組）進(jìn)行固體平板涂布培養(yǎng)。以涂布有0.1 mL菌懸液的4 mL培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照組，以4 mL培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。上述試驗(yàn)樣品共同放入37±1 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀測(cè)菌落生長(zhǎng)情況，以沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最低藥液濃度為MBC值。做4次平行試驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 野菊花揮發(fā)油成分分析結(jié)果

按照1.4.1的方法提取的野菊花揮發(fā)油呈淡黃色液體，具有菊花芳香氣味。做5次平行試驗(yàn)，揮發(fā)油提取率相對(duì)穩(wěn)定，為0.4110%±0.005%（W/W）。通過(guò)GC-MS聯(lián)用技術(shù)獲得總離子流圖（見(jiàn)圖1），經(jīng)質(zhì)譜掃描后獲得各峰的質(zhì)譜圖，通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)NIST08中數(shù)據(jù)匹配檢索，并結(jié)合保留指數(shù)和文獻(xiàn)報(bào)道共同進(jìn)行定性分析，共鑒定出化合物48種，按峰面積歸一化法計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 野菊花揮發(fā)油總離子流

由表2可知，在鑒定出的48個(gè)化合物中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的3種物質(zhì)分別是順式馬鞭草烯醇（15.81%）、廣藿香烷（11.55%）和十烷酮（10.21%），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于10%，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的37.57%。此外，2,6,6-三甲基-3-（2-丙烯基）二環(huán)[3,1,1]庚烷、4-亞甲基-1-甲基-2-（2-甲基-1-丙烯基）-1-乙烯基環(huán)庚烷、氧化石竹烯、9-十八碳烯-12-炔酸甲酯、1,5-二甲基-3-羥基-8-（1-亞甲基-2-羥乙基）二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯、（E）-β-金合歡烯等成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%以上。

表2 野菊花揮發(fā)油化學(xué)成分

2.2 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

采用連續(xù)稀釋法測(cè)試野菊花揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌的抑菌效果，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 野菊花揮發(fā)油抑菌試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，野菊花揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)糞腸球菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，MIC分別為1 mg/mL和4 mg/mL。但對(duì)大腸埃希菌和銅綠假單胞菌沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有抑制活性。

2.3 殺菌活性試驗(yàn)結(jié)果

因?yàn)橐熬栈〒]發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌有抑制作用，用固體平板涂布法測(cè)定野菊花揮發(fā)油對(duì)這2種菌組的最低殺菌濃度（MBC），試驗(yàn)方法見(jiàn)1.4.3.6，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

分析表4的結(jié)果可以得出，野菊花揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌最低殺菌濃度（MBC）分別為2 mg/mL和6 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的殺菌活性。試驗(yàn)測(cè)得的大別山野菊花揮發(fā)油抑制金黃葡萄球菌的活性高于鐘靈允等[8]測(cè)得成都地區(qū)野菊花揮發(fā)油的活性（MIC值為2 mg/mL，MBC值為2.5 mg/mL）。

表4 野菊花揮發(fā)油殺菌試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

野菊花是傳統(tǒng)中草藥，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱、散瘀、明目和降血壓之功效，可作飲品，還可以用于牙膏、藥皂等日用品，是藥食兩用植物。試驗(yàn)以大別山地區(qū)產(chǎn)野菊花為研究對(duì)象，采用超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取野菊花揮發(fā)油，在固液比1∶8（g/mL）、功率100 W、超聲時(shí)間30 min、蒸餾溫度130℃、蒸餾時(shí)間8 h條件下，野菊花揮發(fā)油的提取率為0.4110%±0.005%（W/W）。利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)鑒定出野菊花揮發(fā)油的48種化學(xué)成分，主要為萜類(lèi)、脂肪族類(lèi)化合物和萜類(lèi)衍生物，其中，順式馬鞭草烯醇（cis-verbenol）、廣藿香烷（patchoulane）和十烷酮（1-decalone）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（＞10%）?？咕顪y(cè)定結(jié)果表明，野菊花揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，其MIC和MBC別為1 mg/mL和2 mg/mL，對(duì)糞腸球菌有一定的抑制作用，其MIC和MBC別為4 mg/mL和6 mg/mL，但對(duì)大腸埃希菌和銅綠假單胞菌沒(méi)有抑制活性。野菊花揮發(fā)油的抗菌活性可能是其主要成分（馬鞭草烯醇、廣藿香烷和十烷酮）發(fā)揮作用，但需要進(jìn)一步研究確定。揮發(fā)油是野菊花重要的藥效組分，其抗菌活性展現(xiàn)出其在醫(yī)藥領(lǐng)域的重要應(yīng)用地位，具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。